蛋白質(zhì)的序列分析及結(jié)構(gòu)預(yù)測PPT課件

1、.,1,蛋白質(zhì)的序列分析及結(jié)構(gòu)預(yù)測,.,2,.,3,一、蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫介紹 二、蛋白質(zhì)序列分析 三、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測 四、應(yīng)用 分子設(shè)計(jì),.,4,一、蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫介紹,蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)主要分為四級, 一級結(jié)構(gòu)、二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)以及四級結(jié)構(gòu)。依據(jù)這種結(jié)構(gòu)層次, 將蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫分為: 1. 蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫：如PIR、SWISS-PROT、NCBI , 這些數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)主要以蛋白質(zhì)的序列為主, 并賦予相應(yīng)的注釋; 2. 蛋白質(zhì)模體及結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫：如PROSITE、Pfam, 這些數(shù)據(jù)庫主要收集了蛋白質(zhì)的保守結(jié)構(gòu)域和功能域的特征序列; 3. 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫： 如PDB 等, 這些數(shù)據(jù)庫主要以蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)

2、測量數(shù)據(jù)為主; 4. 蛋白質(zhì)分類數(shù)據(jù)庫：如SCOP、CATH、FSSP 等, 這其中有以序列比較為基礎(chǔ)的序列分類數(shù)據(jù)庫以及以結(jié)構(gòu)比較為基礎(chǔ)的結(jié)構(gòu)分類數(shù)據(jù)庫之分。,.,5,蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫特征: 這些數(shù)據(jù)庫種類有差別, 但內(nèi)部是相互聯(lián)系的. 每個數(shù)據(jù)庫都有指針指向其他數(shù)據(jù)庫, 而且數(shù)據(jù)庫之間的序列以及相應(yīng)的結(jié)構(gòu)是共享的, 同一種蛋白質(zhì)依次會出現(xiàn)在不同的數(shù)據(jù)庫. 這樣的數(shù)據(jù)溝通有助于更深層地挖掘蛋白質(zhì)的內(nèi)在生物信息, 這些數(shù)據(jù)庫是融序列信息的索取、處理、存儲、輸出于一身的。,.,6,1. 蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫,（1）PIR(protein information resource, PIR)和PSD (p

3、rotein sequence database, PSD) /pirwww PIR-PSD 是一個綜合全面的、非冗余的、專業(yè)注釋的、分類完整的蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫。PIR-PSD 的序列來自于將GenBank/ EMBL/ DDBJ 三大數(shù)據(jù)庫的編碼序列的翻譯而成的蛋白質(zhì)序列、發(fā)表的文獻(xiàn)中的序列和用戶直接提交的序列。 （2）SWISS-PROT/ TrEMBL數(shù)據(jù)庫 /swissprot,數(shù)據(jù)庫由蛋白質(zhì)序列條目構(gòu)成, 每個條目包含蛋白質(zhì)序列、引用文獻(xiàn)信息、 分類學(xué)信息、注釋等, 注釋中包括蛋白質(zhì)的功能、轉(zhuǎn)錄后修飾位點(diǎn)、特

4、殊位點(diǎn) 和區(qū)域、二級結(jié)構(gòu)、四級結(jié)構(gòu)、與其他序列的相似性、序列殘缺與疾病的關(guān)系、 序列變異體等信息。,.,7,2. 模體以及結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫,模體數(shù)據(jù)庫 （1）PROSITE 蛋白質(zhì)家族及結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫( /prosite/ ) PROSITE 數(shù)據(jù)庫收集了有顯著生物學(xué)意義的蛋白質(zhì)位點(diǎn)序列、蛋白質(zhì)特征序列譜庫以及序列模型, 并能依據(jù)這些特征屬性快速可靠地鑒定出一個未知功能蛋白質(zhì)序列屬于哪個蛋白質(zhì)家族, 即使在蛋白質(zhì)序列相似性很低的情況下, 也可以通過搜索隱含的功能結(jié)構(gòu)模體(motif)來鑒定, 因此是有效的序列分析數(shù)據(jù)庫。 PROSITE 中涉及的序列模式包括酶的催化位點(diǎn)、

5、配體結(jié)合位點(diǎn)、金屬離子結(jié)合位點(diǎn)、二硫鍵、小分子或者蛋白質(zhì)結(jié)合區(qū)域等, 此外PROSITE 還包括由多序列比對構(gòu)建的序列表譜( profile) , 能更敏感地發(fā)現(xiàn)序列中的信息。,.,8,PROSITE同時(shí)數(shù)據(jù)庫提供了序列分析工具: ScanProsite 是用于搜索所提交的序列數(shù)據(jù)是否包含 PROSITE 數(shù)據(jù)庫中的序列模式或者SWISS-PROT 數(shù)據(jù)庫中已提交的序列模式; MotifScan 用于查找未知序列中所有可能的已知結(jié)構(gòu)組件, 數(shù)據(jù)庫包括PROSITE序列表譜、PROSITE 模式、Pfam 收集的隱馬爾可夫模式( HMM)。,.,9,(2) PRINTS Fingerprint

6、Database www.bioinf.man.ac.uk/dbrowser/PRINTS/ 這個數(shù)據(jù)庫包含1 500 個蛋白質(zhì)指紋圖譜, 編碼9 136 個單一模體。 (3) BLOCKS ( / ) BLOCKS 是通過一些高度保守的蛋白質(zhì)區(qū)域比對出來的無空位的片段。,模體數(shù)據(jù)庫,.,10,蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫 (1 ) 蛋白質(zhì)家族序列比對以及隱馬爾可夫模式數(shù)據(jù)庫Pfam( protein families database of alignments and HMMs) Pfam 是蛋白質(zhì)家族序列比對以及隱馬爾可夫模式數(shù)據(jù)庫,其網(wǎng)址是: www.sa

