免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)：NK細(xì)胞毒檢測(cè)

1、1,NK細(xì)胞毒檢測(cè),2,自然殺傷細(xì)胞（NK）介導(dǎo)天然免疫應(yīng)答，它不依賴抗體和補(bǔ)體，即能直接殺傷靶細(xì)胞，如腫瘤細(xì)胞或被病毒感染的細(xì)胞等；此外，尚有免疫調(diào)節(jié)功能，也參與移植排斥反應(yīng)和某些自身免疫病的發(fā)生發(fā)展。 NK細(xì)胞活性可作為判斷機(jī)體抗腫瘤和抗病毒感染的指標(biāo)之一。例如在血液系統(tǒng)腫瘤、實(shí)體瘤、免疫缺陷病、艾滋病和某些病毒感染患者，NK活性減低；宿主抗移植物反應(yīng)者，NK活性升高。,NK細(xì)胞活性檢測(cè),3,實(shí)驗(yàn)分組及材料 實(shí)驗(yàn)原理 檢測(cè)方法 主要操作步驟 結(jié)果判定,主 要 內(nèi) 容,4,器材 75%酒精 若干 5ml注射器 1個(gè)/組 100ml燒杯 1個(gè)/組 無菌紗網(wǎng) 1塊/組 無菌平皿 1塊/組 無菌吸

2、頭（大、中、?。?盒/room 無菌96孔培養(yǎng)板 1塊/組 無菌離心筒 1個(gè)/組 可調(diào)微量加樣器 1套/組 細(xì)胞計(jì)數(shù)板 1套/組 顯微鏡 1臺(tái)/組 EP管 若干 眼科剪、小鑷子 1套/ 組 細(xì)胞培養(yǎng)箱 1臺(tái)/room 酶標(biāo)儀 1臺(tái) 離心機(jī) 2個(gè)/room 超凈臺(tái) 1臺(tái)/組,動(dòng)物、細(xì)胞及試劑 小鼠 1只/組(NS,OVA) YAC-1 1*106 * 2ml 培養(yǎng)液（DMEM) 無FCS 10ml/組 培養(yǎng)液(DMEM)10%FCS 10ml/組 LDH底物 3ml/組 檸檬酸（終止液） 1ml/組,分組： 每組4人 1只小鼠,實(shí)驗(yàn)分組及材料,5,NK（natural killer ）細(xì)胞屬非特

3、異性免疫細(xì)胞，為機(jī)體的天然免疫系統(tǒng)中主要的效應(yīng)細(xì)胞，是與T、B細(xì)胞并列的第三類群淋巴細(xì)胞。 NK細(xì)胞可非特異直接殺傷靶細(xì)胞，這種天然殺傷活性既不需要預(yù)先由抗原致敏，也不需要抗體參與，且無MHC限制。 YAC-1細(xì)胞為Moloney鼠科白血病毒(Mo-MuLV)感染的鼠T淋巴瘤細(xì)胞，對(duì)NK細(xì)胞敏感，可用于檢測(cè)NK細(xì)胞的殺傷活性。,原 理,通過殺傷激活受體（KAR）直接識(shí)別,通過抗體間接識(shí)別：ADCC,分泌殺傷介質(zhì)： perforin granzyme TNF IFN,清除異常細(xì)胞 （腫瘤、病原體感染）,NK細(xì)胞功能：清除異常細(xì)胞,通過殺傷激活受體（KAR）直接識(shí)別,通過抗體間接識(shí)別：ADCC,實(shí)

4、驗(yàn)原理,NK細(xì)胞+靶細(xì)胞,靶細(xì)胞破裂,釋放內(nèi)容物,胞漿內(nèi)酶類 LDH酶活性,胞漿內(nèi)蛋白 放射性鉻酸鈉 51Cr標(biāo)記,DNA 3H-TdR摻入,10,密度梯度離心 Ficoll 密度梯度離心 Percoll密度梯度離心 磁化細(xì)胞分離器分離法,NK細(xì)胞分離方法,11,同位素釋放法： 51Cr、3H-TdR、125I-UdR 乳酸脫氫酶釋放法 (本次實(shí)驗(yàn)采用),常用的檢測(cè)方法,12,G0,G1,S,Na251CrO4、 3H-TdR、125I-UdR,New DNA Or Protein,cpm,同位素釋放法,13,應(yīng)用放射性同位素（ 如51Cr）標(biāo)記靶細(xì)胞，當(dāng)靶細(xì)胞受到NK細(xì)胞攻擊，靶細(xì)胞被破壞，

5、釋放出51Cr。51Cr輻射射線，通過測(cè)定受損傷或死亡靶細(xì)胞釋放到上清中51Cr的放射脈沖數(shù)(cpm)，即可計(jì)算出NK細(xì)胞毒活性。,同位素釋放法,14,乳酸脫氫酶(LDH)存在于細(xì)胞內(nèi)，正常情況下，不能透過細(xì)胞膜。當(dāng)細(xì)胞受到損傷時(shí)，LDH可從細(xì)胞內(nèi)釋放至培養(yǎng)液中。釋放出來的LDH在催化乳酸生成丙酮酸的過程中，使氧化型輔酶I(NAD+)變成還原型輔酶(NADH)，后者再通過遞氫體-吩嗪二甲酯硫酸鹽(PMS)還原碘硝基氯化氮唑藍(lán)(INT)或硝基氯化四氮唑藍(lán)(NBT)形成有色的甲基化合物，在570nm波長(zhǎng)處有一吸收峰，利用讀取的值，可測(cè)得殺傷細(xì)胞毒活性。,乳酸脫氫酶釋放法-原理,15,靶細(xì)胞 YAC

