應(yīng)用酵母單雜交技術(shù)篩選BmNPV多角體基因啟動(dòng)子結(jié)合蛋白

1、應(yīng)用酵母單雜交技術(shù)篩選BmNPV多角體基因啟動(dòng)子結(jié)合蛋白 應(yīng)用酵母單雜交技術(shù)篩選 BmNPV 多角體基因啟動(dòng)子結(jié)合蛋白李佳1高珍1王美惠1陳健1呂正兵1聶作明1張耀洲12于威1510152025303540451 浙江理工大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院杭州 3100182 天津市國(guó)際生物醫(yī)藥聯(lián)合研究院天津 300457摘要本研究以家蠶桿狀病毒BmNPV為研究對(duì)象篩選其多角體基因高效轉(zhuǎn)錄過(guò)程中與啟動(dòng)子序列相互作用的結(jié)合蛋白通過(guò)提取感染 BmNPV 第 5 天的家蠶五齡蟲脂肪體組織的總RNA利用 RT-PCR 技術(shù)建立了家蠶五齡幼蟲組織的基因表達(dá)文庫(kù)同時(shí)設(shè)計(jì)并合成了用于調(diào)控因子篩選的多角體基因啟動(dòng)子關(guān)鍵序列采用

2、酵母單雜交系統(tǒng)從構(gòu)建的家蠶組織 cDNA 文庫(kù)中篩選與該基因啟動(dòng)子相互作用的蛋白因子經(jīng)過(guò)多輪篩選后共獲得 12 個(gè)陽(yáng)性克隆仍保持 AbA 抗性提取相應(yīng)酵母菌單克隆中的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)它們分別屬于 2 個(gè)不同蛋白的 cDNA 克隆進(jìn)一步對(duì)篩選出的 cDNA 序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)它們分別編碼宿主來(lái)源的核糖體蛋白 RPSAribosome protein derivedRPSA和 BmNPV 來(lái)源的核型多角體病毒 DNA 結(jié)合蛋白DBP為進(jìn)一步驗(yàn)證篩選出的蛋白因子 RPSA 和 DBP 對(duì)多角體基因啟動(dòng)子活性的影響分別將 RPSA 和 DBP 基因插入瞬時(shí)表達(dá)載體 pSK-IE 中轉(zhuǎn)染 B

3、mN 細(xì)胞24h 后感染重組病毒 Bacmid-Luc然后檢測(cè)熒光素酶的表達(dá)量結(jié)果表明 RPSA 蛋白和 DBP 蛋白對(duì)多角體基因轉(zhuǎn)錄均具有正調(diào)控作用RNAi 檢測(cè)結(jié)果表明 RPSA 和 DBP 干擾后對(duì)多角體基因轉(zhuǎn)錄水平均具有下調(diào)作用本研究工作從分子水平探索了多角體基因啟動(dòng)子高效轉(zhuǎn)錄表達(dá)的作用機(jī)制為今后深入研究桿狀病毒啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄機(jī)制奠定了基礎(chǔ)關(guān)鍵詞分子生物學(xué)BmNPV酵母單雜交系統(tǒng)多角體啟動(dòng)子DNA 結(jié)合蛋白轉(zhuǎn)錄調(diào)控中圖分類號(hào)Q78Screening of Proteins Binding with polh Promoter ofBmNPV by Yeast One-hybrid Syst

4、emLi Jia1 Gao Zhen1 Wang Meihui1 Chen Jian1 Lv Zhengbing1 Nie Zuoming1Zhang Yaozhou12 Yu Wei1 1 Zhejiang science and technology university HangZhou 3100182 Tianjin Intemational Joint Academy of Biotechnology Medicine TianJin 300457 Abstract Polyhedrin gene promoter plays an essential role in regulat

5、ing foreign gene expressionin BEVS but the high-level transcription mechanism is still unknown One-hybrid screening inyeast is a powerful method to rapidly identify heterologous transcription factors that can interactwith polyhedron promoter DNA sequence Total RNA was extracted from silkworm fat bod

6、y offifth instar larvae infected by BmNPV for five days cDNA for silkworm gene expression libraryconstruction was generated by RT-PCR technique Key polyhedron promoter bait sequence wassynthesized to generate the bait yeast strain which was used to screen the one-hybird cDNA libray12 positive yeast

7、colonies were obtained from SD-LeuAbA plates sequencing analysis showedthat they belong to 2 different protein cDNA colonies They were known as ribosomal proteinsRPSA and nuclear polyhedrosis virus DNA-binding protein DBP In order to further verify theregulation function of RPSA and DBP RPSA and DBP

8、 gene were inserted into transientexpression vector pSK-IE respectively Then recombinant vector was transfected to BmN cells24 hours later which have been infected by a recombinant virus of Bacmid-Luc Our resultsshowed that transient expression of RPSA and DBP could up-regulated the transcription le

9、vel ofluciferase gene RNAi assay results also indicated that interference referred to the inhibition ofRPSA and DBP expression could down-regulated the transcription level of luciferase gene This基金項(xiàng)目本研究由國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃863項(xiàng)目2011AA100603浙江省錢江人才計(jì)劃項(xiàng)目QJD0702014和浙江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目Y3090339共同資助作者簡(jiǎn)介李佳1985-女碩士基因表達(dá)與調(diào)控通信聯(lián)

10、系人于威女副教授基因表達(dá)與調(diào)控 E-mail yuwei7198ycom-1-work studied the high-level transcription mechanism of polyhedron promoter and it will provide anew way for further study baculovirus transcriptional mechanismKeywords Molecular biology BmNPV Yeast One-hybrid System Polyhedrin promoterDNA-binding Protein Transc

