免疫組化 HE染色 FISH ISH.ppt

現(xiàn)階段開展的病理實驗,主要內(nèi)容：免疫組化HE染色幾種特殊的染色原位雜交熒光原位雜交,免疫組化,1、免疫組化是利用抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，通過化學反應(yīng)使標記抗體的顯色劑(熒光素、酶、金屬離子、同位素)顯色來確定組織細胞內(nèi)抗原(多肽和蛋白質(zhì))，對其進行定位、定性及定量的研究，稱為免疫組織化學。2、我們現(xiàn)階段主要要做的組織免疫組化有石蠟切片、冰凍切片免疫組化以及熒光免疫組化。細胞免疫組化有細胞爬片、細胞印片和細胞涂片免疫組化和熒光免疫組化。3、免疫組化過程中抗原修復(fù)有高壓修復(fù)法、酶修復(fù)、微波修復(fù)，其中微波修復(fù)抗原對提高免疫組化陽性檢出率非常有效。4、高壓修復(fù)和微波修復(fù)法中常用的緩沖液有0.01M檸檬酸緩沖液、1mM的EDTA（pH8.0）。,6、酶標抗體系統(tǒng)中的酶與顯色劑、復(fù)染液的合理選用：（1）辣根過氧化物酶系統(tǒng)（HRP）顯色劑一般用DAB、AEC,DAB顯色液一般染色部位為棕黃色，AEC顯色液一般染色部位為紅色；而HRP系統(tǒng)常用的復(fù)染液為蘇木素，將細胞核染成藍色。（2）堿性磷酸酶系統(tǒng)（AP）顯色劑一般用BCIP/NBT、固紅、固藍。最常用的是BCIP/NBT顯色液，染色部位為深藍色或者藍紫色；該系統(tǒng)常用的復(fù)染液為核固紅，將細胞核染成紅色。,免疫組化切片組織前期處理,1、組織塊大小應(yīng)限于2cm1.5cm0.2cm。2、應(yīng)用于光鏡的免疫組織化學染色的切片厚度一般要求5m左右，神經(jīng)組織的研究要求切片厚度在20-100m，有利于追蹤神經(jīng)纖維的走行。3、石蠟切片為常規(guī)制片技術(shù)，切片厚度27m，應(yīng)用范圍廣，不影響抗體的穿透性，染色均勻一致。4、組織的固定：4%多聚甲醛固定一般1-2小時。固定后經(jīng)充分的流水沖洗后進行脫水包埋。5、組織脫水：主要用不同梯度的酒精進行脫水。一般情況下，組織經(jīng)過70，80，90，95，以至無水酒精的脫水程序，即可達到脫水的要求。但是為了能使大量的組織塊同時進行脫水，則要求保持液體的濃度以保證脫水的作用，最好是以兩次95酒精，兩次100酒精重復(fù)進行脫水，以保證組織的水分脫凈。6、組織透明：我們一般采用二甲苯透明，30-60min即可。,5、石蠟切片：浸蠟、包埋過程中，石蠟應(yīng)保持在60以下，以熔點低的軟蠟較好,浸蠟時間14小時。6、冰凍切片：組織采用液氮法包埋。將未固定的組織放入OCT包埋劑中對組織進行液氮包埋，包埋后放在-80度冰箱中貯存或者對其進行切片?；蛘邔⒔M織置于20%-30%蔗糖溶液中1-3天，利用高滲吸收組織中水分，減少組織含水量，再放入OCT包埋劑中進行包埋。7、切片的固定：冰凍切片、細胞切片常用固定液為4丙酮或者4%多聚甲醛，固定10-30min。,石蠟切片免疫組化,1、石蠟切片脫蠟至水。2、3%H2O2室溫孵育5-10min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性，水洗，5min3次。