轉化子的篩選與重組子的鑒定

1、,轉化子的篩選與重組子的鑒定,為什么要進行轉化子的篩選和重組子的鑒定？,在DNA體外重組實驗中，外源DNA片段與載體DNA的連接反應物一般不經分離直接用于轉化，再加上重組率和轉化率的不理想，因此必須通過篩選和鑒定來區(qū)分轉化子與非轉化子、重組子與非重組子、期望重組子與非期望重組子。 轉化子：接納載體或重組分子的轉化細胞。 非轉化子：為接納載體或重組分子的非轉化細胞。 重組子：含有重組DNA分子的轉化子。 非重組子：僅含有空載載體分子的轉化子。 期望重組子：含有目的基因的重組子。 非期望重組子：不含目的基因的重組子。,轉化子,重組子,期望重組子,三者的關系,轉化子的篩選與重組子的鑒定方法,基于載體

2、遺傳標記的篩選與鑒定 利用載體DNA分子上所攜帶的選擇性遺傳標記基因篩選轉化子或重組子 基于克隆片段序列的篩選與鑒定 由于基于載體遺傳的篩選與鑒定程序不能區(qū)分期望重組子與非期望重組子。在大多數情況下，待克隆的目的基因或DNA片段的序列至少部分是已知的，因此根據克隆片段序列設計的篩選與鑒定程序具有廣泛的實用性 基于外源基因表達產物的篩選與鑒定 如果克隆在受體細胞中的外源基因編碼產物是蛋白質，則可通過檢測這種蛋白質的生物功能或結構來篩選和鑒定期望重組子,基于載體遺傳標記的篩選與鑒定,抗藥性篩選法,營養(yǎng)缺陷性篩選法,顯色模板篩選法,噬菌斑篩選法,可區(qū)分轉化子與非轉化子、重組子與非重組子。,非重組子：

3、Apr、Tcr,重組子：Aps、Tcs,抗藥性篩選法,將外源DNA片段插入BamH I、Sal I位點,基本操作：,營養(yǎng)缺陷性篩選法,基本原理：,營養(yǎng)缺陷型篩選法可以區(qū)分轉化子與非轉化子，一般不能區(qū)分重組子與非重組子。其原理是：載體分子上攜帶某種營養(yǎng)組份的合成基因，而受體細胞本身不能合成這一營養(yǎng)組份，將轉化細胞涂布在不含此營養(yǎng)組份的培養(yǎng)基上，長出的便是轉化子 。,Lys,Lys+,Lys,Lys+,基本原理圖示：,常見的營養(yǎng)缺陷型篩選標記：,哺乳動物細胞中存在兩條dTTP的合成途徑：,用于大腸桿菌的營養(yǎng)標記基因常選用色氨酸生物合成基因trp+,用于高等哺乳動物細胞的營養(yǎng)標記基因常使用胸腺嘧啶核

4、苷激酶基因tk，相應的受體細胞則選擇tk-缺陷型,dCDP,dTDP,dTTP,TR,dTMP,dTDP,dTTP,AP,TK,AP 氨基喋呤,TK 胸腺嘧啶核苷激酶,顯色模型篩選法,基本原理：,顯色篩選法可以區(qū)分轉化子與非轉化子，也可區(qū)分重組子與非重組子。其原理是：載體分子上攜帶某種顯色酶基因，其表達產物能使細胞產生顏色反應，從而易于辨認和挑選，如大腸桿菌質粒pUC18攜帶的lacZ基因（藍色反應）、鏈霉菌質粒pIJ702攜帶的melC基因（黑色反應）等。,顯色篩選法的基本操作：,pUC18,Ap,r,lacZ,ori,Ap + X-gal,重組子（Apr + lacZ-）,將外源基因克隆在

5、pUC18的lacZ標記基因內部，使之滅活，此時重組子呈Apr、lacZ-，淡黃色菌落；而非重組子則呈Apr、lacZ+，藍色菌落,噬菌斑篩選法,重組子,非重組子,1.取代型載體 噬菌斑中的噬菌體即為重組子。 2.插入型載體 根據載體上的標記基因篩選。（如：lacZ）,基于克隆片段序列的篩選與鑒定,PCR鑒定法,菌落原位雜交法,限制性酶切圖譜法,亞克隆法,DNA序列測定法,PCR鑒定法,PCR技術的兩大主要用途為目的基因的獲得和DNA特定序列的檢測。根據引物互補區(qū)域的不同，PCR技術即可用于區(qū)分重組子與非重組子，也能鑒定期望重組子與非期望重組子，甚至還能探測目的基因或DNA片段是否整合在受體細

6、胞的基因組上。上述PCR鑒定程序一般需要將篩選平板上的單菌落分別挑出進一步培養(yǎng)，因此不太適用于成千上萬個轉化子的鑒定。,轉化子 重組子,非期望重組子,轉化子 期望重組子,期望重組子,受體基因組,非整合子 整合子,工作原理：,菌落原位雜交法,菌落原位雜交法（又稱探針原位雜交法）能從成千上萬個轉化子中迅速檢測出期望重組子，其前提條件是必須擁有與目的基因某一區(qū)域同源的探針序列。根據核酸雜交原理，探針序列特異性的雜交目的基因，并通過放射性同位素或熒光基團進行定位檢測。,原位雜交的操作程序,探針的制備,探針的長度以及與目的基因之間的序列同源性是雜交實驗成敗的關鍵 最佳的探針長度范圍為1001000bp