11、ription regulation500 引言昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)Baculovirus Expression Vector System簡(jiǎn)稱 BEVS自二十世紀(jì) 80 年代問(wèn)世以來(lái)已被公認(rèn)為當(dāng)代四大真核表達(dá)系統(tǒng)之一特別是其超高效表達(dá)能力安全性易操作性更引人關(guān)注1 近年來(lái)昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)已成為生產(chǎn)與研究各種556065707580原核和真核蛋白的有力而普及的工具但目前該表達(dá)系統(tǒng)高效啟動(dòng)外源基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的作用機(jī)制還不十分清楚2-3該系統(tǒng)通常采用桿狀病毒極晚期基因多角體蛋白啟動(dòng)子來(lái)啟動(dòng)外源基因的表達(dá)而基因差異表達(dá)的主要作用機(jī)制是基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控4是由轉(zhuǎn)錄因子與位于基因上游啟動(dòng)子序列的 DNA

12、順式元件的相互結(jié)合來(lái)控制因此研究多角體基因啟動(dòng)子結(jié)合蛋白對(duì)于闡明家蠶桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)高效表達(dá)機(jī)制具有重要意義酵母單雜交技術(shù)是目前常用的一種體外用于分析 DNA 與蛋白質(zhì)相互作用的既簡(jiǎn)單又高效的研究方法通過(guò)對(duì)報(bào)告基因的表型檢測(cè)分析 DNA蛋白之間的相互作用是在細(xì)胞內(nèi)分析轉(zhuǎn)錄因子與順式作用元件結(jié)合的有效方法本研究通過(guò)提取感染 BmNPV 5 天后的家蠶五齡蟲脂肪體組織的總 RNA通過(guò) RT-PCR 技術(shù)建立了家蠶五齡幼蟲脂肪體組織的基因表達(dá)文庫(kù)同時(shí)設(shè)計(jì)并合成了用于調(diào)控因子篩選的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子關(guān)鍵序列作為誘餌并將其轉(zhuǎn)化到酵母細(xì)胞中構(gòu)建了重組酵母菌株然后利用酵母單雜交系統(tǒng)從構(gòu)建的基因表達(dá)文庫(kù)中篩選能與多角

13、體啟動(dòng)子序列相結(jié)合的蛋白因子并對(duì)篩選出的蛋白因子的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用進(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證研究本研究將家蠶桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的高效轉(zhuǎn)錄及調(diào)控機(jī)制作為研究?jī)?nèi)容將不僅為昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的改造在理論上提供新依據(jù)同時(shí)也可能帶來(lái)經(jīng)濟(jì)效益1 材料和方法11 材料酵母菌株 Scerevisiae Y1HGold 購(gòu)自美國(guó) BD Clontech 公司最適生長(zhǎng)溫度為 30大腸桿菌菌株 E coli TG1DH5 和載體 pBluescript SK plus 為實(shí)驗(yàn)室保存含有熒光素酶luciferase報(bào)告基因的重組病毒 Bacmid-Luc 和含有 IE 啟動(dòng)子的瞬時(shí)表達(dá)載體質(zhì)粒 pSK-IE為本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存

14、MatchmakerTM Gold Yeast One-Hybrid Library Screening SystemKitMatchmaker Insert Check PCR Mix 1 LB 培養(yǎng)基YPDA 培養(yǎng)基和 SD 缺陷性培養(yǎng)基均購(gòu)自美國(guó) BD Clontech 公司RNAlaterRNA Stabilization Solution為 Ambion 公司產(chǎn)品Trizol 試劑盒為 Gibco 公司產(chǎn)品PolyATtract mRNA Isolation System T7Ribo Express RNAi System 和 Luciferase Assay System 購(gòu)自

15、Promega 公司質(zhì)粒載體pMD-18TT4 快速連接酶限制性內(nèi)切酶 XhoEcoR和 Hind 購(gòu)自 Takara 公司限制性內(nèi)切酶 BbsTaq 酶及相關(guān)試劑購(gòu)自 Fermentas 公司M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶為 Invitrogen公司產(chǎn)品引物序列和 BmNPV 啟動(dòng)子核心保守三重復(fù)序列片段3r和該保守序列的突變?nèi)貜?fù)序列3m由上海生工生物工程有限公司合成測(cè)序由上海桑尼生物工程公司完成-2-12 方法859095100105com 酵母單雜交系統(tǒng) cDNA AD 融合表達(dá)文庫(kù)cDNA AD fusion library的構(gòu)建家蠶五齡幼蟲脂肪體組織總 RNA 的提取取感染 BmNPV 第五

16、天的家蠶五齡幼蟲蠶體體表經(jīng) 75乙醇消毒后于 RNA Stabilization Solution 中解剖分離脂肪體取 100 mg 脂肪體組織加入液氮后在研缽中充分研磨轉(zhuǎn)移至離心管中加入 1mL Trizol 勻漿提取總 RNA具體操作方法參見 Trizol 試劑盒說(shuō)明書家蠶脂肪體組織 mRNA 的純化及濃縮采用 PolyATtract kit 的 SA-PMPs 磁珠柱純化mRNA具體操作步驟參照 Promega 公司產(chǎn)品說(shuō)明書進(jìn)行然后對(duì)純化的 mRNA 進(jìn)行濃縮用 110 乙酸鈉pH 52和同等體積的異丙醇于-20 1h16000g 離心 30min去上清加入 1mL 75乙醇重懸160

