（醫(yī)學(xué)PPT課件）雜交瘤技術(shù)

1,雜交瘤技術(shù)（hybridomatechnique）,2,內(nèi)容綱要,細(xì)胞融合概述誘導(dǎo)細(xì)胞融合的常用方法雜種細(xì)胞的篩選（HAT）雜交瘤技術(shù)與單克隆抗體的制備基本概念三個(gè)技術(shù)關(guān)鍵單克隆抗體的制備過程,3,雜交瘤技術(shù)又稱單克隆抗體制備技術(shù)。1975年，Kohler和Milstein將骨髓瘤細(xì)胞與免疫的動物脾細(xì)胞融合，形成的雜交細(xì)胞即可產(chǎn)生抗體，又可無限增殖，從而創(chuàng)立了具有劃時(shí)代意義的雜交瘤技術(shù)。這種技術(shù)的基礎(chǔ)是細(xì)胞融合技術(shù)。,4,一、細(xì)胞融合（cellfusion）,1、概述細(xì)胞融合是指兩個(gè)或更多個(gè)相同或不同細(xì)胞通過膜融合形成單個(gè)細(xì)胞的過程?？稍谧园l(fā)或人工誘導(dǎo)下發(fā)生。,5,兩個(gè)不同基因型的細(xì)胞可形成一個(gè)雜種細(xì)胞。基本過程包括細(xì)胞融合形成異核體、異核體通過細(xì)胞有絲分裂進(jìn)行核融合、最終形成單核的細(xì)胞稱為雜種細(xì)胞或雜交細(xì)胞（hybridcell）。,6,2、誘導(dǎo)細(xì)胞融合的常用方法,生物方法：如仙臺病毒化學(xué)方法：如聚乙二醇（PEG）物理方法：如電融合,7,（1）仙臺病毒融合法,常用的能誘導(dǎo)細(xì)胞融合的病毒有皰疹病毒、牛痘病毒和副粘病毒科病毒等。其中屬副粘病毒科的仙臺病毒應(yīng)用最為廣泛。因病毒具有凝集細(xì)胞的能力，某些病毒的糖蛋白還有促進(jìn)細(xì)胞融合的功能，因此可以用紫外線滅活的此類病毒誘導(dǎo)細(xì)胞融合。,8,用滅活的病毒誘導(dǎo)的動物細(xì)胞融合過程示意圖,9,（2）聚乙二醇融合法,聚乙二醇（polyethyleneglycol，PEG）分子可在質(zhì)膜之間形成分子橋，使細(xì)胞質(zhì)膜發(fā)生粘連促使質(zhì)膜的融合。其優(yōu)點(diǎn)是融合成本低，勿需特殊設(shè)備；簡便、融合效率較高。因此在1975年獲得成功后很快取代仙臺病毒法。,10,11,（3）電融合法,電融合法是80年代出現(xiàn)的細(xì)胞融合技術(shù)，將細(xì)胞置于電場中，使它們彼此靠近緊密接觸并排列呈串，然后在高強(qiáng)度、短時(shí)程的直流電脈沖的作用下，相互連接的細(xì)胞膜被擊穿而導(dǎo)致細(xì)胞融合。其優(yōu)點(diǎn)是：融合率高、重復(fù)性強(qiáng)、對細(xì)胞傷害小；可在顯微鏡下觀察融合過程；誘導(dǎo)過程可控性強(qiáng)。,12,電融合示意圖,13,3、雜種細(xì)胞的篩選,人工誘導(dǎo)細(xì)胞融合是一個(gè)隨機(jī)的過程，可能產(chǎn)生多種類型的細(xì)胞，篩選的目的是獲得優(yōu)良的雜種細(xì)胞。應(yīng)根據(jù)其細(xì)胞特性來選擇適當(dāng)?shù)暮Y選方法（如酶缺陷、藥物抗性標(biāo)記、營養(yǎng)缺陷、溫度敏感等）。,14,HAT是最常用的篩選系統(tǒng),原理細(xì)胞DNA合成有兩條途徑：主要合成途徑補(bǔ)救合成途徑,15,主要合成途徑,即利用糖和氨基酸這些可從培養(yǎng)液中攝取的簡單的含碳、含氮復(fù)合物來合成核苷酸，進(jìn)而合成DNA。