現(xiàn)代科技綜述知識文庫：單克隆抗體與雜交瘤技術(shù)

1、現(xiàn)代科技綜述系列單克隆抗體與雜交瘤技術(shù)科技是人類區(qū)別于動物的重要文明之一，是人類對自然規(guī)律研究和利用的學(xué)科。本文提供對科技基本概念“單克隆抗體與雜交瘤技術(shù)”的解讀，以供大家了解。單克隆抗體與雜交瘤技術(shù)1975年，克勒(GKoehler)和米爾斯坦(CMilstein)報(bào)道了用細(xì)胞雜交技術(shù)將小鼠骨髓瘤細(xì)胞與預(yù)先用抗原免疫的小鼠脾細(xì)胞(淋巴細(xì)胞)進(jìn)行融合，可產(chǎn)生能分泌預(yù)定的、單一特異性的抗體(單克隆抗體，簡稱單抗)的雜交瘤細(xì)胞。此后，此項(xiàng)技術(shù)在生物學(xué)、醫(yī)學(xué)的各個領(lǐng)域得到應(yīng)用，并為抗體產(chǎn)生和免疫球蛋白(Ig)遺傳控制及基因工程制造人單抗的研究提供有力的手段。1890年，貝林(EAVon Behrin

2、g)首先發(fā)現(xiàn)免疫動物血清中存在能特異性中和白喉毒素的抗體。其后人們試圖制造純一的抗體和分析機(jī)體對某種免疫原的抗體反應(yīng)。雜交瘤細(xì)胞由于繼承了雙親的特點(diǎn)，既保存了骨髓細(xì)胞能在組織培養(yǎng)中無限迅速增殖的特性，又繼承了親代B細(xì)胞能產(chǎn)生特異性抗體的特性。這一技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)為：(1)特異性高。(2)供應(yīng)量無限。(3)可用不純抗原進(jìn)行免疫獲得純抗體。(4)只要該抗原能在動物(如小鼠)中引起免疫反應(yīng)，就有可能獲得(拯救)所有特異性的抗體。(5)提高特異性B細(xì)胞的比例10100倍。(6)B雜交瘤能產(chǎn)生高分泌量的抗體，且與原B細(xì)胞是否高產(chǎn)無關(guān)。(7)抗體可以人工操縱、改造，如可將兩種特異性的雜交瘤再次融合產(chǎn)生能分泌雙特

3、異性抗體的雜交瘤。(8)此原理已成功地應(yīng)用到T細(xì)胞雜交瘤技術(shù)，以拯救T細(xì)胞的功能。下表簡要說明單抗應(yīng)用實(shí)例。表1 單抗應(yīng)用實(shí)例 有關(guān)雜交瘤技術(shù) (1)免疫方法：許多不同的免疫方法和程序均有成功的報(bào)告，值得一提的是1984年施皮茨(mspitz)的脾內(nèi)免疫法，如果采用不開腹手術(shù)注射法更便于推廣。此外，體外免疫法不僅對制造小鼠單抗有用，而更適合于制造人單抗。人B細(xì)胞體外免疫加氨基酸酯效果更為顯著。這可能是產(chǎn)生分泌人單抗雜交瘤的成功關(guān)鍵。(2)提高融合率：如1984年羅(MMSLo)等及1985年卡斯騰(UKarsten)等采用電融合法提高融合效應(yīng)。1986年以來，史良如等在融合前將骨髓瘤細(xì)胞注射于

4、小鼠皮下使之產(chǎn)生實(shí)體瘤，然后分離出瘤細(xì)胞進(jìn)行融合的“活體瘤”法，可提高融合的成功率。1983年，西拉剛尼安(RPsiranganian)等將加強(qiáng)免疫后的B細(xì)胞在融合前先注射到經(jīng)放射處理的小鼠中，使特異性B細(xì)胞率放大，產(chǎn)生特異性單抗的雜交瘤率提高50倍。也有用“抗原聚焦”融合法的，即將抗原共價(jià)結(jié)合到骨髓瘤細(xì)胞上再進(jìn)行融合，以提高特異性雜交瘤產(chǎn)生率。(3)改進(jìn)篩選方法：迅速、正確地篩選出所需雜交瘤并及時(shí)克隆化，是雜交瘤技術(shù)成功的又一關(guān)鍵，其方法可按要求而異，如只需高滴度的和高親和力的抗體，則可將雜交瘤上清液先稀釋10100倍，然后進(jìn)行篩選，以很快去掉低產(chǎn)者；如只需某些類、亞類的單抗，則可應(yīng)用特異性

