RhoCmiRNA真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其在卵巢癌細(xì)胞系中穩(wěn)定表達(dá).doc

RhoCmiRNA真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其在卵巢癌細(xì)胞系中穩(wěn)定表達(dá)作者：潘穎,毛麗君,孫艷霞,任淑萍,施恒亮,朱單位：吉林大學(xué)第三臨床醫(yī)院婦產(chǎn)科，吉林 長(zhǎng)春【摘要】目的 體外合成RNA干涉小分子構(gòu)建pcDNATM6.2GW/EmGFPRhoCmiRNA真核表達(dá)載體，分析其在人卵巢癌細(xì)胞SKOV3中穩(wěn)定表達(dá)情況。方法 設(shè)計(jì)并合成單鏈oligo，經(jīng)退火形成雙鏈的DNA oligo，將其與線性的pcDNA6.2GW/EmGFPmiR質(zhì)粒連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pcDNATM6.2GW/EmGFPRhoCmiRNA真核表達(dá)載體，經(jīng)擴(kuò)增、篩選、鑒定及測(cè)序后，用脂質(zhì)體法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SKOV3細(xì)胞，篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系、觀察轉(zhuǎn)染細(xì)胞的形態(tài)并進(jìn)一步通過(guò)Western印跡法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)RhoC蛋白表達(dá)。結(jié)果 重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定及DNA序列測(cè)定證實(shí)DNA oligo已被成功連接到載體中并且序列完全正確；經(jīng)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的SKOV3細(xì)胞24 h后的熒光顯微鏡下觀察到少量細(xì)胞帶有綠色熒光信號(hào)，RhoCmiRNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的SKOV3細(xì)胞形態(tài)變圓，折光性增強(qiáng)，收縮不鋪展。Western印跡結(jié)果顯示，與SKOV3細(xì)胞株及pcDNATM6.2GW/EmGFPmiRneg細(xì)胞相比，pcDNATM6.2GW/EmGFPRhoCmiRNA細(xì)胞中RhoC蛋白表達(dá)水平明顯降低，表明所設(shè)計(jì)的RhoCmiRNA能有效抑制SKOV3細(xì)胞中內(nèi)RhoC蛋白表達(dá)。結(jié)論 該實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了RhoCmiRNA真核表達(dá)載體pcDNATM6.2GW/EmGFPRhoCmiRNA，利用脂質(zhì)體法將其轉(zhuǎn)染卵巢癌細(xì)胞后，能有效地抑制細(xì)胞內(nèi)RhoC蛋白表達(dá)，為進(jìn)一步研究RhoC的功能及探討以RhoC為靶點(diǎn)的基因治療提供了研究平臺(tái)?！娟P(guān)鍵詞】 卵巢腫瘤；RhoC蛋白；小分子干擾RNA(RNAi)；真核表達(dá)載體Construction of RhoCmiRNA eukaryotic expression vector and its stable expression in ovarian carcinoma cellPAN Ying，MAO LiJun，SUN YanXia,et al.Department of Gynecology and Obstetrics，ChinaJapan Union Hospital，Jilin University，Changchun 130033，Jilin，China 【Abstract】Objective To construct the eukaryotic expression vector pcDNATM6.2GW/EmGFPRhoCmiRNA and analyse its expression in ovarian carcinoma cell SKOV3.Methods Singlestrand oligo was synthesed and ligated with linear pcDNA6.2GW/EmGFPmiR to construct recombinant plasmid pcDNATM6.2GW/EmGFPRhoCmiRNA，after amplification，screening，determination and sequencing，it was transfected into SKOV3 