17、00g 離心 15min真空抽干用微量水溶解定量cDNA 第一鏈的合成取純化并定量的 mRNA 1L0025-10g poly A加入 1L CDSoligo-dTprimer 和 2L 去離子水72溫育 2 min 后置冰上加入下列混合液5First-Strand Buffer 2LDTT100mM1LdNTP mix10mM1L 和 SMART MMLVRT 1L混勻后42溫育 10min加入 1LBD SMART Oligo混勻42溫育 1h75放置 10min 終止反應(yīng)后降至室溫加入 1L RNase H2 units37溫育 20min-20保存?zhèn)溆美瞄L(zhǎng)距離 PCRlong dis

18、tance-PCRLD-PCR 技術(shù)合成 SMART cDNA取上述合成的 SMART cDNA 第一鏈 2L加入 70L 去離子水10L 10Advantage 2 PCR Buffer2L 50dNTP Mix2L 5 PCR Primer2L 3 PCR Primer10L Melting Solutiont 和 2L50Advantage 2 Polymerase Mix混合均勻后于 95 30S95 10S68 6mina26 cycles68 5min電泳檢測(cè)后于-20保存?zhèn)溆胊每運(yùn)行一個(gè)循環(huán)擴(kuò)增時(shí)間增加 5 sec雙鏈 cDNA 的純化利用 BD CHROMA SPINTM-40

19、0 Columns 純化雙鏈 cDNA以去除小片段加入 l10 體積的 3M NaAc 和 25 體積的 95乙醇-20沉淀 l h離心后去上清75乙醇洗滌兩次后干燥無(wú)菌水溶解100-150 ngL-20貯存?zhèn)溆胏om酵母誘餌報(bào)告子Yeast reporter的構(gòu)建靶序列三聚體誘餌的設(shè)計(jì)根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道家蠶桿狀病毒多角體啟動(dòng)子序列中含有一段110高度保守的區(qū)域rGCAAATAAATAAGTATT因此根據(jù)該保守序列設(shè)計(jì)了該序列的三重復(fù)片段3r同時(shí)設(shè)計(jì)了該保守序列的突變?nèi)貜?fù)序列3m作為對(duì)照3r 序列如下 5-CCGAAGCTTGCAAATAAATAAGTATTGCAAATAAATAAGTATTGCA

20、AATAAATAAGTATTCTCGAGGCCATGCCAT-3上下游分別含有 Hind 和 Xho I酶切位點(diǎn)用斜體表示及多角體啟動(dòng)子保守序列 r用下劃線表示 3r 序列下游引物序列為 5115-ATGGCATGGCCTCGAGAATAC-3 3m序 列 如 下 5 CCGAAGCTTACTTTCAGACTTGAGTTACTTTCAGACTTGAGTTACTTTCAGACTTGAGTTCTCGAGGCCATGCCAT-3 上下游分別含有 Hind 和 Xho I酶切位點(diǎn)用斜體表示及多角體啟動(dòng)子 保 守 區(qū) 域 的 突 變 序 列 m 用 下 劃 線 表 示 3m 序 列 下 游 引 物 序

21、列 為 GGCCTCGAGATTTATAGGTTT一步 PCR 合成目的雙鏈 DNA 片段的反應(yīng)條件為 951205min68 30min將合成的雙鏈目的片段用試劑盒回收方法詳見 promega 公司的 WizardRSV Gel and PCR Clean-Up System 試劑盒說(shuō)明重組誘餌質(zhì)粒的構(gòu)建將上述純化的 PCR 產(chǎn)物 3r 和 3m 分別插入 T 載體質(zhì)粒 pMD 18-T-3-再分別將重組質(zhì)粒 pMD 18-T-3r 和 pMD 18-T-3m 經(jīng) Hind 和 Xho雙酶切后插入質(zhì)粒pAbAi 中構(gòu)建重組誘餌質(zhì)粒 p3r-AbAi 和誘餌突變質(zhì)粒 p3m-AbAi測(cè)序進(jìn)行鑒

22、定重組質(zhì)125130135140粒 p53-AbAip3r-AbAi 和 p3m-AbAi 經(jīng) Bbs單酶切后經(jīng) Bbs單酶切后利用 promega PCR試回收劑盒純化-20貯存?zhèn)溆镁€性化的誘餌質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞取 LiAc 處理的酵母感受態(tài)細(xì)胞 Y1HGold 50L線性化的重組誘餌質(zhì)粒 2gYeast Carrier DNA 5L30溫育 30 min加入 20L DMSO混勻42 熱激 15min混勻后離心 15sec去上清用 1mL 09 NaCl 重懸取 100L 涂布于 SD-Ura 培養(yǎng)基于 30培養(yǎng)箱培養(yǎng) 35 天以線性化的誘餌突變質(zhì)粒 p3m-AbAi 作為陰性對(duì)照線性化的質(zhì)

23、粒 p53-AbAi 作為陽(yáng)性對(duì)照MatchmakerTM Gold Yeast One-Hybrid LibraryScreening System Kit 提供酵母誘餌報(bào)告子的 PCR 鑒定分別挑取 Y1HGoldp3r-AbAiY1HGoldp3m-AbAi和Y1HGoldp53-AbAi酵母菌落于 30培養(yǎng)過(guò)夜然后進(jìn)行 PCR 鑒定反應(yīng)體系如下25L重組菌液Matchmaker Insert Check PCR Mix 25L于 95 1 min98 10s55 30s68 2min30 個(gè)循環(huán)預(yù)期的 PCR 結(jié)果為陽(yáng)性組 PCR 產(chǎn)物大小應(yīng)為 14kb陰性組無(wú)條帶突變誘餌鏈135kb

