第12章 轉(zhuǎn)基因、基因敲除和RNA干涉.ppt

1、第十二章 基因敲除和RNA干涉,內(nèi)容,第一節(jié) 基因敲除,基因敲除（gene knock-out）又稱基因打 靶，通過外源DNA與染色體DNA之間的同源重 組，進(jìn)行精確的定點(diǎn)修飾和基因改造，具有 專一性強(qiáng)、染色體DNA可與目的片段共同穩(wěn) 定遺傳等特點(diǎn)。,二、基因敲除技術(shù),定義：通過一定的途徑使機(jī)體特定的基因失活或缺失的技術(shù)。,1、應(yīng)用DNA同源重組原理進(jìn)行基因敲除。,2、利用隨機(jī)插入突變進(jìn)行基因敲除,3、RNA干擾也可以引起基因敲除,基因敲除技術(shù)與諾貝爾獎,醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的諾貝爾獎（2007年）已經(jīng)揭曉。三位在基因敲除技術(shù)方面進(jìn)行了卓越、開拓性工作并取得了顯著成就的科學(xué)家分享了諾貝爾生理或醫(yī)學(xué)獎，他們

2、是美國鹽湖城猶他州大學(xué)的Marie Capecchi教授、美國北卡羅來納州大學(xué)的Oliver smithies教授以及英國加蒂夫大學(xué)的Martin Evans教授 摘自中華醫(yī)學(xué)信息 2007年第22卷第21期,基因敲除分為完全基因敲除和條件型基因敲 除（又稱不完全基因敲除）兩種。 完全基因敲除是指通過同源重組法完全消除 細(xì)胞或者動物個體中的靶基因活性，條件型 基因敲除是指通過定位重組系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)特定時間和空間的基因敲除。,一、實(shí)現(xiàn)基因敲除的多種原理和方法,1 利用基因同源重組進(jìn)行基因敲除 基因敲除是80年代后半期應(yīng)用DNA同源重組原理發(fā)展起來的。80年代初，胚胎干細(xì)胞（ES細(xì)胞）分離和體外培養(yǎng)的成

3、功奠定了基因敲除的技術(shù)基礎(chǔ)。 1985年，首次證實(shí)的哺乳動物細(xì)胞中同源重組的存在奠定了基因敲除的理論基礎(chǔ)。 到1987年，Thompsson首次建立了完整的ES細(xì)胞基因敲除的小鼠模型。 直到現(xiàn)在，運(yùn)用基因同源重組進(jìn)行基因敲除依然是構(gòu)建基因敲除動物模型中最普遍的使用方法。,步驟,基因載體的構(gòu)建 ES 細(xì)胞的獲得 同源重組 選擇篩選已擊中的細(xì)胞 表型研究 得到純合體,1、條件性基因敲除法,條件性基因敲除法可定義為將某個基因的修飾限制于小鼠某些特定類型的細(xì)胞或發(fā)育的某一特定階段的一種特殊的基因敲除方法,噬菌體的Cre/Loxp系統(tǒng)、酵母 細(xì)胞的FLP/FRT系統(tǒng)，尤以Cre/Loxp系統(tǒng) 應(yīng)用最為廣

4、泛。,2、4誘導(dǎo)性基因敲除法,誘導(dǎo)性基因敲除也是以Cre/loxp 系統(tǒng)為基礎(chǔ)，但卻是利用控制Cre 表達(dá)啟動子的活性或所表達(dá)的Cre 酶活性具有可誘導(dǎo)的特點(diǎn) 幾種誘導(dǎo)性類型如下：四環(huán)素誘導(dǎo)型(圖4)；干擾素誘導(dǎo)型；激素誘導(dǎo)型；腺病毒介導(dǎo)型, 誘導(dǎo)基因突變的時間可人為控制； 可避免因基因突變而致死胎的問題 在2 個loxP 位點(diǎn)之間的重組率較高；如用病毒或配體DNA 復(fù)合物等基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)來介導(dǎo)Cre 的表達(dá)，則可省去建立攜帶Cre 的轉(zhuǎn)基因動物的過程。,二、隨機(jī)插入突變進(jìn)行基因敲除,細(xì)胞基因組中進(jìn)行隨機(jī)插入突變，建立一個攜帶隨機(jī)插入突變的細(xì)胞庫，然后通過相應(yīng)的標(biāo)記進(jìn)行篩選獲得相應(yīng)的基因敲除細(xì)胞

5、 逆轉(zhuǎn)率病毒可用于動植物細(xì)胞的插入；對于植物細(xì)胞而言農(nóng)桿菌介導(dǎo)的T-DNA轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)座子比較常用；噬菌體可用于細(xì)菌基因敲除,基因捕獲法,最近發(fā)展起來的利用隨機(jī)插入突變進(jìn)行基因敲除的新型方法 neo 基因插入到ES 細(xì)胞染色體組中，并利用捕獲基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件實(shí)現(xiàn)表達(dá) 中靶基因的信息可以通過篩選標(biāo)記基因側(cè)翼cDNA或染色體組序列分析來獲得,基因捕獲法的優(yōu)缺點(diǎn),建立一個攜帶隨機(jī)插入突變的ES 細(xì)胞庫 節(jié)省大量篩選染色體組文庫以及構(gòu)建特異打靶載體的工作及費(fèi)用 更有效和更迅速地進(jìn)行小鼠染色體組的功能分析,第二節(jié) RNA干涉,概念 原理,概念,這種向生物體中導(dǎo)入雙鏈RNA 后,引起生物體內(nèi)同源基因沉默(

6、silencing) 的現(xiàn)象稱作RNA 干涉 自然條件下，RNA 干涉對于抵抗病毒入侵、抑制轉(zhuǎn)座子活動、生物體的發(fā)育和基因表達(dá)調(diào)控都有重要作用,RNAi阻斷基因表達(dá)的機(jī)理,雙鏈RNA進(jìn)入細(xì)胞后，能夠在Dicer酶的作用下被裂解成siRNA 雙鏈RNA還能在RdRP 的作用下自身擴(kuò)增后，再被Dicer酶裂解成siRNA SiRNA的雙鏈解開變成單鏈，和已知蛋白形成復(fù)合物（Argonaute2）結(jié)合，復(fù)合物同與siRNA互補(bǔ)的mRNA結(jié)合，一方面使mRNA被RNA酶裂解， 以SiRNA作為引物，以mRNA為模板，在RdRP作用下合成出mRNA的互補(bǔ)鏈。結(jié)果mRNA也變成了雙鏈RNA，它在Dicer酶的作用下也被裂解成siRNA。 這些新生成的siRNA也具有誘發(fā)RNAi的作用，通過這個聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，細(xì)胞內(nèi)的siRNA大大增加， 長的雙鏈RNA阻斷基因表達(dá)的效果明顯強(qiáng)于短的雙鏈RNA,步驟,設(shè)計(jì)反向DNA序列 重組載體 轉(zhuǎn)染細(xì)胞 檢測目的