這一過程需四氫葉酸參與供甲基及甲酰基，因此該途徑可被葉酸拮抗物氨基喋呤阻斷。,16,細(xì)胞可通過次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（HGPRT）和胸腺嘧啶核苷激酶（TK），將核苷酸前體合成核苷酸以供DNA合成的原料。,補(bǔ)救合成途徑,17,DNA的生物合成途徑與HAT選擇培養(yǎng)基,Hhypoxanthine（次黃嘌呤）Aaminopterin（氨基喋呤）Tthymidine（胸腺嘧啶核苷）,18,凡能在HAT選擇培養(yǎng)基中生長的細(xì)胞，必須能利用外源性次黃嘌呤（H）和胸腺嘧啶（T）；HGPRT或TK細(xì)胞在HAT培養(yǎng)基上不能存活；HGPRT與TK細(xì)胞融合或與正常細(xì)胞融合后的雜交細(xì)胞，可在HAT培養(yǎng)基上存活。,19,可人為地篩選或致突變，誘發(fā)一些細(xì)胞缺乏HGPRT或缺乏TK，如用毒性藥物8-氮鳥嘌呤（8-azaguanine，8-AG)作用于細(xì)胞株，可選育出HGPRT細(xì)胞株，這是因?yàn)镠GPRT+細(xì)胞利用了8-AG后，因合成毒性核苷酸而死亡。,HGPRT細(xì)胞的篩選,20,由此可見，HAT選擇培養(yǎng)基及補(bǔ)救合成途徑酶缺乏的突變細(xì)胞株的建立，是細(xì)胞融合后選擇出雜交細(xì)胞株的關(guān)鍵因素。,21,二、雜交瘤技術(shù)與單克隆抗體的制備,（一）基本概念雜交瘤細(xì)胞指腫瘤細(xì)胞與體細(xì)胞融合形成的雜交細(xì)胞，它既保留了腫瘤細(xì)胞無限增殖的能力，又具有參與融合的體細(xì)胞的一些特征。,22,雜交瘤技術(shù)（也稱單克隆抗體制備技術(shù)）是指建立雜交瘤細(xì)胞系的技術(shù)，通常指B淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)，即將骨髓瘤細(xì)胞與B淋巴細(xì)胞融合，以建立可以分泌單一性抗體的雜交瘤細(xì)胞系的技術(shù)。,23,單克隆抗體（monoclonalantibody，McAb)指由一個(gè)B淋巴細(xì)胞克隆所產(chǎn)生的，只識別一種抗原決定簇的均質(zhì)抗體?？寺≈竿ㄟ^一定方法獲得由單個(gè)細(xì)胞無性繁殖形成的細(xì)胞集落。,24,McAb技術(shù)的核心是用骨髓瘤細(xì)胞與經(jīng)特定抗原免疫刺激的B淋巴細(xì)胞融合得到雜交瘤細(xì)胞(hybridomacell)，雜交瘤細(xì)胞既能象骨髓瘤細(xì)胞那樣在體外無限增殖，又具有B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生特異性抗體的能力。,雜交瘤技術(shù)的基本過程,25,（二）雜交瘤技術(shù)產(chǎn)生的三個(gè)技術(shù)關(guān)鍵,1、B淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞的特性B淋巴細(xì)胞（Blymphocytes）：接受抗原刺激后，能分泌針對該抗原的特異性抗體，在體液免疫中具有重要功能。本身是一種終末分化細(xì)胞，通常不再進(jìn)行細(xì)胞分裂，存活一段時(shí)間后便會死亡短命細(xì)胞。,26,骨髓瘤細(xì)胞(myelomacells)：惡性增殖的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，只要營養(yǎng)條件適合可永遠(yuǎn)分裂和存活長命細(xì)胞。