cells.Screening was conducted to acquire the stable transfection strain and the expression of RhoC was confirmed by Westernblot.Results DNA oligo was successfully ligated with the expressing vector by DNA sequencing.SKOV3 cells were observed with green color after the transfected recombinant plasmid into the cells for 24 h under fluorescence microscope.The expression level of RhoC in SKOV3 cells transfected with pcDNATM6.2GW/EmGFPRhoCmiRNA was significantly decreased compared with that of SKOV3 cells and those transfected with pcDNATM6.2GW/EmGFPmiRneg.Conclusions The eukaryotic expression vector pcDNATM6.2GW/EmGFPRhoCmiRNA is successfully constructed and it can inhibit the expression of RhoC effectively，which provide a research platform for the gene therapy targeting at RhoC and functional research on RhoC. 【Key words】Ovarian carcinoma；RhoC；RNAi；Eukaryotic expression vectorRNA干擾(RNAi)是存在于真核生物體內(nèi)的一種自我保護(hù)現(xiàn)象，能對(duì)抗外援導(dǎo)入或病毒基因的mRNA侵害，也能降解自身異?；虻膍RNA。高效特異地阻斷基因是RNAi的一個(gè)重要特征。在小鼠和人的體外培養(yǎng)細(xì)胞中利用RNAi技術(shù)已成功地阻斷了基因表達(dá)，實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞水平的基因敲除1。已有研究表明，卵巢癌細(xì)胞中RhoC基因過(guò)度表達(dá)是一種不良的預(yù)后指標(biāo)，提示卵巢癌侵襲性增強(qiáng)，易發(fā)生轉(zhuǎn)移，患者的生存率降低2，3。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用體外轉(zhuǎn)錄合成的小分子RNAi方法篩選出特異性RhoCmiRNA，通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染入人卵巢癌細(xì)胞株SKOV3細(xì)胞中，觀察其對(duì)SKOV3細(xì)胞中RhoC基因表達(dá)的影響，并建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染卵巢癌SKOV3細(xì)胞系，為進(jìn)一步研究RhoC基因在SKOV3的作用奠定基礎(chǔ)。1 材料與方法1.1 細(xì)胞和主要試劑 SKOV3（吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室凍存）；大腸桿菌top10感受態(tài)細(xì)胞（東北師范大學(xué)分子生物實(shí)驗(yàn)室）；質(zhì)粒pcDNATM6.2GW/EmGFPmiR、通用陰性對(duì)照質(zhì)粒pcDNATM6.2GW/EmGFPmiRneg、Lipofectin 2000試劑盒及滅菌素（均為Invitrogen公司產(chǎn)品）；質(zhì)粒小提試劑盒和DNA回收凝膠試劑盒（均為聯(lián)星生物公司產(chǎn)品）；細(xì)胞培養(yǎng)用的RPMI1640培養(yǎng)基、新生牛血清（Gibco公司）；壯觀霉素（博大泰克公司）；羊抗人RhoC多克隆抗體（Santa Cruz公司）。1.2 設(shè)計(jì)并合成單鏈oligo 編碼RhoCmiRNA的DNA插入序列兩對(duì),使用Invitrogen的RNAi 設(shè)計(jì)軟件進(jìn)行單鏈oligo的設(shè)計(jì)，在給出的10對(duì)oligo中選擇2對(duì)，序列如下：上游引物：5′TGCTGATAGTTCTCAAAGACAGTAGGGTTTTGGCCACTGACTGACCCTACTGTTTGAGAACTAT3′，下游引物：5′CCTGATAGTTCTCAAACAGTAGGGTCAGTCAGTGGCCAAAACCCTACTGTCTTTGAGAACTATC3′。 