5、抗該Ig類、亞類的標(biāo)記二抗來選擇。此外，熒光活化細(xì)胞分類儀(FACS)的應(yīng)用，大大加速了抗細(xì)胞表面單抗的篩選和分析。單抗的大量生產(chǎn)技術(shù) 雖然鼠類腹腔培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞的體內(nèi)法不適合工業(yè)化生產(chǎn)，且腹水抗體用于治療有很多缺點(diǎn)，因此極需發(fā)展單抗的體外培養(yǎng)法。生物反應(yīng)器、旋轉(zhuǎn)滾動瓶培養(yǎng)系統(tǒng)、全程序控制的旋轉(zhuǎn)瓶系統(tǒng)、微囊法、中孔纖維器及發(fā)酵罐培養(yǎng)法競相發(fā)展。微囊法是將雜交瘤細(xì)胞包于直徑為053mm的硅藻土的囊中(囊的外壁有半透膜)進(jìn)行培養(yǎng)，以生產(chǎn)純抗體，這是很好的主意，可惜有的雜交瘤不易成功。中孔纖維培養(yǎng)系統(tǒng)模擬體內(nèi)毛細(xì)血管原理，將幾百根很細(xì)的中孔纖維排列在圓柱體中，細(xì)胞在含有半透膜性質(zhì)的中孔纖維間隙生長，

6、其密度可達(dá)10108ml，是較有希望的方法。美國Bioresponse公司的牛淋巴液體外循環(huán)生產(chǎn)單抗法也是以此為基礎(chǔ)。目前，大規(guī)模生產(chǎn)單抗最成功的還是發(fā)酵罐培養(yǎng)法。英國Celltech公司1988年投產(chǎn)的氣升法發(fā)酵罐，年產(chǎn)量可達(dá)15kg單抗Ig。當(dāng)然、大規(guī)模生產(chǎn)單抗有賴于細(xì)胞培養(yǎng)液，特別是低血清和無血清培養(yǎng)液的發(fā)展。免疫毒素 它是細(xì)胞結(jié)合性抗體和毒素(細(xì)菌毒素，為假單胞菌外毒素A及白喉毒素等；植物毒素，如蓖麻毒A鏈)的耦聯(lián)物，在某些腫瘤的治療上獲得令人鼓舞的結(jié)果，理論上也適用于傳染病(如HIV感染)、真菌病和寄生蟲感染及自身免疫病的治療。特別是用于自身骨髓移植時(shí)清除惡性B細(xì)胞及同種異體骨髓移植

7、時(shí)去除供者骨髓中的T細(xì)胞可減少移植物抗宿主病(GVHD)，但對某些腫瘤，如乳腺癌、結(jié)腸癌等不那么理想。人單抗的研究 人單抗一直令人感興趣，其原因是：(1)對某些抗原(RhD HLA)，鼠類不能識別或反應(yīng)很差。(2)鼠類單抗作為腫瘤造影、腫瘤或自身免疫病等治療及被動免疫時(shí)，在人體內(nèi)可引起免疫反應(yīng)，清除單抗的作用和引起受體的副反應(yīng)。人單抗體內(nèi)應(yīng)用可大大減輕此弊病，而且更適合于人效應(yīng)細(xì)胞。此外，人單抗的研究可獲得有別于鼠類抗體庫的知識。1977年，舒泰尼茨(MSretnitz)第一個成功地獲得產(chǎn)生人單抗的永久化細(xì)胞系，但以后的進(jìn)展緩慢。關(guān)鍵是應(yīng)用常規(guī)的小鼠雜交瘤技術(shù)制造人單抗難以成功。因?yàn)橛脕砣诤系?/p>

8、人淋巴細(xì)胞多來自外周血淋巴細(xì)胞(PBL)，其活化的淋巴母細(xì)胞比例太低；人免疫方法受限制；缺乏合適的人融合伙伴；應(yīng)用人骨髓瘤細(xì)胞系進(jìn)行融合成功者不多，只有兩組報(bào)道，如1980年奧爾桑(LOlsson)和卡普蘭(HSKaplan)融合U266ARl和人脾細(xì)胞(以前免疫過的供者)獲得抗DNP中抗原的IgG抗體。最早采用且現(xiàn)仍應(yīng)用的EB(EpsteinBarr)病毒轉(zhuǎn)化技術(shù)可使B細(xì)胞活化、分裂，以制造分泌抗細(xì)菌、病毒、血細(xì)胞(第1個人單抗，即舒泰尼茨報(bào)告的抗RhD單抗，即用此法制備)、腫瘤細(xì)胞和自身抗原的抗體。但轉(zhuǎn)化的B細(xì)胞比例和抗體產(chǎn)量低，且細(xì)胞系不穩(wěn)定。近年來，也有不少人采用人淋巴樣細(xì)胞系(LCL