6、-1,NK 殺傷,LDH 釋放到細(xì)胞外,無色底物,LDH底物,還 原,有色物質(zhì),測(cè)OD570值,乳酸脫氫酶釋放法,靶細(xì)胞 膜損傷,最大釋放均值（Max）=最大釋放孔cpm均值-最大釋放對(duì)照孔cpm均值 自發(fā)釋放均值（S自發(fā)）=自發(fā)釋放孔cpm均值-培養(yǎng)基對(duì)照孔cpm均值,殺傷率( %)=,Max- S自發(fā),實(shí)驗(yàn)值-自發(fā)釋放值,100,16,操作流程,1W,無菌取脾 研磨成單細(xì)胞懸液+2ml 1640（無FBS),細(xì)胞計(jì)數(shù) 【?/ml】 取20ul細(xì)胞+980ul的1640 混勻后取出20ul細(xì)胞+20ul臺(tái)盼藍(lán),加板(三復(fù)孔) (加法見附圖),調(diào)細(xì)胞濃度 1107 /ml,5%CO2 37培養(yǎng)

7、2小時(shí),離心，取100ul上清移入新孔， 37孵育10min,加入底物 100ul/well 室溫避光孵育15min,30l /孔 1mol/L檸檬酸,酶標(biāo)儀測(cè)吸光度值：OD570nm,結(jié)果判定：,培養(yǎng)YAC1細(xì)胞 10%FBS1640培養(yǎng)液,調(diào)細(xì)胞濃度 1106/ml,17,單細(xì)胞懸液的制備 小鼠脫臼處死，75%酒精浸泡消毒2-3分鐘。 于超凈臺(tái)內(nèi)取出脾組織，放入預(yù)先盛有5ml 1640培養(yǎng)液的平皿內(nèi)。 用紗網(wǎng)包裹住脾組織，將脾剪成小塊，用5ml注射器塞輕壓使脾細(xì)胞透過紗網(wǎng)。然后用1000ul加樣器隔著紗網(wǎng)將細(xì)胞懸液吸出，放入50ml 離心管中，再分別用1ml培養(yǎng)液沖洗紗網(wǎng)和平皿，并將細(xì)胞懸

8、液吸出，放入同一50ml離心管中，剩余3ml培養(yǎng)液備用。 1000rpm，常溫離心10分鐘，棄上清，加1ml 1640培養(yǎng)液重懸細(xì)胞。 細(xì)胞計(jì)數(shù)： 取上述制備好的細(xì)胞懸液混勻后取出20ul，加到盛有980ul計(jì)數(shù)液的EP管中，混勻后取出20ul到一個(gè)新的EP管中，再向其中加入20ul臺(tái)盼藍(lán)染料，混勻后取20ul計(jì)入到細(xì)胞計(jì)數(shù)版上，在顯微鏡下計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)方法見后。 調(diào)脾細(xì)胞濃度至1108/ml，每組所需總量為1ml 調(diào)YAC1細(xì)胞濃度至1106/ml，每組需2ml 注意:在稀釋前一定將原細(xì)胞懸液混勻，否則細(xì)胞長(zhǎng)時(shí)間沉淀使細(xì)胞數(shù)不準(zhǔn)。,實(shí)驗(yàn)步驟,18,細(xì)胞培養(yǎng)： 按圖所示加板。 將板做好標(biāo)記，在倒置

9、顯微鏡下觀察細(xì)胞，然后放于37 5%CO2培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)2小時(shí)。 LDH底物： 在培養(yǎng)2小后，1000rpm，離心5min，取100ul上清液移入新孔內(nèi)，于每孔內(nèi)加入LDH底物 100ul，加完后輕輕搕板，使之混勻。 室溫避光保存15min。 取出，加入1mol/L檸檬酸， 30l /孔。酶標(biāo)儀讀數(shù)前保證沒有氣泡。 結(jié)果測(cè)定： 結(jié)果測(cè)量：用酶標(biāo)儀測(cè)定光密度值：OD570nm。記錄結(jié)果。 結(jié)果判定： Max （ 靶細(xì)胞最大釋放）=最大釋放孔均值-最大釋放對(duì)照孔均值 S自發(fā) （靶細(xì)胞自發(fā)釋放） =自發(fā)釋放孔均值-培養(yǎng)基對(duì)照孔均值 注： S自發(fā) 0，做“0”處理,實(shí) 驗(yàn) 步 驟,SI=,Max- S自發(fā),實(shí)驗(yàn)孔值-自然釋放孔值,100%,19,Max=E-F S自