上游引物：5′TGCTGATGAGGATGACATCAGTGTCCGTTTTGGCCACTGACTGACGGACACTGGTCATCCTCAT3′，下游引物：5′CCTGATGAGGATGACCAGTGTCCGTCAGTCAGTGGCCAAAACGGACACTGATGTCATCCTCATC3′。1.3 RhoCmiRNA質(zhì)粒構(gòu)建 將從上海生物公司合成的這2對(duì)單鏈DNA oligo進(jìn)行退火，形成雙鏈的DNA oligo。4%瓊脂糖電泳鑒定退火產(chǎn)物（500 nmol/L），如圖1所示，說(shuō)明得到了退火后的雙鏈DNA oligo。將2對(duì)退火產(chǎn)物分別與線性pcDNA6.2GW/EmGFPmiR質(zhì)粒連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌top10中。挑取單克隆菌落，擴(kuò)增后提取質(zhì)粒，1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定質(zhì)粒。PCR反應(yīng)體系如下：預(yù)混的taq酶12.5 μl、正向引物1 μl、反向引物1 μl、質(zhì)粒DNA 1 μl、去離子水9.5 μl，總體積25 μl。PCR反應(yīng)條件：95預(yù)變性5 min，94變性50 s；50,30 s；72，20 s，循環(huán)30次。72，8 min。4保溫。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，凝膠成像系統(tǒng)拍照。進(jìn)一步DNA測(cè)序鑒定。1.Marker；2.陽(yáng)性對(duì)照；3.樣本1；4.樣本21.4 脂質(zhì)體法將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SKOV3細(xì)胞 6孔板中，將細(xì)胞培養(yǎng)至密度為80%90%，更換新鮮的培養(yǎng)基。取4 μg 重組鑒定質(zhì)粒加入250 μl培養(yǎng)基中，加入10 μl脂質(zhì)體，混勻，室溫避光靜置20 min，慢慢加入細(xì)胞板中。37，5% CO2培養(yǎng)24 h后，熒光顯微鏡下觀察到少量細(xì)胞帶有綠色熒光信號(hào)，即為被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。將6孔板中被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞以15的比例于10 cm細(xì)胞培養(yǎng)板中傳代，加入5 μg/ml滅菌素進(jìn)行篩選。隔3 d更換含有篩選劑的培養(yǎng)基，并觀察細(xì)胞生長(zhǎng)的狀況。到單個(gè)帶有綠色熒光的細(xì)胞生長(zhǎng)成一團(tuán)細(xì)胞時(shí)，挑取單克隆的細(xì)胞，以每孔12個(gè)細(xì)胞的密度接種至96孔板中培養(yǎng)。1.5 細(xì)胞內(nèi)RhoC蛋白表達(dá) 采用Western印跡法，嚴(yán)格按試劑合操作說(shuō)明進(jìn)行。2 結(jié)果2.1 重組質(zhì)粒的PCR鑒定及DNA序列測(cè)定 將重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定，經(jīng)1.5瓊脂糖凝膠電泳后，在200300 bp處出現(xiàn)一條目的片段，表明DNA oligo已被成功連接到載體中，并且測(cè)序結(jié)果表明與設(shè)計(jì)的序列完全一致（見(jiàn)圖2）。2.2 間接免疫熒光檢測(cè)細(xì)胞形態(tài) 重組質(zhì)粒用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染SKOV3細(xì)胞，24 h后，熒光顯微鏡下觀察到少量細(xì)胞發(fā)出綠色熒光信號(hào)。RhoCmiRNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染SKOV3細(xì)胞形態(tài)變圓，折光性增強(qiáng)，收縮不鋪展（見(jiàn)圖3）。2.3 Western印跡法檢測(cè)RhoC蛋白表達(dá) 與SKOV3細(xì)胞株及pcDNATM6.2GW/EmGFPmiRneg細(xì)胞相比，pcDNATM6.2GW/EmGFPRhoCmiRNA細(xì)胞中RhoC蛋白表達(dá)水平明顯降低，這一結(jié)果說(shuō)明所設(shè)計(jì)的RhoCmiRNA能有效抑制SKOV3細(xì)胞中內(nèi)RhoC蛋白表達(dá)（見(jiàn)圖4）。