7、探針內部不能含有大面積的互補序列，會直接影響探針與DNA靶序列的雜交。 探針的獲取方法： 1、目的基因的同源序列 2、cDNA 3、人工合成,探針的標記,探針在雜交后是通過其分子中的放射性同位素或熒光基團進行定位 示蹤的，放射性的強弱直接關系到雜交反應的靈敏度。 單位長度探針標記的同位素越多，雜交反應靈敏度就越高。 探針標記方法： 1、5端標記法。 2、反轉錄標記法。 3、缺刻前移標記。 4、ABC標記法。,5端標記法,P,P,DTT、Mg2+、 -32PdATP、過量ADP,T4-PNP酶,P,P,方法1,P,P,堿性磷酸酶,P,P,方法2,T4-PNP酶,變性制備單鏈探針,缺刻前移標記法,

8、5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,DNase I,DNA聚合酶I,dNTP、-32PdATP,變性,限制性酶切圖譜法,所謂的限制性酶切圖譜法就是對載體上插入的外源DNA片段進行酶切圖譜分析，并以此與目的基因的已知圖譜對比，因此利用這種方法不僅能區(qū)分重組子與非重組子，而且還能鑒定目的重組子。但這種方法在用于數千規(guī)模的轉化子篩選時，工作量極大，實驗成本也高。,全酶解圖譜法,B,B,E,P,4.0 kb,1.0 kb,0.8 kb,區(qū)分重組子與非重組子,電泳觀察酶解產物片段,重組子： 2.7 kb + 4.0 kb,非重組子： 2.7 kb,如果外源DNA片段也是2.7 kb，最好 選用單一切

9、口的酶將質粒線型化，然,后通過其長度來鑒定其是否為重組子,S,S,B,P,4.0 kb,1.0 kb,0.8 kb,區(qū)分重組子與非重組子,如果外源DNA片段插pUC18的SphI位點處，原則上也可用SphI酶解鑒定，但這樣做很不經濟，因為SphI非常昂貴（每100單位50美元）。用HindIII和EcoRI聯合酶解同樣可以達到目的，但這兩種酶的價格只及SphI的1 / 50,B,B,E,P,4.0 kb,1.0 kb,0.8 kb,區(qū)分目的重組子與非目的重組子,用EcoRI酶切轉化子質粒DNA,目的重組子： 3.0 kb + 3.7 kb,或者： 1.0 kb + 5.7 kb,用PstI酶切

10、轉化子質粒DNA,目的重組子： 3.2 kb + 3.5 kb,或者： 0.8 kb + 5.9 kb,B,B,E,4.0 kb,2.0 kb,2.0 kb,區(qū)分目的重組子與非目的重組子,對圖示的克隆片段，轉化子質粒DNA用EcoRI酶切開后，只出現2.0 kb和2.7 kb兩條帶子，實際上2.0 kb的條帶中含有兩種不同的分子,2.7 kb,2.0 kb,E,部分酶解圖譜法,該重組質粒經酶解后，分別得到下列幾組數據：,BamHI全酶解：0.6 0.8 1.8 3.4 kb,BamHI+EcoRI全酶解：0.6 0.8 1.8 1.2 2.2 kb,其中，1.2 kb片段的存在表明該片段位于一

11、端,BamHI部分酶解：1.4 2.6 4.0 kb,其中，1.4 kb的片段必為0.6 kb和0.8 kb兩片段，表,明兩者是連在一起的；同理，2.6 kb的片段必為0.8,kb和1.8 kb兩片段，表明兩者是連在一起的；最后，,4.0 kb的片段必為0.6 kb和3.4 kb兩片段，表明兩者,是連在一起的,DNA序列測定法,DNA序列測定是精確鑒定目的基因的重要手段，目前國際上流行采用Sanger發(fā)明的雙脫氧末端終止法測定DNA序列，其工作原理是在DNA聚合反應的進程中，通過位點特異性終止測定。 DNA序列其關鍵技術有：,DNA鏈聚合反應時的定點隨機中斷（ddNTP）,聚丙烯酰胺凝膠電泳的

12、高分辨率（600 bp / 601 bp）,電腦自動檢測、記錄、編輯程序,用于DNA測序的專一性試劑盒（Kit）,雙脫氧末端終止測序法的基本操作：,DNA聚合反應,聚丙烯酰胺凝膠電泳,雙脫氧末端終止測序法的基本反應：,Klenow,OH 3,5 P,T,dNTP + ddATP,T,T,T,T,T,OH 3,5 P,A,G,T,C,GGCATTGCGTTACTAGTCCAGTACA,基于外源基因表達產物的篩選與鑒定,蛋白質生物功能檢測法,放射免疫原位檢測法,蛋白凝膠電泳檢測法,蛋白質生物功能檢測法,某些外源基因編碼具有特殊生物功能的酶類或活性蛋白（如-淀粉酶、葡聚糖內切酶、-葡萄糖苷酶、蛋白酶、抗生素抗性蛋白等），設計簡單靈敏的平板模型，可以迅速篩選出克隆了上述蛋白編碼基因的期望重組子。,重組子,利用淀粉酶基因表達產物檢測重組子,放射免疫原位檢測法,基本原理及操作程序與菌落原位雜交法非常相似，只不過后者是用核酸探針通過堿基互補的形式特異性雜交目的D