細胞遷移和侵襲實驗技術(shù).ppt

腫瘤細胞運動實驗技術(shù) 腫瘤細胞生物學(xué)實驗室張寧PI組 腫瘤細胞運動常用研究方法 Textinhere 侵襲實驗 趨化運動 實驗原理細胞劃痕法是測定了腫瘤細胞的運動特性的方法之一 在體外培養(yǎng)的單層細胞上 劃痕致傷 然后在加入藥物等實驗條件下觀察其對腫瘤細胞遷移的影響 劃痕實驗 傷口愈合實驗 ScratchAssay 操作步驟 1 先用marker筆在6孔板背后 用直尺比著 均勻的劃橫線 大約每隔0 5 1cm一道 橫穿過孔 每孔至少穿過3條線 操作步驟 2 在孔中加入約5 105個細胞 具體數(shù)量因細胞種類不同而不同 接種原則為過夜后融合率達到100 3 用10mltip槍頭用力均勻地在培養(yǎng)皿中劃痕 PBS洗滌2次 去除劃下的細胞 加入無血清培養(yǎng)基 操作步驟 4 放入37 5 CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng) 每3h測量一次細胞運動的距離 拍照 具體時間依實驗需要而定 操作步驟 5 數(shù)據(jù)處理 每個時間點的距離長度 0時距離 每個時間長度細胞整體遷移的距離 求出均數(shù)和標準差 時間為橫軸 遷移距離為縱軸 單位mm 作圖 并比較初始0時與實驗結(jié)束時實驗組與對照組的照片 注意事項 1 在用PBS緩沖液沖洗時 注意貼壁慢慢加入 以免沖散單層貼壁細胞 影響實驗拍照結(jié)果 2 一般做劃痕實驗 都是無血清或者低血清 2 否則細胞增殖就不能忽略 3 按照6孔板背后畫線的垂直方向劃痕 可以形成若干交叉點 作為固定的檢測點 以解決了前后觀察時位置不固定的問題 4 實驗時應(yīng)注意細胞生長狀況 選擇適當?shù)募毎臃N濃度 對不同的細胞要觀察細胞的貼壁率等 確定實驗時細胞的接種數(shù)量和培養(yǎng)時間 保證培養(yǎng)終止時密度適當 實驗原理趨化運動是指細胞能夠感受到外界化學(xué)物質(zhì)的濃度梯度 并沿著濃度梯度的方向所做的定向運動 趨化運動是一個非常保守的過程 對于生物體的生存 生命的繁衍等具有重要的意義 趨化運動實驗 ChemotaxisAssay 微孔小室中的趨化實驗 微孔小室中的趨化實驗是根據(jù)靶細胞 單核巨噬細胞 中性粒細胞或淋巴細胞等 能夠趨化性主動遷移 穿過一定孔徑的濾膜而設(shè)計的 濾膜 聚碳酸脂膜 將小室分隔成上下兩部分 靶細胞在上面 趨化因子在下面 趨化因子通過濾膜形成梯度 細胞則沿著梯度穿過膜孔 黏附在膜的下面 計數(shù)濾膜下表面的細胞數(shù)即可測出趨化因子的趨化能力 BoydenChamber裝置 實驗步驟 1 在冰盒內(nèi)將趨化因子由高濃度向低濃度稀釋 將不同濃度的趨化因子置于趨化小室的下室 30ml 孔 每個濃度加3個孔 其中只加BM的孔為陰性對照 2 取對數(shù)生長期細胞 0 1 BM重懸細胞 調(diào)整細胞濃度為5 105 ml 3 加樣 下室加不同濃度的趨化因子 將膜輕輕對折后展平 光面朝下毛面朝上 依次蓋上膠墊和上室將螺絲對稱擰上擰緊 在上室中加入細胞 50ml 孔 每個濃度加3個孔 實驗步驟 4 將趨化小室在37 5 CO2的孵化箱中孵育3h 5 在膜的兩端加上夾子 毛面在PBS液面上蘸取 光面禁止碰到液體 毛面在架子上摩擦 再蘸取PBS 反復(fù)3次后再蘸取一次 晾干 6 固定 染色 實驗步驟 7 取載玻片 剪角放在右上角 滴一滴石蠟 蓋玻片封片 8 顯微鏡觀察計數(shù) 每孔至少3個隨機視野 3個孔的數(shù)值取平均值 作柱狀圖 縱軸趨化指數(shù)或細胞數(shù) 橫軸組別 9 趨化指數(shù) ChemotaxisIndex 隨著趨化誘導(dǎo)因子的濃度梯度而遷移的細胞數(shù)目 用培養(yǎng)基做對照的遷移細胞數(shù)目 注意事項 1 膜 膠墊 上下小室之間防止有氣泡產(chǎn)生 2 放膜時要對準位置 過多調(diào)整位置 易發(fā)生交叉污染 3 槍垂直 槍尖伸入孔中下大概4 5處 迅速加樣 不要遲疑 打出液體的過程槍逐漸抬起 液體全部打出時槍尖離開液面 4 洗膜時注意 不要把細胞面與非細胞面弄反 腫瘤細胞侵襲試驗 MatrigelInvassionAssay Transwell系統(tǒng) Transwell小室 0 4um孔徑聚碳酯膜的掃描電鏡 原理 人工重構(gòu)基底膜材料Matrigel 是一種細胞外基質(zhì) 4 時是液體 在37 會逐漸凝固成膠狀 主要成分為層黏連蛋白和 型膠原 能在培養(yǎng)基中重建形成膜結(jié)構(gòu) 這種膜結(jié)構(gòu)與天然基質(zhì)膜結(jié)構(gòu)極為相似 濾膜孔徑一般為8mm 而且膜孔都被Matrigel覆蓋 細胞不能自由穿過 必須分泌水解酶 并通過變形運動才能穿過這種鋪有Martrigel的濾膜 這與體內(nèi)情況較為相似 原理 Transwell電鏡圖片 實驗步驟及注意事項 1 無菌條件下Matrigel于冰浴融化 用PBS 或DMEMonly培養(yǎng)基 稀釋成1mg ml濃度 20 C凍存?zhèn)溆?2 取出已稀釋好的Matrigel 冰浴融化 以50ml的體積鋪于Tramwell小室 24孔板 聚碳酸酯膜上 注意 體積不可太大 以剛把聚碳酸酯膜浸濕為最好 37 C放置lh 使Matrigel聚合成凝膠 注意 加基質(zhì)膠時最好將24孔板放置在冰盒上 確保膠完全覆蓋孔底 不要有氣泡 3 每孔加入200ml1640 或DMEM 培養(yǎng)基使膠重構(gòu) 4 在Transwell下室中加入趨化因子或10 FBS培養(yǎng)基600ml 孔 5 在上室孔中準確加入細胞l 105個 孔 細胞懸液體積200ml 置于5 CO2培養(yǎng)箱于37 C培養(yǎng)24h 注意 細胞量和時間根據(jù)實驗條件摸索 6 待培養(yǎng)時間結(jié)束后 棄去上室液體 小心取出上室 用濕棉簽擦去膜上未穿過膜的細胞 實驗步驟及注意事項 7 4 中性甲醛固