7、nger.ac.uk/Software/Pfam/index.shtml。 (2) 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫ProDom http:/prodes.toulouse.inra.fr/prodom/doc/prodom.html (3) SMART SMART 是一個簡單的結(jié)構(gòu)研究工具, 可對可轉(zhuǎn)移的遺傳因子進(jìn)行鑒定和注解, 以及分析結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu), 可以檢測出500 多個參與信號傳導(dǎo)、胞外和染色體相關(guān)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域家族, 對這些結(jié)構(gòu)域又在系統(tǒng)進(jìn)化樹分布、功能分類、三級結(jié)構(gòu)和重要的功能殘基方面做了注解。 http:/smart.embl-heidelberg.de/,.,11,3. 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫,PD

8、B( protein data bank , PDB) /pdb/ PDB 包括了蛋白質(zhì)、核酸、蛋白質(zhì)-核酸復(fù)合體以及病毒等生物大分子結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù), 主要是蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù), 這些數(shù)據(jù)來源于幾乎全世界所有從事生物大分子結(jié)構(gòu)研究的研究機(jī)構(gòu), 并由RCSB 維護(hù)和注釋。,.,12,4.蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分類數(shù)據(jù)庫,(1) CATH 數(shù)據(jù)庫 www.biochem.ucl.ac.uk/bsm/cathnew/index.html (2) SCOP 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分類數(shù)據(jù)庫( structural classification of protein database,SCOP) sc

9、op.mrclmb.cam.ac.uk/scop/index.html,.,13,二、蛋白質(zhì)的序列分析,1. 蛋白質(zhì)序列信息的獲取 2. 蛋白質(zhì)序列分析,.,14,1. 蛋白質(zhì)序列信息的獲取,（1） 直接測序 （2） 翻譯編碼的DNA序列 ORF Finder （3）在數(shù)據(jù)庫中搜索 運(yùn)用ID 號、入口號、條目號等搜索。 運(yùn)用關(guān)鍵詞搜索 其他方式搜索。如可以通過引用序列的文獻(xiàn)、序列的作者、序列提交的日期等進(jìn)行搜索。,.,15,（1）直接測序,e.g. Protein Sequencing and Identification by Tandem Mass Spectrometry， 即用串聯(lián)質(zhì)譜

10、儀測序,1. 蛋白質(zhì)序列信息的獲取,.,16,串聯(lián)質(zhì)譜及其作用,兩個或更多的質(zhì)譜連接在一起，稱為串聯(lián)質(zhì)譜。 最簡單的串聯(lián)質(zhì)譜（MS|MS）由兩個質(zhì)譜串聯(lián)而成，其中第一個質(zhì)量分析器（MS1）將離子預(yù)分離或加能量修飾，由第二級質(zhì)量分析器（MS2）分析結(jié)果。,.,17,串聯(lián)質(zhì)譜儀的組合方式： (1) 磁分析器-靜電分析器-磁分析器(2) 靜電分析器-磁分析器-靜電分析器(3) 三重四極濾質(zhì)器質(zhì)譜儀(4) 混合式串聯(lián)質(zhì)譜儀，如MA-ESA-Q-Q。實(shí)現(xiàn)串聯(lián)質(zhì)譜有空間串聯(lián)和時(shí)間串聯(lián)兩種方式。,.,18,優(yōu)點(diǎn)： 可以避免底物分子產(chǎn)生的干擾，大大降低背景噪音。 其次，可使分子離子通過與反應(yīng)氣的碰撞來產(chǎn)生斷裂

11、。 因此能提供更多的結(jié)構(gòu)信息，所以串聯(lián)質(zhì)譜特別適合 于復(fù)雜組分體系且干擾嚴(yán)重的樣品中低含量組分分析測 定，具有比GC-MS和LC-MS等一級質(zhì)譜更高的選擇性和靈 敏度。,.,19,Masses of Amino Acid Residues,.,20,Protein backbone,H.-HN-CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH-CO-OH,Ri-1,Ri,Ri+1,AA residuei-1,AA residuei,AA residuei+1,N-terminus,C-terminus,.,21,Breaking Protein into Peptides and Peptides i

12、nto Fragment Ions,Proteases, e.g. trypsin（胰蛋白酶）, break protein into peptides. A Tandem Mass Spectrometer（串聯(lián)式質(zhì)譜儀） further breaks the peptides down into fragment ions and measures the mass of each piece.,General for sequencing,.,22,Breaking Protein into Peptides and Peptides into Fragment Ions,Mass Sp

13、ectrometer accelerates the fragmented ions; heavier ions accelerate slower than lighter ones. Mass Spectrometer measure mass/charge ratio of an ion.,General for sequencing,.,23,Peptide Fragmentation,Peptides tend to fragment along the backbone. Fragments can also loose neutral chemical groups like N

14、H3 and H2O.,H.-HN-CH-CO . . . NH-CH-CO-NH-CH-CO-OH,Ri-1,Ri,Ri+1,H+,Prefix Fragment,Suffix Fragment,Collision Induced Dissociation,.,24,N- and C-terminal Peptides,G,F,P,N,A,G,F,P,N,A,G,F,P,N,A,G,F,P,N,A,G,F,P,N,A,N-terminal peptides,C-terminal peptides,.,25,Terminal peptides and ion types,G,F,P,N,Pep

15、tide,Mass (D) 57 + 97 + 147 + 114 = 415,H2O,Peptide,Mass (D) 57 + 97 + 147 + 114 18 = 397,G,F,P,N,H2O,without,.,26,N- and C-terminal Peptides,G,F,P,N,A,G,F,P,N,A,G,F,P,N,A,G,F,P,N,A,G,F,P,N,A,N-terminal peptides,C-terminal peptides,415,486,301,154,57,71,185,332,429,.,27,N- and C-terminal Peptides,N-