沒有抗體分泌。經(jīng)篩選HGPRT或TK。,27,2.細(xì)胞融合技術(shù),28,3.雜交瘤細(xì)胞的篩選,29,HAT培養(yǎng)基篩選,B淋巴細(xì)胞：HGPRT+，TK+存活但短命骨髓瘤細(xì)胞：HGPRT或TK死亡雜交瘤細(xì)胞：HGPRT+，TK+存活,30,（三）單克隆抗體的制備過程,31,三個(gè)基本環(huán)節(jié)和兩個(gè)決定因素,32,1、免疫小鼠和脾細(xì)胞的制備,免疫動物：68周齡BALBc小鼠免疫抗原：各種病毒、細(xì)菌、細(xì)胞或可溶性抗原。一般可溶性抗原用完全佐劑效果較好。免疫途徑：皮下、腹腔或靜脈注射免疫程序：基礎(chǔ)免疫2次，靜脈再加強(qiáng)免疫1次。免疫后35天解剖，取脾細(xì)胞配制成適量濃度細(xì)胞懸液用于融合。,33,2、骨髓瘤細(xì)胞的準(zhǔn)備,常用骨髓瘤細(xì)胞系有NS1、SP2/0、X63等。選擇要點(diǎn)：穩(wěn)定易培養(yǎng)、自身不分泌抗體、融合率高、HGPRT缺陷株（8-氮鳥嘌呤定期篩選）。融合條件：對數(shù)生長期，良好的細(xì)胞形態(tài)，活力細(xì)胞達(dá)95%。,34,3、飼養(yǎng)細(xì)胞的準(zhǔn)備,在細(xì)胞融合后選擇性培養(yǎng)過程中，由于大量骨髓瘤細(xì)胞和脾細(xì)胞相繼死亡，此時(shí)單個(gè)或少數(shù)分散的雜交瘤細(xì)胞多半不易存活，通常必須加入其他活細(xì)胞使之繁殖，這種被加入的活細(xì)胞稱為飼養(yǎng)細(xì)胞（Feedercells）。機(jī)制尚不明了，一般認(rèn)為：可能釋放非種屬特異性的生長刺激因子；也可能是為了滿足新生雜交瘤細(xì)胞對細(xì)胞密度的依賴性。,35,常用的飼養(yǎng)細(xì)胞有胸腺細(xì)胞、正常脾細(xì)胞和腹腔巨噬細(xì)胞。其中小鼠腹腔巨噬細(xì)胞使用最為普遍，因其來源及制備較為方便，且有吞噬清除死亡細(xì)胞及其碎片的作用。飼養(yǎng)細(xì)胞的制備：細(xì)胞融合前一天，從同系正常小鼠腹腔取巨噬細(xì)胞，加入培養(yǎng)板，96孔板每孔細(xì)胞數(shù)為2104；24孔板，每孔為1105個(gè)，置37培養(yǎng)。,36,4、50%PEG配制,稱2050gPEG15004000粉劑，放于玻璃瓶中，高壓滅菌（121132）20min，溶化呈液狀，PEG尚未凝固時(shí)，加入RPMI-16402050ml（與PEG重量相當(dāng)）立即充分混合。此為50%PEG保存于室溫，呈堿性，不必調(diào)節(jié)pH。,37,5、細(xì)胞融合,（1）SP2/0細(xì)胞和免疫脾細(xì)胞按1:4的比例放于一個(gè)50ml離心管中，充分混勻，離心后盡量吸盡上清，置于37玻璃杯水浴中。（2）用1ml吸管將1ml37預(yù)熱的50%PEG溶液，逐滴緩慢加入混合細(xì)胞管中（1min以內(nèi)加完），邊加邊輕輕攪拌。（3）繼續(xù)攪動團(tuán)塊1分鐘，目的使所有的細(xì)胞盡可能地與PEG接觸。,38,（4）慢慢加入預(yù)熱的無血清16401ml，1min，目的是稀釋PEG；再加入1ml，1min。最后加入7ml，2-3min內(nèi)加完，并持續(xù)輕輕攪動，此時(shí)細(xì)胞對機(jī)械損傷非常敏感。（5）離心1000rpm，室溫10min，去上清。