臨床微生物：細(xì)菌形態(tài)學(xué)檢查、培養(yǎng)和分離技術(shù)

1、2020/12/19,1,細(xì)菌檢驗的基本技術(shù),第一節(jié) 細(xì)菌形態(tài)學(xué)檢查 第二節(jié) 細(xì)菌的培養(yǎng)和分離技術(shù) 第三節(jié) 細(xì)菌的生化鑒定技術(shù) 第四節(jié) 細(xì)菌的非培養(yǎng)檢驗技術(shù) 第五節(jié) 細(xì)菌檢驗的自動化,2020/12/19,2,本次課程學(xué)習(xí)要求,掌握：革蘭染色原理、方法、結(jié)果觀察和影響因素。培養(yǎng)基的概念、種類和定義。細(xì)菌分離接種方法及意義。細(xì)菌培養(yǎng)方法和不同培養(yǎng)基上的生長表現(xiàn)。 熟悉：顯微鏡種類及作用。其他染色方法意義。培養(yǎng)基的組成和制備過程。臨床標(biāo)本檢查時培養(yǎng)基的選擇。,2020/12/19,3,微生物分離鑒定流程,2020/12/19,4,第一節(jié) 細(xì)菌的形態(tài)學(xué)檢查,工具：顯微鏡,顯微鏡檢查的目的：,1.了解

2、標(biāo)本中有無細(xì)菌及大致的菌量 2.根據(jù)標(biāo)本中細(xì)菌染色性、形態(tài)和排列等特征對標(biāo)本中的病原菌進(jìn)行初步判斷，對臨床早期診斷和治療疾病有一定的參考意義,方法：包括不染色標(biāo)本檢查法和染色標(biāo)本檢查法,2020/12/19,5,革蘭染色鏡下結(jié)果,2020/12/19,6,常用的顯微鏡 （1）普通光學(xué)顯微鏡（light microscope） 光源：可見光，波長0.40.7m 分辨率：0.2m （2）暗視野顯微鏡（darkfield microscope） （3）相差顯微鏡（phase contrast microscope） （4）熒光顯微鏡（fluorescence microscope） （5）電子顯微鏡

3、（electron microscope）,返回,最常用,2020/12/19,7,普通光學(xué)顯微鏡,2020/12/19,8,目的：主要用于檢查生活狀態(tài)下細(xì)菌的動力及運(yùn)動狀況。 常用的方法：懸滴法和壓滴法,一、不染色標(biāo)本直接鏡檢,臨床使用不多,2020/12/19,9,懸滴法檢查細(xì)菌的動力,2020/12/19,10,常用,NS,2020/12/19,11,不染色標(biāo)本鏡下結(jié)果觀察： 動力（+），動力（-） 觀察時注意：用普通光學(xué)顯微鏡高倍鏡觀察，調(diào)小顯微鏡的光柵。,有動力(+)：可看到細(xì)菌自一處移至另一處，有明顯的方向性位移。 無動力(-)：細(xì)菌呈現(xiàn)布朗運(yùn)動，只在原地顫動而無位置的改變。,20

4、20/12/19,12,意義：有些病原菌通過不染色標(biāo)本的動力檢查可作出初步鑒定： 如疑似霍亂患者“米泔水樣”便中發(fā)現(xiàn)穿梭樣運(yùn)動細(xì)菌，可輔助診斷。 螺旋體輔助診斷,2020/12/19,13,（一）常用染料（色基+助色基） 1堿性染料：堿性復(fù)紅、結(jié)晶紫、美藍(lán)等， 電離后帶正電荷，常用于細(xì)菌染色（原因何在？）。 2酸性染料：有伊紅、剛果紅等，電離后帶負(fù)電荷。 3復(fù)合染料：有瑞氏染料（伊紅美藍(lán)）、姬姆薩染料（伊紅天青）等 。,二、染色標(biāo)本的顯微鏡檢查,2020/12/19,14,（二）常用的染色方法：正染色法和負(fù)染色法 染色檢查觀察內(nèi)容：觀察細(xì)菌的染色性、 形態(tài)、 排列、大小、某些特殊結(jié)構(gòu)等。 染色