16、terminal peptides,C-terminal peptides,415,486,301,154,57,71,185,332,429,.,28,Peptide Fragmentation,y3,b2,y2,y1,b3,a2,a3,HO NH3+ | | R1 O R2 O R3 O R4 | | | | | | | H - N - C - C - N - C - C - N - C - C - N - C - COOH | | | | | | | H H H H H H H,b2-H2O,y3 -H2O,b3- NH3,y2 - NH3,.,29,Mass Spectra,mass,

17、0,The peaks in the mass spectrum: Prefix Fragments with neutral losses (-H2O, -NH3) Noise and missing peaks.,and Suffix Fragments.,.,30,Protein Identification with MS/MS,.,31,Tandem Mass-Spectrometry,.,32,Breaking Proteins into Peptides,peptides,MPSER,GTDIMR,PAKID,HPLC,To MS/MS,MPSERGTDIMRPAKID.,pro

18、tein,.,33,Mass Spectrometry,Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization (MALDI) 基質(zhì)輔助激光解吸質(zhì)譜,.,34,基質(zhì)輔助激光解吸飛行時(shí)間質(zhì)譜儀 MALDI-TOF-MS,MALDI-TOF-MS是近年來發(fā)展起來的一種軟電離新型有機(jī) 質(zhì)譜。近年來已成為檢測和鑒定多肽、蛋白質(zhì)、多糖、核苷酸、 糖蛋白、高聚物以及多種合成聚合物的強(qiáng)有力工具。 原理：當(dāng)用一定強(qiáng)度的激光照射樣品與基質(zhì)形成的共結(jié)晶薄 膜，基質(zhì)從激光中吸收能量，基質(zhì)-樣品之間發(fā)生電荷轉(zhuǎn)移使 得樣品分子電離，電離的樣品在電場作用下加速飛過飛行管道， 根據(jù)到達(dá)檢測器

19、的飛行時(shí)間不同而被檢測，即測定離子的質(zhì)量 電荷之比與離子的飛行時(shí)間成正比來檢測離子。 MALDI-TOF-MS的中心技術(shù)就是依據(jù)樣品的質(zhì)荷比（m/z） 的不同來進(jìn)行檢測，并測得樣品分子的分子量。,.,35,Tandem Mass Spectrometry,Scan 1708,LC,Scan 1707,MS,MS/MS,.,36,多肽片段指紋圖譜（PFF）,步驟：用酶專一性酶解蛋白質(zhì)，經(jīng)過分離，得到的肽段在質(zhì)譜中被選擇和破碎后得到MS/MS譜圖，與數(shù)據(jù)庫中的譜圖比較進(jìn)行鑒定 代表方法： LC-ESI-MS/MS 2D-LC-MS/MS（shotgun）,.,37,1. 蛋白質(zhì)序列信息的獲取,（2

20、）翻譯編碼的DNA序列 e.g.用“ORF Finder”程序找到DNA的開放閱讀框。 網(wǎng)址：/gorf/gorf.html,.,38,.,39,.,40,1. 蛋白質(zhì)序列信息的獲取,（3）在數(shù)據(jù)庫中搜索 e.g. PIR-PSD database: /pirwww SWISS-PROT/TrEMBL database /swissprot,.,41,目前大部分蛋白質(zhì)序列是通過DNA 人工翻譯過來的, 實(shí)際上很少有人能獲得真正的蛋白質(zhì), 因而實(shí)驗(yàn)證據(jù)就很難直接獲得, 因此對蛋白質(zhì)序列初始分析是很有價(jià)

21、值的。 比如，通過一些序列分析工具進(jìn)行蛋白質(zhì)理化特性的預(yù)測、修飾位點(diǎn)的預(yù)測等。,2. 蛋白質(zhì)序列分析,.,42,1.蛋白質(zhì)序列的基本性質(zhì)分析 理化性質(zhì)分析，疏水性分析，跨膜區(qū)分析，信號肽預(yù)測，Coil區(qū)分析，亞細(xì)胞定位 2.序列數(shù)據(jù)庫搜索 相似性搜索，模體的搜索 3.結(jié)構(gòu)域定位 4.空間結(jié)構(gòu)預(yù)測 二級結(jié)構(gòu)及三級結(jié)構(gòu)預(yù)測，結(jié)構(gòu)預(yù)測方法評價(jià),蛋白質(zhì)序列分析主要內(nèi)容：,.,43,1. 蛋白質(zhì)序列的基本性質(zhì)分析 （1）理化性質(zhì)分析 分子質(zhì)量、分子式、理論等電點(diǎn)、氨基酸組成、消光系數(shù)、穩(wěn)定性等理化特性。 例，利用ProtParam工具 /tools/protpara

22、m.html,.,44,CL和CLAP的理化性質(zhì)預(yù)測結(jié)果,CL：組織蛋白酶L,CLAP：組織蛋白酶L相關(guān)蛋白,.,45,（2） 疏水性分析 氨基酸側(cè)鏈的疏水性用從各氨基酸減去甘氨酸疏水性之值來表示，蛋白質(zhì)的疏水性在保持蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的形成和穩(wěn)定中起著重要作用。 e.g.利用ProtScale工具 /protscale/ 利用BioEdit軟件分析,.,46,海參溶菌酶親水性/疏水性分析,Score 0，表示疏水性； Score 0，表示親水性,.,47,（3） 跨膜區(qū)分析 蛋白質(zhì)含有跨膜區(qū)提示它可能作為膜受體起作用，也可能是定位在膜上的錨定蛋白或離子通道