24、 插入的誘餌基因片段大小酵母誘餌報(bào)告子的 AbAr 最小抑制濃度測(cè)定分別挑選上述各組中大而健康的酵母菌落每個(gè)菌落斑用 09 的 NaCl 重懸2000 個(gè)細(xì)胞100L將 100L 菌液分別涂布到以下培養(yǎng)基上SD-UraSD-Ura AbA100 ngmLSD-UraAbA200 ngmL和 SD-UraAbA300 ngmL然后于 30培養(yǎng) 23 天觀察菌落的生長(zhǎng)情況com利用酵母單雜交系統(tǒng)篩選結(jié)合蛋白分 別 制 備 酵 母 感 受 態(tài) 細(xì) 胞 Y1HGoldp53-AbAi Y1HGoldp3m-AbAi 和Y1HGoldp3r-AbAi方法同前取 com 中利用 SMART PCR 合成的

25、 ds cDNA 2-5g加145150入感受態(tài)細(xì)胞 Y1HGoldp3r-AbAi 600LPGELiAc 25mLpGADT7-RecSma線性化的3g陰性對(duì)照組中加入感受態(tài)細(xì)胞 Y1HGoldp3m-AbAi 600LPEGLiAc 25mLPGADT7-RecSma線性化的3g陽(yáng)性對(duì)照組中加入感受態(tài)細(xì)胞 Y1HGoldp53-AbAi50Lp53 fragment 100ngpGADT7-RecSma線性化的1g30溫浴 4 min混勻 15min次然后加入 160mL DMSO42 熱激 30min混勻后 700g 離心 5min去上清用 3mL的 YPDA 液體培養(yǎng)基重懸30 25

26、0rpm 搖床培養(yǎng) 90min700g 離心 5 min用 3mL 09 NaCl重懸取 100L 涂布于 SD-Leu 和 SD-LeuAbA培養(yǎng)基AbA中的是指誘餌報(bào)告子酵母鏈抗性篩選時(shí)的濃度于 30培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 35 天篩選出的酵母菌落單克隆于SD-LeuAbA平板上加樣重復(fù)篩選經(jīng)過(guò) 2-4 天培養(yǎng)如果克隆可以長(zhǎng)成單個(gè)的健康的單克隆即為陽(yáng)性克隆然后對(duì)上述驗(yàn)證的陽(yáng)性克隆抽提質(zhì)粒 DNA進(jìn)行測(cè)序分析155com結(jié)合蛋白因子核糖體蛋白 SARPSA和 DNA 結(jié)合蛋白DBP的功能分析RPSA 和 DBP 的生物信息學(xué)分析測(cè)序結(jié)果運(yùn)用 NCBI comnihgov上的相關(guān)程序或軟件進(jìn)行核酸及蛋白

27、質(zhì)序列的同源性比較和結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析RPSA 和 DBP 的 RNAi 分析160RPSA dsRNA 的合成為了獲得合成 dsRNA 的體外模板需要目的基因 ORF 分別以正向 和 反 向 連 接 在 T7 啟 動(dòng) 子 下 游 因 此 合 成 了 Pa Pb 兩 條 引 物 Pa GGATCCTAATACGACTCACTATAGGATGTCGGGAGGATTAGACGTPb-4-GGATCCTAATACGACTCACTATAGGTTATGCAGCACTCCAGTCTT下劃線部分為 T7promoterRPSA基因的下游引物P1的序列為1651705-CCGGAATTCATGTCGGGAGGATT

28、AG-3 下 游 引 物 序 列 P2 的 序 列 為 5-CCGCTCGAGTTATGCAGCACTCCAG-3將 Pa 和 P2 設(shè)為第一對(duì)引物再將 Pb 和 P1設(shè)為第二對(duì)引物隨后分別以提取的 cDNA 為模板進(jìn)行 PCR獲得合成 dsRNA 的正向模板和反向模板按照 Promega 試劑盒 T7 Ribo Express RNAi System說(shuō)明書合成 dsRNA并測(cè)定 dsRNA 的濃度dsRNA 濃度 OD26040稀釋倍數(shù) gmLDBP dsRNA 的合成為了獲得合成 dsRNA 的體外模板需要目的基因 ORF 分別以正向 和 反 向 連 接 在 T7 啟 動(dòng) 子 下 游 因

29、此 合 成 了 Pc Pd 兩 條 引 物 Pc GGATCCTAATACGACTCACTATAGGATGGTTTATCGTCGCCGTCGPdGGATCCTAATACGACTCACTATAGGTTAATAGTAGCGTGTTCTGT下劃線部分為 T7promoterDBP 基因的下游引物 P3 的序列為5- CCGGAATTCATGGTTTATCGTCGCC-3175180185190195200下游引物序列 P4 的序列為5- CCGCTCGAGTTAATAGTAGCGTGTTCT-3將 Pc 和 P4設(shè)為第一對(duì)引物再將 Pd 和 P3 設(shè)為第二對(duì)引物隨后分別以提取的 cDNA 為模板進(jìn)行

30、 PCR獲得合成 dsRNA 的正向模板和反向模板按照 Promega 試劑盒 T7 Ribo Express RNAiSystem 說(shuō)明書合成 dsRNA并測(cè)定 dsRNA 的濃度dsRNA 濃度 OD26040稀釋倍數(shù)gmLRNAidsRNA 的轉(zhuǎn)染將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的 BmN 細(xì)胞鋪 12 孔板每孔細(xì)胞數(shù)為 5105培養(yǎng)過(guò)夜脂質(zhì)體包埋上述合成的 RPSA 或 DBP dsRNA 轉(zhuǎn)染培養(yǎng)細(xì)胞繼續(xù)于 27培養(yǎng) 1天后重組病毒 Bacmid-Luc 以 MOI 10 感染細(xì)胞于 27繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞 48h待細(xì)胞發(fā)病后收集細(xì)胞PBS 洗細(xì)胞后加入 200L 細(xì)胞裂解液lysis buffer120