3、根據(jù)客戶抗體要求進行修復(fù)，PBS沖洗，2min3次。4、5-10%正常山羊血清封閉（5%BSA封閉20-30min），室溫孵育20-30min。傾去血清，勿洗。5、滴加適當比例稀釋的一抗或一抗工作液（PBS配制），37孵育1-2小時或4過夜。（室溫20-30min，再放于37孵育20-30min）6、PBS沖洗，2min3次。7、滴加適當比例稀釋的生物素標記二抗，37孵育10-30min。8、PBS沖洗，2min3次。9、滴加即用型SABC，37孵育10-30minPBS沖洗，5min4次。10、顯色劑顯色（DAB或AEC）。11、自來水充分沖洗，復(fù)染（蘇木素），脫水透明，封片。,返回B,石蠟切片免疫組化DAB顯色,血涂片，細胞，冰凍切片免疫組化,1、冰凍切片4-8m，冰凍切片后如不染色，必須吹干，儲存低溫冰箱內(nèi)，或進行短暫預(yù)固定后儲存于-20冰箱。2、室溫放置30min后，放入4丙酮或者4%多聚甲醛固定10-30min。PBS沖洗5min3次。3、30%過氧化氫1份+純甲醇50份混合，室溫浸泡30min，以滅活內(nèi)源性過氧化物酶。蒸餾水洗2次。4、其余步驟和石蠟切片免疫組化4-11步相同。注：如果冰凍切片直接染色結(jié)果不理想時，可以參照石蠟切片對切片進行熱修復(fù)，方法和石蠟切片3-11步相同。,石蠟切片熒光免疫組化,1、石蠟切片脫蠟至水。2、與石蠟切片免疫組化3-8的步驟相同。3、加入SABC-FITC,37孵育10-30min，PBS沖洗，5min4次。4、抗熒光萃滅封片液封片，熒光顯微鏡觀察。,冰凍切片熒光免疫組化,1、冰凍切片4-8m，冰凍切片后如不染色，必須吹干，儲存低溫冰箱內(nèi)，或進行短暫預(yù)固定后儲存于-20冰箱。2、室溫放置30min后，放入4丙酮或者4%多聚甲醛固定10-30min。PBS沖洗5min3次。3、5-10%正常山羊血清封閉，室溫孵育10-30min。傾去血清，勿洗。4、滴加適當比例稀釋的一抗或一抗工作液，37孵育1-2小時或4過夜。5、PBS沖洗，5min3次。6、滴加適當比例稀釋的生物素標記二抗，37孵育10-30min；或滴加第二代生物素標記二抗工作液，37或室溫孵育10-20min。7、PBS沖洗，5min3次。8、滴加SABC-FITC,37孵育10-30min，PBS沖洗5min3次。9、抗熒光萃滅封片液封片，熒光顯微鏡觀察。,細胞爬片免疫組化,1、取出培養(yǎng)皿，用PBS漂洗2min2次.2、4冷丙酮或4%的多聚甲醛固定的細胞爬片，室溫10-30分鐘。PBS漂洗2min3次。0.5%TritonX-100室溫處理20min。PBS洗2min3次，3%過氧化氫室溫處理15min，PBS洗2min3次。3、血清封閉：室溫10-30分鐘，傾去。4、一抗：371小時或4度過夜5、0.1MPBS洗三次-每次三分鐘。6、相應(yīng)的生物素化二抗3730-40分鐘。7、0.1MPBS洗三次-每次三分鐘。8、鏈酶卵白素-堿磷酶復(fù)合物或過氧化物酶標記鏈酶卵白素3740min。9、NBT/BCIP或DAB顯色，核固紅或蘇木素復(fù)染。