9、)作為融合伙伴，如GM 1500及由此派生的KR4、KR12；WIL2729HF2和1991年蘭加帕(NRangappa)等從此系又衍化出的HOA1、HOA20。不少學(xué)者也試圖用小鼠骨髓細(xì)胞作為融合伙伴，產(chǎn)生異種雜交瘤，但人染色體2(含K鏈基因)常優(yōu)先丟失。因此，有人又設(shè)想先將人的和小鼠的骨髓瘤細(xì)胞融合成為異種骨髓瘤細(xì)胞系，選擇出合適的融合伙伴，但至今人單抗技術(shù)仍不成熟，尋找合適的融合伙伴是當(dāng)務(wù)之急。鼠單抗改造與人化單抗 1992年戴歐(MJSDyer)綜述：(1)嵌合型抗體：可用蛋白工程法，即應(yīng)用化學(xué)法將鼠類單抗的VHVL及CH1和CL(Fab)連接到人CH2CH3片段(Fc)上產(chǎn)生保持有鼠

10、類單抗的結(jié)構(gòu)，但有人抗體的效應(yīng)功能。用遺傳工程法，即克隆的鼠類VHVL的DNA片段(抗原結(jié)合區(qū)，即互補(bǔ)的決定簇區(qū)，CDRs和骨架區(qū)殘基，F(xiàn)Rs)可插入到有人C區(qū)基因的質(zhì)粒上，然后轉(zhuǎn)染到骨髓瘤細(xì)胞中產(chǎn)生抗體。(2)遺傳學(xué)上改變了的人單抗，又稱人化抗體。1988年，里希曼(L，Riechman)等創(chuàng)立了這種技術(shù)，它不是移植整個V區(qū)，而正好是將編碼6個高可變環(huán)的DNA(即CDRs)引導(dǎo)到人高可變環(huán)的DNA順序中，它們很像原鼠類單抗的DNA順序，但抗原性更接近于人。CAMPATH1(一種抗淋巴細(xì)胞單抗)已按此法進(jìn)行改造，這種“人化技術(shù)”已成功地應(yīng)用于其它單抗的改進(jìn)，如抗TacH。進(jìn)一步，應(yīng)用基因工程方

11、法來制造人單抗。當(dāng)然，這些成功很大程度上來自于人們已發(fā)現(xiàn)許多VH等功能區(qū)(domain)單獨(dú)也能結(jié)合抗原的啟發(fā)。單鍵抗體對治療體內(nèi)造影藥物過量中毒有其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)。最初的抗體基因來自雜交瘤，然后克隆并完整表達(dá)在哺乳類動物細(xì)胞上。1988年姜(YLChiang)及1989年奧蘭(ROrlang)報(bào)告的將抗體基因直接從免疫動物的淋巴細(xì)胞克隆表達(dá)在細(xì)菌上，然后通過篩選與抗原結(jié)合的抗體的方法有可能越過雜交瘤技術(shù)。進(jìn)一步，1990年麥克卡弗蒂(JMcCafferty)等證明在絲狀噬菌體表面表達(dá)抗體片段的可能性，且能正確折疊和結(jié)合抗原，這一發(fā)現(xiàn)打開抗體制備的新路子?？贵w基因庫可用PCR法放大，并克隆到噬菌體

12、中。這樣便產(chǎn)生大量的噬菌體庫，每個都顯示一種抗原結(jié)合特異性(估計(jì)可達(dá)106109個)。進(jìn)一步，馬克斯(JDMarks)等1991年已證明，應(yīng)用噬菌體表達(dá)技術(shù)已能用未經(jīng)免疫的供體的噬菌體抗體(phage抗體)庫(來自人PBL中IgG和IgM的mRNA)分離出特異性抗原的人抗體。這說明有可能用這些庫分離直接抗“自身”的或其它非免疫抗原的人抗體而不需要動物。雜交瘤技術(shù)已證明是有用的，成千上萬個廣泛范圍的單抗已被制備出來，并應(yīng)用于研究和人類的健康管理。但制備單抗費(fèi)時(shí)，而且此法主要適用小鼠，制備大鼠的單抗雖也較成功，但制備人單抗至今仍未過關(guān)?；蚬こ贪l(fā)展至今日，已能從正常的未免疫動物克隆抗體基因并在噬菌體中表達(dá)分離特異性的抗體片段，這是令人鼓舞的。這種庫克隆技術(shù)或噬菌體抗體能否作為克勒米爾斯坦雜交瘤技術(shù)的補(bǔ)充還是代替物?是否這就是長期以來人們向往的獲得人單抗的普通途徑?真的不要免疫動物就能制造人單抗?簡單回答這些問題還為時(shí)過早?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】： 1 Koehler G. Milstein C. Nature, 1975,256:495 2 Milstein C. Science,1986,231:1261 3 Koehler G. Science,1986,233:1281 4 James J. Scand J Immunol. 1