31、00g 離心 15s取上清液稀釋 5 倍后取 5L 加入 96 孔板再加入 100L Luciferase Assay Reagent 混勻后用化學(xué)發(fā)光儀檢測(cè)其發(fā)光值同時(shí)以正常細(xì)胞作為空白對(duì)照以感染重組病毒 Bacmid-Luc 的細(xì)胞作為陰性對(duì)照用熒光素酶作為報(bào)告基因用于定量檢測(cè) RPSA 和 DBP RNAi 對(duì)多角體啟動(dòng)子啟動(dòng)活性的影響RPSA 和 DBP 的瞬時(shí)表達(dá)分析瞬時(shí)表達(dá)載體 pSK-IE-RPSA 或 pSK-IE-DBP 的轉(zhuǎn)染將目的基因 RPSA 或 DBP 經(jīng)EcoR和 Xho雙酶切后插入質(zhì)粒 pSK-IE構(gòu)建重組瞬時(shí)表達(dá)質(zhì)粒 pSK-IE-RPSA 或pSK-IE-DB

32、P將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的 BmN 細(xì)胞鋪 12 孔板每孔細(xì)胞數(shù)為 5105培養(yǎng)過(guò)夜利用脂質(zhì)體包埋瞬時(shí)表達(dá)質(zhì)粒 pSK-IE-RPSA 或 pSK-IE-DBP 后轉(zhuǎn)染 BmN 細(xì)胞于 27培養(yǎng)1 天后感染重組病毒 Bacmid-Luc于 27繼續(xù)培育細(xì)胞待 48h 左右細(xì)胞發(fā)病后收集細(xì)胞檢測(cè)熒光強(qiáng)度檢測(cè)方法同 com2以正常細(xì)胞作為空白對(duì)照以感染重組病毒Bacmid-Luc 的細(xì)胞作為陰性對(duì)照2 結(jié)果與分析21 酵母單雜交系統(tǒng)篩選 cDNA 文庫(kù)的構(gòu)建利用感染 BmNPV 第五天的家蠶五齡幼蟲脂肪體組織提取總 RNAmRNA 經(jīng)濃縮后作為合成 cDNA 第一鏈的模板經(jīng) RT-PCR 技術(shù)合成 SM

33、ART cDNA 第一鏈然后利用 LD-PCR技術(shù)獲得雙鏈 SMART cDNA再經(jīng) CHROMA SPINTMTE-400 Columns 純化去除小于400bp 的小片段結(jié)果如圖 1 所示從圖中可以看出經(jīng)純化后的 SMART cDNA 片段大小-5-主要分布于 5003000bp 之間205210215220圖 1家蠶脂肪體 cDNA 及過(guò)柱純化的 cDNAFig1 Fat-body cDNA of silkworm and A column purification cDNAM15K Marker1脂肪體 cDNA2過(guò)柱純化的 cDNAM15K Marker 1Fate-body cDN

34、A 2A column purification cDNA22 酵母誘餌報(bào)告子Yeast reporter的構(gòu)建及鑒定根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道設(shè)計(jì)并合成了含有家蠶桿狀病毒多角體啟動(dòng)子序列高度保守區(qū)域的三重復(fù)序列 3r 和陰性對(duì)照組突變?nèi)匦蛄?3m然后通過(guò)一步 PCR 法合成目的雙鏈 DNA 片段片段大小為 77bpPCR 產(chǎn)物電泳圖譜如圖 2 所示從圖中可以看出片段大小與預(yù)期結(jié)果相一致圖 23r 和 3m 的一步 PCR 產(chǎn)物Fig2 The PCR product of 3r and 3m by one step PCRM20 bp DNA Marker13r 一步 PCR 回收產(chǎn)物23m 一步 PC

35、R 回收產(chǎn)物M 20 bp DNA Marker 1 PCR product of 3r by one step PCR 2 PCR product of 3m by one step PCR然后將 3r 和 3m 序列經(jīng) Hind 和 Xho雙酶切后插入質(zhì)粒 pAbAi 中構(gòu)建重組誘餌質(zhì)粒 p3r-AbAi 和誘餌突變質(zhì)粒 p3m-AbAi重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定圖譜如圖 3 所示p3r-AbAi和 p3m-AbAi 的測(cè)序結(jié)果表明序列完全正確-6-225230235240圖3重組質(zhì)粒p3r-AbAi和p3m-AbAi的酶切鑒定Fig3 The identification of recombi

36、nant plasmid p3r-AbAi and p3m-AbAi by double restriction enzymes digestionM1M2DNA Marker1重組質(zhì)粒p3r-AbAi的Hind 和Xho 雙酶切產(chǎn)物2重組質(zhì)粒p3m-AbAi的Hind和Xho 雙酶切產(chǎn)物M1M2 DNA Marker 1 Recombinant plasmid p3r-AbAi digested with Hind and Xho 2 Recombinantplasmid pAbAi-3m digested with Hind and Xho 重組線性化質(zhì)粒 p53-AbAip3r-AbAi