23、蛋白。 例，使用TMHMM Server v.2.0在線分析 http:/www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/,.,48,鋁激活蘋果酸的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(TaALMT1)跨膜結(jié)構(gòu)分析,.,49,（4） 信號肽預(yù)測 信號肽：指分泌蛋白表達(dá)時(shí)氨基端的20余個氨基酸，將引導(dǎo)該蛋白質(zhì)最終分泌至細(xì)胞外，但這段信號肽會被信號肽酶切掉，所以成熟的分泌蛋白是不含這段信號肽的。 用于指導(dǎo)蛋白質(zhì)的跨膜轉(zhuǎn)移（定位）的N末端的氨基酸序列，一般由15-30個氨基酸組成。 使用SignalP在線分析 http:/www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/,.,50,海參溶菌酶信號肽預(yù)

24、測,Conclusion：cleavage site between pos. 20 and 21: ASG-QV,.,51,（5） Coil區(qū)分析 蛋白質(zhì)中由2-7條螺旋鏈相互纏繞形成類似麻花狀結(jié)構(gòu)的總稱； 主要存在形式是2-5條相互纏繞形成的平行或反平行同寡聚體或異寡聚體； 是控制蛋白質(zhì)寡聚化的元件，轉(zhuǎn)錄因子、骨架蛋白、動力蛋白、膜蛋白、酶等； 七肽重復(fù)區(qū)。 e.g. 使用COILS服務(wù)器分析 /software/COILS_form.html,.,52,（6） 亞細(xì)胞定位 根據(jù)氨基酸組成可以進(jìn)行亞細(xì)胞定位 不同細(xì)胞器多具不同的理化環(huán)境，它會根

25、據(jù)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)及表面理化特征選擇性容納蛋白質(zhì)；蛋白質(zhì)表面直接暴露于細(xì)胞器環(huán)境中，它由序列折疊過程決定，而后者取決于氨基酸組成。 亞細(xì)胞定位的步驟 在線分析工具 e.g.使用TargetP http:/www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/,.,53,組織蛋白酶CL和相關(guān)蛋白CLAP的亞細(xì)胞定位,結(jié)果證明，CL和CLAP出現(xiàn)幾率最高的位點(diǎn)都為胞質(zhì)，說明它們都為 胞漿內(nèi)蛋白，這也為今年來在溶酶體內(nèi)外都發(fā)現(xiàn)組織蛋白酶活性提供 了證據(jù)。,.,54,(1)相似性搜索（或同源搜索）, 一個新序列與序列數(shù)據(jù)庫中的序列比對， 從而找到同源或者相似序列。 常用程序是BLASTp。,2.

26、 序列數(shù)據(jù)庫搜索,.,55,.,56,(2) 模體（motif）的搜索 這是另一種序列搜索方法, 其目的是尋找蛋白質(zhì)中結(jié)構(gòu)域或者功能域。 這個方法不是給每個位置的氨基酸打分, 然后得到一個相似程度, 而是直接描述關(guān)鍵的幾個保守殘基, 同時(shí)忽略其他位置的氨基酸多態(tài)性, 這些保守的序列有時(shí)會稱為“標(biāo)志” ( signature) , 就是所謂的模式序列( pattern ) 。,.,57,Motif 搜索 即模體搜索，是序列中局部的保守區(qū)域，或是一組序列中共有的一小段序列模式。 使用PROSITE數(shù)據(jù)庫進(jìn)行motif搜索 /prosite 模式序列常表示為： AG-x-

27、V-x(2)-x-YW shows either amino acid x is any amino acid x(2) any amino acid in the next 2 positions shows any amino acid except these,.,58,模體的搜索舉例： 有序列表示為： H- FW-x- LIVM -x-G-x ( 5 )- LV-H- x( 3)-DE 這是描述一個DNA 結(jié)合蛋白質(zhì)家族的, 可以理解為組氨酸, 接著是苯丙氨酸或者色氨酸, 緊接一個氨基酸x, 然后可以是亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、或者甲硫氨酸 , 這樣一段序列由于處于活性區(qū)域或者蛋白質(zhì)的

28、重要結(jié)構(gòu)區(qū), 所以特別保守, 因此也是序列搜索的目標(biāo)之一。,.,59,3. 結(jié)構(gòu)域定位,通過將序列在數(shù)據(jù)庫中搜索，可以了解到序列的一些信息，接下來就可以進(jìn)行結(jié)構(gòu)域的定位，這樣就對以后的結(jié)構(gòu)預(yù)測有了一個比較清醒的認(rèn)識。 如果蛋白質(zhì)序列的長度大于500個氨基酸，就可以根據(jù)搜索的情況（比如按相似性高低或者結(jié)構(gòu)域多少等）將蛋白質(zhì)分割成多個不連續(xù)的區(qū)域，最好將這一段一段的序列分別鑒別。,.,60,什么是結(jié)構(gòu)域？,結(jié)構(gòu)域是在二級結(jié)構(gòu)或超二級結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上形成三級結(jié)構(gòu)的局部折疊區(qū)，一條多肽鏈在這個域范圍內(nèi)來回折疊，但相鄰的域常被一個或兩個多肽片段連結(jié)。 通常由50-300個氨基酸殘基組成，其特點(diǎn)是在三維空間可

29、以明顯區(qū)分和相對獨(dú)立，并且具有一定的生物功能如結(jié)合小分子。模體（motif）是結(jié)構(gòu)域的亞單位，通常由23二級結(jié)構(gòu)單位組成，一般為螺旋、折疊和環(huán)（loop）。,結(jié)構(gòu)域定位,.,61,二聚體蛋白結(jié)構(gòu)域,.,62,結(jié)構(gòu)域和功能域,對那些較小的球狀蛋白質(zhì)分子或亞基來說,結(jié)構(gòu)域和三級結(jié)構(gòu)是一個意思,也就是說這些蛋白質(zhì)或亞基是單結(jié)構(gòu)域的，如紅氧還蛋白等； 較大的蛋白質(zhì)分子或亞基其三級結(jié)構(gòu)一般含有兩個以上的結(jié)構(gòu)域，即多結(jié)構(gòu)域的,其間以柔性的鉸鏈（hinge）相連，以便相對運(yùn)動。 結(jié)構(gòu)域有時(shí)也指功能域。功能域是蛋白質(zhì)分子中能獨(dú)立存在的功能單位,它可以是一個結(jié)構(gòu)域，也可以是由兩個或兩個以上結(jié)構(gòu)域組成。,結(jié)構(gòu)域定