5、的基本步驟：涂片、干燥、固定、染色。,2020/12/19,15,革蘭染色鏡下結(jié)果,2020/12/19,16,（1）細(xì)菌的涂片制作方法, 菌懸液：直接涂布,固體培養(yǎng)基上細(xì)菌：先加NS至載玻片再加菌落（苔）涂勻,2020/12/19,17,（2）涂片的干燥 （3）涂片的固定,2020/12/19,18,（4）染色方法：革蘭染色、抗酸染色、熒光染色等 革蘭染色（gram stain）,2020/12/19,19,革蘭染色結(jié)果,革蘭陽性球菌,革蘭陰性桿菌,2020/12/19,20,革蘭陰性球桿菌,革蘭染色原理,細(xì)胞壁學(xué)說 等電點(diǎn)學(xué)說 化學(xué)學(xué)說,2020/12/19,21,革蘭陽性菌和陰性菌細(xì)胞壁

6、組成不同,革蘭陽性菌和陰性菌等電點(diǎn)不同,革蘭陽性菌和陰性菌體內(nèi)含有的核糖核酸鎂鹽不同,2020/12/19,22,革蘭染色影響因素,細(xì)菌因素 操作因素 染色劑因素,2020/12/19,23,2抗酸染色 （acid-fast stain） 可將細(xì)菌分為兩大類： -抗酸性細(xì)菌（紅色） -非抗酸性細(xì)菌（藍(lán)色）,抗酸染色原理,分枝桿菌等細(xì)菌細(xì)胞壁含有分枝菌酸，不容易跟石炭酸復(fù)紅等染料結(jié)合，但一旦這些染料通過加熱方式跟分枝菌酸結(jié)合后便很牢固，能抵抗鹽酸酒精的脫色作用而保持紅色。,2020/12/19,24,2020/12/19,25,2020/12/19,26,抗酸染色結(jié)果,2020/12/19,27

7、,3熒光染色 （1）熒光染色法敏感性強(qiáng)，效率高而且容易觀察結(jié)果，在臨床細(xì)菌鑒定中有很大的實用價值。 （2）主要用于結(jié)核分枝桿菌、麻風(fēng)分枝桿菌、白喉棒狀桿菌及痢疾志賀菌等的檢測。,結(jié)核分枝桿菌金胺O染色片,2020/12/19,28,4.特殊染色 （1）鞭毛染色：可觀察到菌體上有無鞭毛、鞭毛的位置及數(shù)量，在細(xì)菌鑒定中，特別是非發(fā)酵菌的鑒定中很重要。 （2）異染顆粒染色 用于白喉棒狀桿菌染色。 （3）芽孢和莢膜染色,2020/12/19,29,負(fù)染色法：墨汁染色， 一般用于新型隱球菌檢查,不需要干燥和固定,2020/12/19,30,第二節(jié) 細(xì)菌培養(yǎng)和分離技術(shù),主要內(nèi)容： 一、培養(yǎng)基 培養(yǎng)基的概念

8、、培養(yǎng)基的組成成分、培養(yǎng)基種類和定義、培養(yǎng)基的制備 二、細(xì)菌的人工培養(yǎng)與分離 無菌技術(shù)、細(xì)菌的接種與分離方法、細(xì)菌培養(yǎng)方法、細(xì)菌的生長現(xiàn)象、臨床標(biāo)本細(xì)菌培養(yǎng)時培養(yǎng)基的選擇,2020/12/19,31,培養(yǎng)基（culture medium）概念： 是由人工方法配制而成的，供微生物生長繁殖使用的混合營養(yǎng)物制品。,一、培養(yǎng)基,2020/12/19,32,(一)培養(yǎng)基的組成成分 1營養(yǎng)物質(zhì)：碳源、氮源、無機(jī)鹽、生長因子等。 蛋白胨、肉浸液、牛肉膏、糖類、醇類、血液、 無機(jī)鹽類、雞蛋和動物血清、生長因子 2水和凝固物質(zhì) 瓊脂（凝點(diǎn)和熔點(diǎn)相距大） 3抑制劑和指示劑,2020/12/19,33,（二）培養(yǎng)基

9、種類和定義 按用途分類： 1基礎(chǔ)培養(yǎng)基（based medium） 2營養(yǎng)培養(yǎng)基（nutrient medium） 3鑒別培養(yǎng)基（differential medium） 4選擇培養(yǎng)基（selective medium） 5特殊培養(yǎng)基（special medium）,2020/12/19,34,（1）基礎(chǔ)培養(yǎng)基(based medium) 含有細(xì)菌生長繁殖所需要的基本營養(yǎng)成分的培養(yǎng)基。最常用的是肉浸液，俗稱肉湯（broth）和營養(yǎng)瓊脂。,2020/12/19,35,（2）營養(yǎng)培養(yǎng)基（nutrient medium） 在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入血液、生長因子等成分配制而成的培養(yǎng)基。最常用的是血瓊脂平板、