37、 和 p3m-AbAi 轉(zhuǎn)化酵母 Scerevisiae 感受態(tài)細(xì)胞Y1HGold 通 過(guò) 同 源 重 組 分 別 形 成 酵 母 誘 餌 報(bào) 告 子 Y1HGoldp3r-AbAi 和Y1HGoldp3m-AbAi分別挑取大而健康的酵母菌落進(jìn)行 PCR 鑒定鑒定結(jié)果如圖 4 所示從圖中可以看出陽(yáng)性對(duì)照酵母菌落 Y1HGoldp53-AbAiPCR 產(chǎn)物大小為 14 kb陰性組無(wú)條帶酵母菌落 Y1HGoldp3r-AbAi和 Y1HGoldp3mut-AbAi的 PCR 產(chǎn)物大小應(yīng)均為 1425 kb與預(yù)期大小相符圖 4酵母誘餌報(bào)告子的 PCR 鑒定Fig4 The identificatio

38、n of bait-report yeast strains by PCRM15K DNA Marker1報(bào)告子 Y1HGoldp53-AbAi的菌液 PCR 產(chǎn)物2報(bào)告子 Y1HGoldp3r-AbAi的菌液 PCR 產(chǎn)物3報(bào)告子 Y1HGoldp3m-AbAi的菌液 PCR 產(chǎn)物M 15K DNA Marker 1PCR product of Y1HGold p53-AbAi reporter yeast strain 2PCR product of Y1HGoldp3r-AbAi reporter yeast strain 3PCR product of Y1HGold p3m-AbAi

39、245最低抗性測(cè)定結(jié)果如圖 5 所示根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定各種酵母誘餌報(bào)告子的 AbAr 最小抑制濃度以 SD-Ura AbA200 作為 Y1HGoldp53-AbAi陽(yáng)性反應(yīng)的篩選條件SD-Ura AbA300作為 Y1HGoldp3r-AbAi和 Y1HGoldp3m-AbAi的陽(yáng)篩選條件-7-250255260265圖5誘餌報(bào)告子AbAr表達(dá)的抗性測(cè)定Fig5 Testing the bait strain for AbAr expression23 利用酵母單雜交系統(tǒng)對(duì) cDNA AD 融合表達(dá)文庫(kù)的篩選將通過(guò) SMART cDNA 和線性化質(zhì)粒 pGADT7-Rec 分別轉(zhuǎn)化酵母誘餌報(bào)告

40、子感受態(tài)細(xì)胞Y1HGoldp3r-AbAi和 Y1HGoldp3m-AbAi然后分別涂布于 SD-Leu 和 SD-LueAbA培養(yǎng)平板上為 22 中測(cè)定的酵母誘餌報(bào)告子的 AbAr 最小抑制濃度以轉(zhuǎn)化 p53 fragment 100ng和線性化質(zhì)粒 pGADT7-Rec 的 Y1HGoldp53-AbAi的感受態(tài)細(xì)胞作為陽(yáng)照篩選結(jié)果如圖 6所示從圖中可以看出各組酵母誘餌報(bào)告子均可在 SD-Leu 培養(yǎng)基上生長(zhǎng)表明三種質(zhì)粒p53-AbAip3m-AbAi 和 p3r-AbAi 均成功導(dǎo)入酵母基因組中Y1HGoldp53-AbAi在培養(yǎng)基SD-Leu 上正常生長(zhǎng)在 SD-Leu AbA300

41、以上基本不生長(zhǎng)與預(yù)期結(jié)果相符陰性對(duì)照組在SD-Leu 培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好而在 SD-LueAbA培養(yǎng)基上基本不生長(zhǎng)而 Y1HGoldp3r-AbAi在 SD-Leu 和 SD-LueAbA300 培養(yǎng)基均可生長(zhǎng)圖6酵母單雜交系統(tǒng)cDNA文庫(kù)的篩選Fig6 Screening of One-Hybrid Library-8-24 結(jié)合因子的鑒定及生物信息學(xué)分析結(jié)合因子的鑒定結(jié)合因子經(jīng)多次涂布于 SD-LeuAbA300 培養(yǎng)基反復(fù)篩選后獲得 12個(gè)酵母菌落的陽(yáng)性克隆經(jīng)測(cè)序分析以及序列的同源比對(duì)除去幾個(gè)重復(fù)因子后最終篩選270275280285到 2 個(gè)蛋白結(jié)合因子分別是核糖體蛋白 SARPSA和一

42、個(gè)核型多角體病毒 DNA 結(jié)合蛋白DBPRPSA 基因的生物信息學(xué)分析RPSA 基因的 ORF 框含有 921bp 的堿基306 個(gè)氨基酸編碼的蛋白質(zhì)預(yù)測(cè)為 334KD等電點(diǎn)預(yù)測(cè)為 479通過(guò) ExPASy 的 ProtScale 在線對(duì) RPSA蛋白進(jìn)行疏水性分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)該蛋白的疏水性最大值為 2344最小值為-3244分值越大說(shuō)明疏水性越強(qiáng)其中在 210-220 區(qū)域的氨基酸表現(xiàn)出較強(qiáng)的親水性其他區(qū)域的氨基酸殘基既有表現(xiàn)出疏水性也有表現(xiàn)出親水性用 NPS服務(wù)器的 GOR4 程序?qū)υ摶虮磉_(dá)的氨基酸進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)的分析結(jié)果顯示有 3725的 螺旋結(jié)構(gòu)4804無(wú)規(guī)則卷曲和1471延伸主鏈用 TM