30、位,.,63,結(jié)構(gòu)域定位,結(jié)構(gòu)域是蛋白序列的功能、結(jié)構(gòu)和進(jìn)化單元 分析方法：序列比對 單條蛋白質(zhì)序列可以包含一個或多個結(jié)構(gòu)域,.,64,基本類型 ：,64,-螺旋型,全-折疊型,/型,+型,.,65,結(jié)構(gòu)域定位分析一般流程：,(1)探測序列與其他全序列之間有無同源性.如果有，那么這是該段序列為結(jié)構(gòu)域的很好證據(jù)，然后進(jìn)行結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫的搜索，也可以搜索注釋好的數(shù)據(jù)庫，從而得到一些有關(guān)結(jié)構(gòu)域的說明。 (2)分析低復(fù)雜度的區(qū)域。在多結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)中，這些低復(fù)雜度序列常常間隔結(jié)構(gòu)域，長的重復(fù)序列特別是pro、glu、ser、thr等常常是連接序列，也是很好的結(jié)構(gòu)域剪接位置。,結(jié)構(gòu)域定位,.,66,結(jié)構(gòu)域定

31、位分析一般流程：,(3)跨膜區(qū)域。由于跨膜結(jié)構(gòu)是一個非常典型的結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)連續(xù)性較強(qiáng)，而且預(yù)測容易，準(zhǔn)確性也比較高，因此也是一個分割的區(qū)域，這樣就很容易區(qū)分胞外和胞內(nèi)區(qū)域。 (4)卷曲螺旋結(jié)構(gòu)(coiled-coil)。這個結(jié)構(gòu)有時(shí)也可能是蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域之間的間隔區(qū)，可以在COIL網(wǎng)站上預(yù)測coiled-coil結(jié)構(gòu)。,結(jié)構(gòu)域定位,.,67,結(jié)構(gòu)域定位分析一般流程：,(5)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測。這個方法常常用來預(yù)測一個結(jié)構(gòu)中包含的不同折疊子。例如，一個序列中的一部分可能會被預(yù)測成只有-螺旋，而另一個部分可能會被預(yù)測成只含有-折疊，這些都可能預(yù)示有域的結(jié)構(gòu)存在。 (6)如果序列已被成功地分解成成形的結(jié)構(gòu)

32、域，那么重復(fù)進(jìn)行數(shù)據(jù)庫搜索并且進(jìn)行獨(dú)立比對是很重要的.,結(jié)構(gòu)域定位,.,68,結(jié)構(gòu)域定位,.,69,結(jié)構(gòu)域分析工具 介于二級和三級結(jié)構(gòu)之間可以明顯區(qū)分但又相對獨(dú)立的折疊單元，每個結(jié)構(gòu)域自身形成緊實(shí)的三維結(jié)構(gòu)，可以獨(dú)立存在或折疊，但結(jié)構(gòu)域與結(jié)構(gòu)域之間關(guān)系較為松散。 通常由25-300個氨基酸殘基組成； 全平行結(jié)構(gòu)域、反平行結(jié)構(gòu)域、+結(jié)構(gòu)域、 /結(jié)構(gòu)域及其他折疊類型。 利用SMART服務(wù)器進(jìn)行結(jié)構(gòu)與分析 http:/smart.embl-heidelberg.de/,.,70,結(jié)構(gòu)域定位分析舉例,實(shí)例分析：,海參溶菌酶序列和其它i型溶菌酶保守區(qū)域的比對,結(jié)果：高度保守的2個活性位點(diǎn)（E34和S50

33、）和特有的氨基酸 保守序列MDVGSLSCG(PY)(YF)QIK,.,71,i-型溶菌酶含有兩個結(jié)構(gòu)域,.,72,模體搜索和結(jié)構(gòu)域定位舉例,實(shí)例分析：,海參i-型溶菌酶3D結(jié)構(gòu)模式圖,.,73,4. 蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)預(yù)測,（1）蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測 蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)是蛋白質(zhì)分子中重要的組成“部件”， 是研究蛋白質(zhì)氨基酸序列和三級結(jié)構(gòu)之間的橋梁。 基本的二級結(jié)構(gòu)： 螺旋，折疊， 轉(zhuǎn)角， 無規(guī)則卷曲（coils） 以及模體（motif） 等蛋白質(zhì)局部結(jié)構(gòu)組件,.,74,蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測的基本依據(jù)是每一段相鄰的 氨基酸殘基具有形成一定二級結(jié)構(gòu)的傾向。 二級結(jié)構(gòu)預(yù)測問題是模式分類問題。 二級結(jié)構(gòu)預(yù)測的

34、目標(biāo)：判斷每一段中心的殘基是否 處于螺旋、折疊、轉(zhuǎn)角（或其它狀態(tài)）之一的 二級結(jié)構(gòu)態(tài)，即三態(tài)。,蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測,.,75,二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測方法： 基于統(tǒng)計(jì)和機(jī)器學(xué)習(xí)方法進(jìn)行預(yù)測 Chou-Fasman算法 GOR算法 多序列列線預(yù)測 基于神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的序列預(yù)測 基于已有知識的預(yù)測方法（knowledge based method） 混合方法（hybrid system method）,蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測,.,76,二級結(jié)構(gòu)中氨基酸出現(xiàn)頻率的影響： 氨基酸殘基在二級結(jié)構(gòu)元件中出現(xiàn)頻率的研究揭示， 某些殘基如 Glu 、 Met 、 Ala 和 Leu 在螺旋中出現(xiàn)的 頻率比在其他二級結(jié)構(gòu)元件中高。