10、切片經(jīng)梯度酒精脫水干燥，(二甲苯透明)，中性樹膠封片；,注意事項：1、良好的細胞爬片是進行免疫組織細胞的基礎(chǔ)，要獲得良好細胞爬片須注意以下：（1）對于粘附分子較少的細胞爬片時間要達5天以上，這樣細胞爬片才較牢固，沖洗時不易脫片；（2）接種的細胞密度適中，以2*104/ml為宜，若細胞密度太高，5天后細胞連接成片沖洗時易脫片；2、冰丙酮固定后玻片可密閉保存于4度冰箱，冰丙酮固定時會使細胞收縮，可用80%冰丙酮或4%多聚甲醛固定。3、沖洗時只須輕輕振蕩培養(yǎng)皿，（不可用吸管太用力吹，易脫片）4、加一抗、二抗后沖洗時第一次須將玻片傾斜5、TritonX-100（曲拉通）表面活性劑，脫去細胞膜中最主要的成分脂質(zhì)，對于抗原表達在胞漿或胞核者方使用，對于抗原表達在胞漿者時間要控制好，使其破壞細胞膜而核膜破壞較少。,免疫組化中常用的固定液,1.冷丙酮可用于一般的免疫組化染色。將純的丙酮預(yù)先放入冰箱-20后便為冷丙酮（放心，丙酮在此溫度不會為固體的）細胞爬片取出后，PBS洗2遍，便可加入冷丙酮于-20（丙酮有很強的揮發(fā)性，注意將含有丙酮和爬片的器皿蓋嚴，防止其揮發(fā)）固定10分鐘。取出后，室溫吹干，然后放入-20保存。2.多聚甲醛(常用4%)：可用于免疫電鏡；也可用于免疫熒光以及TUNEL染色。主要檢測組織內(nèi)一些性能嬌弱的抗原特別是細胞表面抗原，例如各類淋巴細胸分化決定簇(CD)、主要組織相容性抗原等室溫固定15分鐘后，將表面液體吹干，入-20保存3.95乙醇，可用于免疫組化。優(yōu)點：穿透性強、抗原性保存較好。缺點：醇類對低分子蛋白質(zhì)、多肽及胞漿內(nèi)蛋白質(zhì)保存效果較差，使蛋白變性的作用輕，固定后可再溶解；染色過程中，溫育時間長，抗原可流失而減弱反應(yīng)強度室溫固定15分鐘后，將表面液體吹干，入-20保存4.甲醛(福爾馬林)應(yīng)用最廣優(yōu)點：形態(tài)結(jié)構(gòu)保存好，且穿透性強，缺點：甲醛放置過久可氧化為甲酸，使溶液pH降低，影響染色；分子間交聯(lián)形成的網(wǎng)格結(jié)構(gòu)可能部分或完全掩蓋某些抗原決定簇，使之不能充分暴露?？稍斐杉訇幮缘娜旧Y(jié)果。,返回,HE染色,蘇木精伊紅染色法(hematoxylin-eosinstaining，HE)是石蠟切片技術(shù)里常用的染色法之一。HE染色法是組織學、胚胎學、病理學教學與科研中最基本、使用最廣泛的技術(shù)方法。HE染色的原理：脫氧核糖核酸（DNA）兩條鏈上的磷酸基向外，帶負電荷，呈酸性，很容易與帶正電荷的蘇木精堿性染料以離子鍵結(jié)合而被染色。伊紅是一種化學合成的酸性染料，在水中離解成帶負電荷的陰離子，與蛋白質(zhì)的氨基正電荷的陽離子結(jié)合使胞漿染成紅色或粉紅色，與藍色的細胞核形成鮮明對比。,石蠟切片HE染色步驟：1、脫蠟水合。2、蒸餾水洗5min3次。3、蘇木素染液染色，鏡下控制染色時間。4、水洗玻片上多余染液，0.5-1%鹽酸酒精分色數(shù)秒。5、流水沖洗15-30s，細胞核呈藍色。6、0.5%伊紅染液染色1-5min。蒸餾水浸泡5min。7、風干，封片。,細胞爬片HE染色1、取出細胞爬片，用PBS洗滌3次。2、樣品固定：95乙醇固定20min，PBS洗滌2次，每次2min。3、其余步驟和石蠟切片3-7步相同。冰凍切片HE染色1、固定：固定1-2min。(配制方法：40%福爾馬林15mL，95%乙醇80mL，冰乙酸5mL)2、其余步驟和石蠟切片2-7步相同。