43、HMM 服務(wù)器httpcomdkservicesTMHMM對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)該蛋白沒有跨膜結(jié)構(gòu)域也不存在信號(hào)肽RPSA 蛋白的氨基酸序列與金堇蛺蝶詩(shī)神袖蝶赤擬谷盜熊蜂鳳仙花人體虱和大黃蜂的氨基酸序列的同源性分別為 8887696882和 67DBP 基因的生物信息學(xué)分析DBP 基因的 ORF 框含有 198bp 的堿基編碼 65 個(gè)氨基酸分子量約為 808kD等電點(diǎn)預(yù)測(cè)為 1246對(duì) DBP 蛋白進(jìn)行疏水性分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)該蛋白的疏水性最大值為 0067最小值為-3044其中除了 1215 區(qū)域的氨基酸表現(xiàn)出較弱的親水性之外其他區(qū)域的氨基酸殘基大都表現(xiàn)出較強(qiáng)的親水性對(duì)該蛋白的跨膜區(qū)信號(hào)

44、肽的分析結(jié)果表明該蛋白存在跨膜區(qū)的可能性不大不是跨膜蛋白也沒有信號(hào)肽的存在DBP 蛋白的氨基酸序列與野桑蠶核型多角體病毒云山卷葉蛾核型多角體病毒 DBP 蛋白的氨基酸序列的同源性分別為 98和 5825 結(jié)合因子的功能分析290comRPSA 和 DBP 的 RNAi 分析利用 Promega 的 T7 Ribo Express RNAi System 體外合成的 RPSA 或 DBP dsRNA脂質(zhì)體包埋合成的 dsRNA 轉(zhuǎn)染培養(yǎng)細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng) 1 天后以重組病毒 Bacmid-Luc 感染細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng) 48 h 后裂解細(xì)胞取其上清液用化學(xué)發(fā)光儀進(jìn)行定量檢測(cè)結(jié)果如圖 7 所示從圖中可以看出正

45、常細(xì)胞陰性對(duì)照組細(xì)胞的發(fā)光值很低病毒 Bacmid-Luc 感染的細(xì)胞陽(yáng)性295對(duì)照組發(fā)光值最高與陽(yáng)性對(duì)照組相比RNAi 組的發(fā)光值明顯下降具有顯著差異P005表明 RPSA 和 DBP 的 dsRNA 能夠干擾病毒多角體啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性-9-圖 7DBP 和 RPSA 的 RNAi 分析300comFig7 The RNAi assay of DBP and RPSARPSA 和 DBP 的瞬時(shí)表達(dá)對(duì) BmNPV 多角體基因啟動(dòng)子活性的影響成功構(gòu)建瞬時(shí)表達(dá)質(zhì)粒 pSK-IE-RPSA 和 pSK-IE-DBP將瞬時(shí)表達(dá)質(zhì)粒 pSK-I E-RPSA或 pSK-IE-DBP 用脂質(zhì)體包埋轉(zhuǎn)染細(xì)

46、胞 1 天后以重組病毒 Bacmid-Luc 感染細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng) 48 h 后裂解細(xì)胞取其上清液用化學(xué)發(fā)光儀進(jìn)行定量檢測(cè)結(jié)果如圖 11 所示圖中顯示305與只感染重組病毒 Bacmid-Luc 的細(xì)胞相比同時(shí)轉(zhuǎn)染了瞬時(shí)表達(dá)質(zhì)粒 pSK-IE-RPSA 的細(xì)胞發(fā)光值顯著增強(qiáng)說(shuō)明 RPSA 和 DBP 能夠增強(qiáng)多角體啟動(dòng)子的啟動(dòng)活性圖 8熒光素酶活性檢測(cè)Fig8 The results of luciferase assay3103 討論家蠶 BEVS 已成為廣泛用于生產(chǎn)與研究各種原核和真核蛋白的有力工具該系統(tǒng)通常采用桿狀病毒極晚期基因多角體蛋白啟動(dòng)子來(lái)啟動(dòng)外源基因的表達(dá)而基因的表達(dá)是由來(lái)源于宿主或

47、病毒的轉(zhuǎn)錄因子與位于基因上游啟動(dòng)子序列的 DNA 順式元件的相互結(jié)合來(lái)控制因315此研究多角體基因啟動(dòng)子 DNA 序列的結(jié)合蛋白對(duì)于闡明該系統(tǒng)高效表達(dá)機(jī)制的具有重要的意義- 10 -酵母單雜交技術(shù)廣泛用于 DNA 與蛋白相互作用的研究Ishida et al 2000 Melegari et al1998通過(guò)對(duì)酵母細(xì)胞內(nèi)報(bào)告基因表達(dá)狀況的分析來(lái)鑒別 DNA 結(jié)合位點(diǎn)并發(fā)現(xiàn)潛在的結(jié)合蛋白基因或?qū)?DNA 結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行分析運(yùn)用此技術(shù)能篩選到與 DNA 結(jié)合的蛋白320325330335340345350355質(zhì)并可直接從基因文庫(kù)中得到編碼該蛋白質(zhì)的核苷酸序列而無(wú)需復(fù)雜的蛋白質(zhì)分離純化操作故在蛋白研

48、究中具有一定的優(yōu)勢(shì)而且酵母屬真核細(xì)胞通過(guò)酵母系統(tǒng)得到的結(jié)果比其他體外技術(shù)獲得的結(jié)果更能體現(xiàn)真核細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)調(diào)控的真實(shí)情況酵母單雜交系統(tǒng)中酵母單雜交篩庫(kù)的構(gòu)建是獲取可以和誘餌序列相互作用的反式作用因子的關(guān)鍵因此在本文中我們從感染 BmNPV 第五天的家蠶五齡幼蟲脂肪體組織中提取總 RNAmRNA 經(jīng)純化后利用 LD-PCR 合成用于構(gòu)建酵母單雜交系統(tǒng) cDNA AD 融合表達(dá)文庫(kù)含有 SMART接頭的雙鏈 cDNA利用該文庫(kù)篩選 BmNPV 多角體啟動(dòng)子結(jié)合蛋白將不僅包括來(lái)源于宿主的啟動(dòng)子調(diào)控蛋白也包括病毒來(lái)源的啟動(dòng)子調(diào)控蛋白目前關(guān)于桿狀病毒極晚期基因 polh 啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的研究報(bào)道較