35、相反，Gly 和 Pro 在 螺旋中頻率很低。但它們在轉(zhuǎn)角中很高。另一些殘基 包括 Val 、Ile 和芳香族氨基酸在折疊片中頻率很高， 而 Asp 、Glu 和 Pro 在折疊片中則很低。這表明各種 殘基形成各種二級結(jié)構(gòu)的傾向性是不同的。,蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測,.,77,蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)分析工具,.,78,蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)分析工具（續(xù)）,.,79,PredictProtein / 可以獲得功能預(yù)測、二級結(jié)構(gòu)、基序、二硫鍵結(jié)構(gòu)、結(jié)構(gòu)域等許多蛋白質(zhì)序列的結(jié)構(gòu)信息 該方法的平均準(zhǔn)確率超過72%，最佳殘基預(yù)測準(zhǔn)確率達(dá)90%以上。因此，被視為蛋白質(zhì)二級

36、結(jié)構(gòu)預(yù)測的標(biāo)準(zhǔn) 需要注冊帳號用于學(xué)術(shù)研究,蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測,.,80,PredictProtein 提交界面詳解,提交郵件 地址（必填）,蛋白名稱（可選）,分析方法,.,81,分析方法程序詳解,.,82,跨膜螺旋預(yù)測（PHDhtm）專家選項(xiàng),Ambivalent序列識別（ASP）專家選項(xiàng),CHOP結(jié)構(gòu)域分析工具專家選項(xiàng),.,83,比對內(nèi)容,從SWISS-PROT數(shù)據(jù)庫返回BLAST搜索結(jié)果,MaxHom參數(shù)選項(xiàng),最低序列比對一致性,空位間隔罰分,空位延伸罰分,比對矩陣,最大擊中值,.,84,選擇保存分析結(jié)果,是否返回多序列比對結(jié)果,HTML結(jié)果形式,AGAPE結(jié)果,PROF/PHD結(jié)果形式,

37、以下拉框中所指定的輸入格式將待測序列粘貼此提交欄,.,85,PredictProtein 分析結(jié)果,.,86,PredictProtein 分析結(jié)果,.,87,(2) 蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)預(yù)測,.,88,方法一：同源模建 comparative modeling 1.同源模建的基礎(chǔ) 蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)比一級結(jié)構(gòu)更保守。研究表明 如果兩個蛋白質(zhì)的同源性達(dá)到50%，二者90%的Ca的RMS 小于1埃。 2.原理： 序列高度相似的蛋白質(zhì)具有相似的三維結(jié)構(gòu)。 同源蛋白質(zhì)之間具有保守的結(jié)構(gòu)內(nèi)核，差異僅存在 分子表面的回折區(qū)。 當(dāng)一個蛋白質(zhì)的序列與一個已知結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)序列 相似的時(shí)候，該蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)可以被模建。,

38、.,89,3.同源模建的前提和條件： 要模建的目標(biāo)蛋白必須有一個或多個已知結(jié)構(gòu)的與 之同源（同源性不低于25）的蛋白。 數(shù)據(jù)庫：蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、序列數(shù)據(jù) 計(jì)算機(jī)：工作站 分子模擬系統(tǒng)：軟件系統(tǒng) 4.同源模建的發(fā)展歷史 1969年，Browne利用溶菌酶的結(jié)構(gòu)手工模建了牛乳白蛋白的結(jié)構(gòu)。八十年代，Blundel發(fā)展了利用多種同源蛋白質(zhì)進(jìn)行結(jié)構(gòu)預(yù)測的方法。隨著計(jì)算機(jī)技術(shù)的發(fā)展、結(jié)構(gòu)測定數(shù)據(jù)的增加，同源模建技術(shù)也在快速發(fā)展。,.,90,5.同源模建的主要算法 剛體裝配模建（modeling by rigid body assembly ） 片段匹配模建（modeling by segment match

39、ing） 空間制約模建（modeling by satisfaction of spatial restraints）,.,91,（1）剛體裝配模建 從一些剛體包括核心區(qū)、環(huán)區(qū)和側(cè)鏈來構(gòu)造模型，這些剛體都來自分解的相關(guān)結(jié)構(gòu)（參考蛋白）。模型的裝配涉及計(jì)算一個框架，這個框架定義為折疊模式的保守區(qū)域的模板原子的平均，并把剛體裝進(jìn)框架。 （2）片段匹配模建 依賴于從模板蛋白的保守原子的相近位置來計(jì)算其它原子的坐標(biāo)。它可以通過使用蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的短片數(shù)據(jù)庫、能量或幾何規(guī)則、以及這些標(biāo)準(zhǔn)的某些聯(lián)合來完成。 （3）空間制約滿足： 首先從參考蛋白結(jié)構(gòu)中抽取出一些空間制約條件，將這些制約條件用幾率密度函數(shù)來表示，

40、然后根據(jù)氨基酸類型、等位殘基的主鏈構(gòu)象和序列之間局部的相似程度而對空間制約條件施加以不同的權(quán)重因子。模建時(shí)將幾率密度函數(shù)應(yīng)用到未知結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)序列上，通過優(yōu)化分子的幾率密度函數(shù)使制約條件有最小的沖突而得到目標(biāo)蛋白的三維結(jié)構(gòu)，整個優(yōu)化過程通過分子力學(xué)和分子動力學(xué)模擬來實(shí)現(xiàn) 。,.,92,6. 同源建模法分析步驟： 多序列比對 與已有晶體結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)序列比對 確定是否有可以使用的模板 序列相似度30% 序列相似度30%，結(jié)合功能，蛋白質(zhì)一級序列、二級結(jié)構(gòu)或結(jié)構(gòu)域信息 構(gòu)建三維模型 三維模型準(zhǔn)確性檢驗(yàn) Whatcheck 程序 Ramachandran plot計(jì)算檢驗(yàn) 手工調(diào)整多序列比對，重新擬和，