3 討論 Rho，主要包括3個(gè)亞家族（RhoA，RhoB，RhoC），在細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中起著重要作用4，在肌動(dòng)蛋白骨架的構(gòu)建、增殖、黏附變形、游走，細(xì)胞周期調(diào)控及基因轉(zhuǎn)錄等許多基礎(chǔ)生命活動(dòng)中起關(guān)鍵作用5。近年研究發(fā)現(xiàn)，Rho亞家族蛋白的異常表達(dá)在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用6，尤以RhoC研究更深入，RhoC與下游的效應(yīng)分子作用，通過(guò)多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與腫瘤的惡性轉(zhuǎn)型、浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移及血管生成7等多方面過(guò)程，因此，RhoC有望成為判斷惡性腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移潛能及預(yù)后的新指標(biāo)8，對(duì)其進(jìn)一步研究也將成為非常有希望的腫瘤基因治療的新靶點(diǎn)911。 RNAi能夠使細(xì)胞內(nèi)同源mRNA特異性降解，進(jìn)而使該基因表達(dá)沉默。本研究構(gòu)建的RhoCmiRNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)染卵巢癌SKOV3細(xì)胞后，其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在切割酶Dicer的作用下產(chǎn)生發(fā)卡狀的RhoCmiRNA，進(jìn)而特異性導(dǎo)致RhoC mRNA降解，達(dá)到降低RhoC基因產(chǎn)物的目的。 Horiuchi2的研究顯示RhoC在卵巢良性腫瘤、卵巢癌及癌旁組織中有表達(dá)，卵巢癌中RhoC mRNA水平明顯高于卵巢良性腫瘤中的水平，且惡性程度高者RhoC mRNA水平明顯高于惡性程度低者，伴有轉(zhuǎn)移的卵巢癌RhoC mRNA水平明顯高于原發(fā)性卵巢癌，該結(jié)果提示RhoC的表達(dá)水平可反映腫瘤的轉(zhuǎn)移潛能。韓志強(qiáng)3等用RTPCR和Western印跡研究RhoA、RhoC及ROCK1在卵巢癌細(xì)胞中表達(dá)情況，結(jié)果表明僅RhoC的表達(dá)水平與癌細(xì)胞侵襲力呈正相關(guān)。綜上所述，RhoC在卵巢癌的發(fā)展、侵襲及轉(zhuǎn)移中起著關(guān)鍵作用。本研究成功構(gòu)建了真核重組表達(dá)載體pcDNATM6.2GW/EmGFPRhoCmiRNA，為進(jìn)一步研究RhoC的功能及探討以RhoC為靶點(diǎn)的基因治療奠定了基礎(chǔ)?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1 Miliner J.RNA interference for treating cancers caused by viral infectionJ.Expert Opin Biol Ther，2003；3:45967.2 Horiuchi A，Imai T，Wang C,et al.Upregulation of small GTPases RhoA and RhoC，is associated with tumor progression in ovarian carcinomaJ. Lab Invest，2003；83(6)：86170.3 韓志強(qiáng)，張阿麗，吳明富.RhoA、RhoC及其效應(yīng)分子ROPCK1的表達(dá)與卵巢癌細(xì)胞系惡性行為相關(guān)性的體外研究J.中華腫瘤雜志，2004；26(7):3858.4 Van Aalst L，D′souzaSchorey C.Rho GTPases and signaling networksJ.Genes Devel，1997；11:2295322.5 Qiu RG,Chen J,Kirn D,et al.An essential role for Rac in Ras transformationJ.Nature(Lond)，1995；374:4579.6 Pruittl K，Der CJ.Ras and Rho regulapion of the cell cgcle and oncugenesisJ.Cancer Lett，2001；71(1)：110.7 Ikoma T，Takahash T，Nagano S,et al.A definitive role of RhoC in metastais of orthotopic lung cancer in miceJ.Clin Cancer Res，2004；10(3):11922000.8 Kteer CG，Griffith KA，Sabet MS,et al.RhoCGTPase is a novel tissue biomarker associa