49、多如 Todd J W等研究發(fā)現(xiàn)很多病毒的晚期表達(dá)因子LEF均可以通過(guò)與宿主細(xì)胞因子相互作用促進(jìn)多角體蛋白基因的表達(dá)Todd JWMcLachlin JR 等研究發(fā)現(xiàn)病毒的極晚期表達(dá)因子VLF-1可具有調(diào)節(jié)桿狀病毒極晚期基因的表達(dá)的作用5但目前還沒有明確的證據(jù)表明它們具有直接參與 polh 啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控的作用Ghosh S 等還研究發(fā)現(xiàn)了一種來(lái)自于宿主的多角體基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子多角體啟動(dòng)子結(jié)合蛋白Polyhedrin Promoter Binding ProteinPPBP當(dāng)在體內(nèi)清除了 PPBP 蛋白因子將會(huì)導(dǎo)致多角體啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的熒光素酶報(bào)告表達(dá)消失證明了 PPBP 對(duì)病毒多角體啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)

50、錄具有調(diào)控作用家蠶多角體基因啟動(dòng)子序列全長(zhǎng)為 129bp根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道其核心啟動(dòng)子活性的主要存在于基因上游-44-51 的 8 個(gè)核苷酸序列TAAGTATT其中的任何堿基突變都將導(dǎo)致下游基因轉(zhuǎn)錄活性下降 10002000 倍6而基因上游-52-60 位核苷酸的改變將導(dǎo)致表達(dá)量下降 4 倍7因此我們?cè)O(shè)計(jì)了并合成由 17bp 組成的多角體基因啟動(dòng)子保守區(qū)域-44-60的三重復(fù)序列 3r并將三重復(fù)序列導(dǎo)入酵母基因組中構(gòu)建了誘餌報(bào)告子 Y1HGoldp3r-AbAi然后從構(gòu)建的酵母單雜交系統(tǒng) cDNA AD 融合表達(dá)文庫(kù)中篩選能與三重復(fù)啟動(dòng)子序列相互作用的蛋白因子經(jīng)多次重復(fù)篩選獲得 12 個(gè)酵母細(xì)胞株經(jīng)

51、測(cè)序驗(yàn)證最終確定了 2 個(gè)陽(yáng)性的結(jié)合蛋白因子核糖體蛋白 SARPSA和桿狀病毒 DNA 蛋白結(jié)合因子DPB其中RPSA 來(lái)自于宿主而 DPB 來(lái)自于病毒RPSA 最初被命名為 37kDa 的層粘連蛋白受體和 precursor67kDa 層粘連蛋白受體LRP LR8-9是一種多功能的蛋白R(shí)PSA 可作為層粘連蛋白的細(xì)胞表面受體和將細(xì)胞粘附于基底膜并對(duì)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)激活起著一定的作用10-12關(guān)于桿狀病毒 DBP 的首次報(bào)道是將該蛋白從家蠶核型多角體病毒感染的細(xì)胞純化后發(fā)現(xiàn)其具有單鏈 DNA 結(jié)合蛋白的性質(zhì)雖然其在病毒復(fù)制中的作用還不十分清楚13然而目前還沒有報(bào)告顯示 RPSA 和 DBP 參與桿

52、狀病毒極晚期基因的表達(dá)調(diào)控根據(jù)上述結(jié)合蛋白因子的測(cè)序結(jié)果以家蠶脂肪體組織 cDNA 為模板克隆了目的基因 RPSA 和 DBP構(gòu)建瞬時(shí)表達(dá)載體 pSK-IE-RPSA 或 pSK-IE-DBP并利用脂質(zhì)體包埋后轉(zhuǎn)染家蠶 BmN 細(xì)胞中進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)24h 后將構(gòu)建的重組病毒 Bacmid-Luc 感染家蠶培養(yǎng)細(xì)胞48h 后檢測(cè)蛋白因子 RPSA 或 DBP 對(duì)病毒多角體啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用經(jīng)化學(xué)發(fā)光儀檢測(cè)結(jié)果表明 RPSA 和 DBP 蛋白可增強(qiáng)病毒多角體啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性同時(shí)合成用于 RNAi的 RPSA 或 DBP 基因 dsRNA通過(guò)脂質(zhì)體包埋后轉(zhuǎn)入家蠶 BmN 細(xì)胞后檢測(cè)其對(duì)病毒多角體啟動(dòng)子轉(zhuǎn)

53、錄活性的影響結(jié)果顯示 RPSA 或 DBP dsRNA 能夠干擾病毒多角體啟動(dòng)子的- 11 -轉(zhuǎn)錄活性360365370375380385參考文獻(xiàn) References 1 呂鴻聲昆蟲病毒分子生物學(xué)M中國(guó)農(nóng)業(yè)科技出版社19932 Mans RM Knebel-Morsdorf D In vitro transcription of pe38polyhedrin hybrid promoters reveals sequencesessential for recognition by the baculovirus-induced RNA polymerase and for the strength of very late viralpromotersJ J Virol 1998 72 4 2991-29983 Hefferon KL Baculovirus late expression factorsJ J Mol Microbiol Biotechnol 2004 7 3 89-10