41、構(gòu)建新的模型,.,93,.,94,.,95,.,96,.,97,.,98,蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)預(yù)測,SWISS-MODEL工具 http:/www.expasy.ch/swissmod/SWISS-MODEL.html 同源建模方法 與PDB數(shù)據(jù)庫已知結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)序列比對進(jìn)行預(yù)測,.,99,主要參數(shù)/選項(xiàng),.,100,輸出結(jié)果,.,101,.,102,方法二：折疊識別/ 穿線方法 對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的預(yù)測,背景：序列比對后所擊中的相似序列不是完整的 而是一段一段的結(jié)構(gòu)域，也可以通過二級結(jié)構(gòu)預(yù)測 和折疊識別（fold recognition)找到合適的折疊子， 再以這些已知結(jié)構(gòu)的折疊子為模板來構(gòu)建模型。,.

42、,103,折疊識別/ 穿線方法,觀察：有限的蛋白質(zhì)折疊種類（1,000?） 與“從頭開始”來預(yù)測蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)不同，我們可以從有限的蛋白質(zhì)折疊條目中得到正確的結(jié)果。 基于序列技巧可以做到這一點(diǎn)，或者通過穿線法將序列按順序投到模板上，并評價(jià)每一個匹配好壞程度,.,104,折疊識別/ 穿線方法,原理：將序列“穿”入已知的各種蛋白質(zhì)折疊子骨架內(nèi)， 通過目的蛋白序列與已知折疊子的逐一比對，計(jì)算出 未知結(jié)構(gòu)序列折疊成各種已知折疊子的可能性； 折疊子一般包括一個或多個蛋白質(zhì)超家族； 每個折疊子的結(jié)構(gòu)內(nèi)核有確定的結(jié)構(gòu)特征； 基于序列同源性很低的蛋白質(zhì)都可能存在結(jié)構(gòu)相同的 折疊子進(jìn)行預(yù)測。 例如，通過PHYRE系

43、統(tǒng)進(jìn)行折疊識別預(yù)測 http:/www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre/index.cgi,.,105,折疊識別或穿線法,目標(biāo)序列SHPALTQLRALRYCKEIPALDPQLLDWLLLEDSMTKRFEQQ 可能折疊的庫（哪些具有已知序列和結(jié)構(gòu)）：,.,106,序列結(jié)構(gòu)比對,目標(biāo)序列SHPALTQLRALRYCKEIPALDPQLLDWLLLEDSMTKRFEQQ t1t2t3t4t5tn,已知折疊結(jié)構(gòu)的序列s1s2s3s4s5s n 已知折疊結(jié)構(gòu)的位置p1p2p3p4p5pn 怎樣將目標(biāo)序列與結(jié)構(gòu)進(jìn)行比對？,.,107,同源模建與結(jié)構(gòu)類型識別方法的比較 蛋白質(zhì)家族與蛋白質(zhì)

44、結(jié)構(gòu)類型 Family 蛋白質(zhì)家族依據(jù)序列同源性將蛋白質(zhì)分為不同的家族：一般將序列同源性大于30%的蛋白質(zhì)歸屬為一個家族。一個蛋白質(zhì)家族的成員可能由一個共同的祖先進(jìn)化而來。 自然界存在的可能蛋白質(zhì)家族數(shù)目大約為23100種。同一個家族的蛋白質(zhì)一般具有相近的功能和相同的結(jié)構(gòu)類型（折疊模式）。,.,108,3D-PSSM工具 http:/www.sbg.bio.ic.ac.uk/3dpssm/index2.html 由英國倫敦帝國理工學(xué)院維護(hù)，其數(shù)據(jù)庫中含有9864個蛋白折疊結(jié)構(gòu) 3D-PSSM先用PSI-BLAST標(biāo)準(zhǔn)方法通過多序列比對得到輪廓（profile），然后對家族中的一系列成員進(jìn)行結(jié)構(gòu)

45、比對得出該家族的結(jié)構(gòu)輪廓，接著用線串法將模板結(jié)構(gòu)輪廓和待測蛋白的序列輪廓進(jìn)行1D-3D輪廓之間的比對，此外也考慮了溶劑可及性和二級結(jié)構(gòu)信息,.,109,.,110,輸入用戶Email（必需）,蛋白質(zhì)描述（選填）,序列提交框（氨基酸單字母）,Phyre -http:/www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre/ 3d-PSSM的升級版，增加了fold數(shù)據(jù)，并且性能上提高10-15，采用了新的分析界面,.,111,二級結(jié)構(gòu)預(yù)測,.,112,序列比對結(jié)果,序列比對一致性,模板長度,靶標(biāo)蛋白模型,模板蛋白結(jié)構(gòu)分類信息,折疊子描述,.,113,.,114,.,115,常用蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)觀察和修

46、改工具,.,116,Chime網(wǎng)絡(luò)游覽器插件,Chime- 基于游覽器的三維結(jié)構(gòu)觀察工具 安裝后在Internet Explorer下的 PLUGINS文件夾中會有： npchime.dll (plugins folder) npchime.zip (plugins folder, used for LiveConnect) NOTE: Do not unzip this file chimepro.html (plugins folder, the release notes for Chime) chime26.isu (plugins folder, used to uninstall

47、Chime) sculptapi.dll (Windows System folder, used for Sculpt) ChimeShim.dll (plugins folder, Internet Explorer only),.,117,.,118,SWISS-PdbView觀察三維模型,SWISS-PdbView工具 /spdbv/ 觀察和修改分子的三維結(jié)構(gòu),.,119,.,120,Ramachandran圖,結(jié)構(gòu)疊加,.,121,蛋白質(zhì)序列分析匯總表,課程總結(jié),.,122,課程總結(jié),.,123,四、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測的應(yīng)用,蛋白質(zhì)的