染色結(jié)果：細胞核呈藍色，胞漿呈紅色，紅細胞呈桔紅色，其他部位呈深淺不同的紅色。,返回,常用特殊染色,一、彈力纖維染色1、彈性纖維主要由彈性蛋白（一種黃色硬蛋白，它是黃色彈性纖維組織的主要成分，干燥時易脆，而濕潤時呈彎曲并富彈性）構(gòu)成。新鮮時它呈黃色，固又稱為黃色纖維。彈性纖維較細，直徑0.2-1.0um，有分支，不成束。但可交織成網(wǎng)。它富有彈性，容易拉長，但不能拉到超過它的極限，外力除去后又恢復(fù)原狀。2、彈性纖維染色的臨床應(yīng)用1）用于區(qū)別正常的動脈和靜脈以及觀察動脈有病變時血管壁各層的情況，如動脈粥樣硬化時的各類變化。2）用于區(qū)別觀察各種疾病對彈性纖維的影響及變化，如原發(fā)性或繼發(fā)性高血壓可見主動脈彈力纖維增生，老年彈力纖維增多癥。心內(nèi)膜彈力纖維增生癥常都可見到彈力纖維斷裂，梅毒性主動脈炎和皮膚的環(huán)狀肉芽腫，動脈粥樣硬化均可見到裂解，崩解的彈力纖維。3）用于彈力纖維性假黃瘤的診斷。該病鏡下見真皮中下部結(jié)締組織變性，呈團塊狀或條索狀，弱嗜堿性用彈力纖維染色法可以鑒別。,3、彈性纖維的染色方法：維格特氏雷鎖辛品紅法、Gomoris醛品紅法、地衣紅技術(shù)、費爾霍夫氏酒精蘇木素技術(shù)。二、Masson染色Masson染色,用于顯示組織中纖維的染色方法之一。一般的Masson染色用的是三色法，苯胺藍染液使膠原纖維、粘液、軟骨呈藍色(如光綠液染色為綠色)，Masson麗春紅酸性復(fù)紅液使胞漿、肌肉、纖維素、神經(jīng)膠質(zhì)呈紅色，Regaud氏蘇木精染液使細胞胞核黑藍色。三、網(wǎng)狀纖維染色1、網(wǎng)狀纖維在組織化學上的反應(yīng)網(wǎng)狀纖維的主要成分是網(wǎng)硬蛋白，在組織化學上，網(wǎng)狀纖維和膠原纖維是容易區(qū)別的。網(wǎng)狀纖維是分支纖細的纖維。VanGieson氏染色不顯色或微紅色。PAS反應(yīng)呈現(xiàn)紅紫色，銀浸染為黑色。膠原纖維用VanGieson氏染色為紅色，PAS反應(yīng)呈微粉紅色。銀浸染為黃色或棕黃色。,2、臨床應(yīng)用1）可用于區(qū)別癌和肉瘤的診斷。例如：網(wǎng)織細胞肉瘤和轉(zhuǎn)移于淋巴結(jié)內(nèi)的未分化癌，這兩者在HE的染色切片都較難區(qū)別，前者可產(chǎn)生網(wǎng)狀纖維，后者不產(chǎn)生網(wǎng)狀纖維。鼻咽部活柱，應(yīng)將網(wǎng)染作為常規(guī)，給予使用，可增加診斷的準確性。2）可用于區(qū)別血管內(nèi)皮瘤（肉瘤）和血管外皮瘤（肉瘤），它的瘤細胞在網(wǎng)狀纖維膜內(nèi)，而血管外皮瘤則在網(wǎng)狀纖維膜外，血管內(nèi)皮肉瘤的瘤細胞呈泡巢狀，周圍多被網(wǎng)狀纖維包繞；而血管外皮肉瘤的瘤細胞可見較多的網(wǎng)狀纖維。3）可用于神經(jīng)系統(tǒng)方面腫瘤的區(qū)別。如：交感神經(jīng)母細胞，腦的髓母細胞瘤，這些腫瘤的形態(tài)有時象肉瘤，但銀染時，神經(jīng)系統(tǒng)的網(wǎng)染為陰性，不過腦的原發(fā)性肉瘤有較多的網(wǎng)狀纖維。4）可用于觀察癌組織的發(fā)生發(fā)展過程。