（6）取預(yù)熱的15%牛血清1640，先加10ml，對準(zhǔn)細(xì)胞團(tuán)加液，使細(xì)胞顆粒均勻分布于懸液中；再加入90ml。（7）加入已含有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔板或24孔板（每孔加入細(xì)胞數(shù)分別為2105和1106）。,39,6、HAT和HT選擇培養(yǎng),（1）接種24h后加入HAT選擇培養(yǎng)液。（2）融合后710天用HAT培養(yǎng)液半量換液(留一半舊的加一半新的)，以后每23天半量換液一次。（3）兩周后換HT培養(yǎng)液（目的是洗出殘留于細(xì)胞內(nèi)的氨基喋呤），以后每34天換液一次。（4）再維持培養(yǎng)兩周改用一般培養(yǎng)液。,40,7、抗體的篩查,細(xì)胞融合后兩周即可篩查抗體。選擇檢測方法以快速、簡便、特異、敏感和便于一次處理大量樣品為原則。常用的方法有：ELISA用于可溶性抗原（蛋白質(zhì)）、細(xì)胞和病毒等McAb的檢測。RIA用于可溶性抗原、細(xì)胞McAb的檢測。IFA用于細(xì)胞和病毒McAb的檢測。FACS(流式細(xì)胞術(shù))用于檢查細(xì)胞表面抗原的McAb檢測。,41,8、克隆化,由于在一個(gè)培養(yǎng)孔內(nèi)不能保證只存在一種雜交瘤細(xì)胞系，因此必需克隆化。一般需克隆化35次，才能獲得穩(wěn)定型基因和穩(wěn)定分泌特異性抗體的細(xì)胞。要盡早克隆化，以防止單克隆抗體細(xì)胞系被競爭淘汰。分泌抗體的克隆一般生長較慢。克隆化后的雜交瘤細(xì)胞也需定期再克隆，以防突變和染色體丟失。,42,有限稀釋法（較常用）：使96孔板上其中36孔每孔5個(gè)細(xì)胞，另36孔每孔1個(gè)細(xì)胞，余下24孔每孔0.5個(gè)細(xì)胞；亦有經(jīng)連續(xù)稀釋成最終30個(gè)/ml，每孔0.1ml接種48孔。軟瓊脂平板法FACS選取法顯微挑選法,克隆培養(yǎng)方法,43,克隆化培養(yǎng)后，通常在1014天測抗體進(jìn)行陽性克隆的篩查。取抗體陽性的克隆，可繼續(xù)克隆化或進(jìn)一步擴(kuò)大培養(yǎng)。陽性雜交瘤細(xì)胞應(yīng)及時(shí)凍存，以防染色體丟失、變異及污染。,44,9、抗體大量生產(chǎn),方法主要有兩種：體外使用旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)管大量培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞，從上清中獲取單克隆抗體。但此方法產(chǎn)量低，一般培養(yǎng)液含量為1060gml，如果大量生產(chǎn)，費(fèi)用較高。體內(nèi)接種雜交瘤細(xì)胞，制備腹水或血清。腹水可達(dá)每毫升幾毫克抗體。,45,10、雜交瘤細(xì)胞的保存,因?yàn)榧?xì)菌的污染和細(xì)胞的突變，使雜交瘤難以維持，凍存幾批早期雜交細(xì)胞，預(yù)防意外是必要的。無菌DMEM含20%牛血清加10%DMSO（二甲基亞砜）配成凍存液，21065106細(xì)胞加入1ml凍存液，于液氮中貯存。,46,11、細(xì)胞復(fù)蘇,凍存管由液氮中取出，即刻投入37水浴中，很快融化，用吸管吸出細(xì)胞到50ml離心管，內(nèi)有50ml細(xì)胞生長液，1000rpm，10min，去上清，細(xì)胞沉淀物，再懸浮于10ml生長培養(yǎng)液，室溫靜止10