48、分子設(shè)計(jì),.,124,蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)與基因工程技術(shù)、多肽合成技術(shù)和化學(xué)合成技術(shù)一起開創(chuàng)了新藥設(shè)計(jì)和開發(fā)研究的新局面。 這個領(lǐng)域的研究方向主要包括蛋白三維結(jié)構(gòu)預(yù)測、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能關(guān)系研究、蛋白相互作用、蛋白與DNA相互作用、蛋白質(zhì)突變體的分子設(shè)計(jì)、全新蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)等。,.,125,1. 分子設(shè)計(jì)的意義,分子生物學(xué)最激動人心的進(jìn)展之一是能夠設(shè)計(jì)和生產(chǎn)新的蛋白質(zhì)分子。重組DNA技術(shù)使人們能夠定向改變蛋白質(zhì)中的氨基酸序列，包括氨基酸的取代、插入或缺失，甚至包括蛋白質(zhì)的融合等。 蛋白質(zhì)工程則是在深入了解蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的基礎(chǔ)上，利用分子生物學(xué)方法和手段有目的地改造蛋白質(zhì)，使之性能得到改善。作為蛋白質(zhì)工

49、程的組成部分，蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)在其中起著十分重要的作用。,.,126,.,127,從預(yù)期的蛋白質(zhì)功能出發(fā)設(shè)計(jì)預(yù)期的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)推測應(yīng)有的氨基酸序列找到相對應(yīng)的脫氧核苷酸（基因）,.,128,2. 分子設(shè)計(jì)的種類,小改：少數(shù)殘基的替換，突變或修飾 中改：分子拼接，肽段或結(jié)構(gòu)域的替換 大改：從頭設(shè)計(jì)，全新蛋白質(zhì)的設(shè)計(jì),3.分子設(shè)計(jì)與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu) 蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的電荷分布、相互作用有其特定的結(jié)構(gòu)特征，隨意選擇突變位點(diǎn)在蛋白質(zhì)分子中改變氨基酸，不僅達(dá)不到預(yù)期目的，反而可能影響蛋白質(zhì)分子的活性中心，使蛋白質(zhì)的活性降低或喪失 。,.,129,4. 蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)的應(yīng)用 應(yīng)用1：酶穩(wěn)定性的改善酶的穩(wěn)定性 在蛋白質(zhì)

50、工程的實(shí)踐中，一般可以通過在酶分子內(nèi)增加二硫鍵或靜電作用來提高酶分子的穩(wěn)定性。 例1：核糖核酸酶的穩(wěn)定性的提高 （1）已知條件：核糖核酸酶三維結(jié)構(gòu)已由晶體衍射方法測定。 分子內(nèi)有兩對二硫鍵：Tyr24與Asn84正對，二者的Ca之間的距離為6.0A，滿足二硫鍵的特征（二硫鍵的Ca的平均距離：4.5- 6.8），可能形成一個潛在的二硫鍵；二者附近沒有干擾形成二硫鍵的基團(tuán)；二者離催化活性中心較遠(yuǎn)，突變后不會影響活性。 （2）設(shè)計(jì)方案：將Tyr24與Asn84突變?yōu)镃ys實(shí)驗(yàn)結(jié)果：突變體的穩(wěn)定性大大提高,.,130,例2.葡萄糖異構(gòu)酶（GI） 在工業(yè)上應(yīng)用廣泛，為提高其熱穩(wěn)定性，朱國萍等人在確定第1

51、38位甘氨酸(Gly138)為目標(biāo)氨基酸后，用雙引物法對GI基因進(jìn)行體外定點(diǎn)誘變，以脯氨酸（Pro138）替代Gly138，含突變體的重組質(zhì)粒在大腸桿菌中表達(dá)，結(jié)果突變型GI比野生型的熱半衰期長一倍；最適反應(yīng)溫度提高1012；酶比活相同。 據(jù)分析，Pro替代Gly138后，可能由于引入了一個吡咯環(huán)，該側(cè)鏈剛好能夠填充于Gly138附近的空洞，使蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)更具剛性，從而提高了酶的熱穩(wěn)定性。,.,131,應(yīng)用2：融合蛋白質(zhì) 腦啡肽(Enk)N端5肽線形結(jié)構(gòu)是與型受體結(jié)合的基本功能區(qū)域，干擾素（IFN）是一種廣譜抗病毒抗腫瘤的細(xì)胞因子。黎孟楓等人化學(xué)合成了EnkN端5肽編碼區(qū)，通過一連接5肽編碼

52、區(qū)與人1型IFN基因連接，在大腸桿菌中表達(dá)了這一融合蛋白。以體外人結(jié)腸腺癌細(xì)胞和多形膠質(zhì)瘤細(xì)胞為模型，采用3H胸腺嘧啶核苷摻入法證明該融合蛋白抑制腫瘤細(xì)胞生長的活性顯著高于單純的IFN，通過Naloxone競爭阻斷實(shí)驗(yàn)證明，抑制活性的增高確由Enk導(dǎo)向區(qū)介導(dǎo)。,.,132,應(yīng)用3：蛋白質(zhì)活性的改變 通常飯后3060min，人血液中胰島素的含量達(dá)到高峰，120180min內(nèi)恢復(fù)到基礎(chǔ)水平。而目前臨床上使用的胰島素制劑注射后120min后才出現(xiàn)高峰且持續(xù)180240min，與人生理狀況不符。實(shí)驗(yàn)表明，胰島素在高濃度（大于105mol/L）時(shí)以二聚體形式存在，低濃度時(shí)（小于109mol/L）時(shí)主要以單體形式存在。設(shè)計(jì)速效胰島素原則就是避免胰島素形成聚合體。 類胰島素生長因子I(IGF