如：原位癌，可見有完整的基底膜，而浸潤性癌則可見到被破壞的基底膜。5）可用于區(qū)別淋巴系統(tǒng)方面的腫瘤。如：淋巴肉瘤和網(wǎng)織細胞肉瘤，前者瘤細胞間的網(wǎng)狀纖維比正常稍減少，后者則比正常時增多。6）可用于急性骨髓纖維化的鑒別診斷，該病的網(wǎng)狀纖維增多，纖維可以是致密和融合性的。膠原纖維染色通常呈陰性，盡管偶爾有的病例可能顯示膠原纖維化。,四、VanGieson染色1、結(jié)果：膠原纖維染成鮮紅色；肌纖維染成黃色；紅細胞染成黃色；細胞核染成藍黑或灰色。2、臨床應(yīng)用：膠原纖維發(fā)生病變?nèi)鐗乃阑蛲该髯冃詴r，它與淀粉樣物在HE染色時被染為粉紅色，不好區(qū)別。應(yīng)用V.G染色法，能將膠原纖維染為粉紅色，而淀粉樣物將被染為黃色。,返回,敏感性加強型原位雜交（AP）,原位雜交(ISH)是一種可在細胞涂片、組織切片以及分裂中期染色體帶中檢測DNA或RNA的技術(shù)，此方法原理是由DNA或RNA的序列與互補的標記單鏈DNA/RNA探針結(jié)合形成標記的雙鏈雜交分子，本技術(shù)可對組織細胞原位的待測核酸分子進行定性，定量及定位分析。在細胞分化調(diào)節(jié)、基因定位、腫瘤遺傳學、分子病理學、病毒學等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。敏感性加強型原位雜交（AP）僅適應(yīng)于地高辛高效標記的寡核苷酸探針。,一、培養(yǎng)細胞和冰凍切片1、培養(yǎng)好的細胞用0.1MPBS洗2min3次。2、培養(yǎng)細胞和冰凍切片均可用下述方法固定：4%多聚甲醛，室溫固定20-30min。蒸餾水洗，干燥后-20保存。3、暴露mRNA核酸片段。胃蛋白酶37消化5-120s，0.5MTBS洗滌5min3次，蒸餾水洗滌1次。4、預(yù)雜交5、雜交6、雜交后洗滌7、滴加封閉液。3730min8、滴加生物素化鼠抗地高辛。3760min,9、0.5MTBS洗滌5min4次。10、滴加SABC-AP3720min。0.5MTBS洗滌5min4次。11、BCIP/NBT顯色，核固紅復(fù)染。13、風干，水溶性封片劑封片。二、石蠟切片1、常規(guī)脫蠟至水。2、3%過氧化氫室溫處理10min，蒸餾水洗5min2次.3、暴露暴露mRNA核酸片段。胃蛋白酶37消化10-30min，0.5MTBS洗滌5min3次，蒸餾水洗滌1次。4、其余步驟和冰凍切片4-13步相同。,三、結(jié)果觀察陽性細胞的胞漿著色呈深藍色或藍紫色，細胞核著色呈紅色（圖片）四、注意事項1、石蠟切片水合時所用的不同濃度酒精用0.1%DEPC水配制。2、緩沖液配制時要用滅菌水來配。3、實驗過程中所用的3%檸檬酸需現(xiàn)配現(xiàn)用。4、在冰凍切片原位雜交實驗中最重要的組織及細胞的及時固定，并在固定液中加入0.1%的DEPC水處理，以抑制RNA酶對mRNA的分解作用。5、石蠟切片脫蠟時要用新的二甲苯浸泡，不能要以前浸泡過切片的二甲苯脫蠟。,返回,microRNA原位雜交圖片,返回,熒光原位雜交（FISH）,熒光原位雜交技術(shù)(florescenceinsituhybridization，F(xiàn)ISH)是一種利用熒光信號對原位雜交樣本進行檢測的技術(shù)。它將熒光信號的高靈敏度、安