10、巧克力血平板等。,2020/12/19,36,（3）鑒別培養(yǎng)基（differential medium） 在培養(yǎng)基中加入特定的底物和酸堿指示劑，觀察細(xì)菌在生長過程中分解底物所釋放的不同產(chǎn)物，通過指示劑的反應(yīng)來鑒別細(xì)菌，如各種糖、苷、醇類發(fā)酵管等。,2020/12/19,37,各種糖苷醇類發(fā)酵管,常用指示劑：溴甲酚紫、溴麝香草酚藍(lán)、酚紅等,底物：各種糖、苷、醇類、氨基酸等,溴甲酚紫： 酸性 堿性,2020/12/19,38,溴麝香草酚藍(lán)在酸堿環(huán)境中的顏色變化,酸性 中間過渡 堿性,2020/12/19,39,酚紅 堿性 酸性,2020/12/19,40,甲基紅：酸pH4.4紅色 堿pH6.2黃色

11、 中性紅：酸性pH6.8紅色，堿性黃色,厭氧指示劑： 亞甲藍(lán)和刃天青 （無氧：都是無色， 有氧：亞甲藍(lán)藍(lán)色，刃天青紅色）,2020/12/19,41,刃天青 亞甲藍(lán),2020/12/19,42,雙糖鐵(KIA)培養(yǎng)基,斜面觀察：乳糖 底層觀察：葡萄糖、硫化氫、產(chǎn)氣 指示劑：多用酚紅（酸：黃，堿：紅）,2020/12/19,43,（4）選擇培養(yǎng)基 （selective medium） 培養(yǎng)基中加入抑制劑，抑制標(biāo)本中雜菌生長，選擇性讓目的菌生長。,SS平板,2020/12/19,44,腸道強(qiáng)選擇性培養(yǎng)基：SS瓊脂,底物：乳糖 指示劑：中性紅（酸性紅色，堿性淡黃色） 抑制劑：膽鹽抑制革蘭陽性菌生長；

12、枸櫞酸鹽和煌綠對大腸埃希菌生長有一定抑制,2020/12/19,45,腸道弱選擇性培養(yǎng)基： 麥康凱瓊脂,底物：乳糖 指示劑：中性紅（酸性紅色，堿性淡黃色） 抑制劑：膽鹽（抑制革蘭陽性菌生長）,大腸埃希菌（紅色菌落）和福氏志賀菌（淡黃色菌落）在麥康凱（Mac)平板上,2020/12/19,46,（5）特殊培養(yǎng)基 （special medium） 厭氧菌培養(yǎng)基 L型培養(yǎng)基,培養(yǎng)基按性狀分類（瓊脂含量不同）,2020/12/19,液體培養(yǎng)基 半固體培養(yǎng)基 固體培養(yǎng)基,不含瓊脂,含0.3%-0.5%瓊脂,含1.5%-2.0%瓊脂,（三）培養(yǎng)基的制備,稱量 溶解 校正pH：最適pH一般為7.2-7.6

13、分裝 滅菌：最常用高壓滅菌法 質(zhì)量檢驗：無菌試驗和效果檢查 保存,2020/12/19,48,二、細(xì)菌的人工培養(yǎng),（一）無菌技術(shù) 概念：防止環(huán)境中的微生物污染待檢物（標(biāo)本），同時防止待檢物中可能存在的病原微生物污染環(huán)境和實驗室人員的系列規(guī)范化操作技術(shù)。,2020/12/19,49,沒有無菌技術(shù)就沒有微生物檢驗的質(zhì)量可言！,2020/12/19,50,1平板劃線分離法 2液體接種法 3固體斜面接種法,4半固體穿刺接種法 5涂布接種法 6傾注平板法,掌握上述分離接種方法和目的,（二）細(xì)菌的接種與分離方法,2020/12/19,51,1. 平板分區(qū)劃線法,2020/12/19,52,1. 平板“之”

14、字形劃線法,2020/12/19,53,分區(qū)劃線培養(yǎng)后結(jié)果,平板劃線的目的：分出單個菌落,2020/12/19,54,2. 液體培養(yǎng)基轉(zhuǎn)種方法,2020/12/19,55,2. 液體接種法 （目的：鑒定、增菌）,3. 固體斜面接種法（目的：雙糖鐵-觀察初步生化反應(yīng)。保存菌種）,4. 半固體穿刺接種法（目的：觀察動力、保存菌種）,2020/12/19,56,半固體穿刺接種后動力（+）和動力（-）結(jié)果,陽性 陰性 空白對照,2020/12/19,57,5. 涂布接種法 （目的：藥敏試驗、菌落計數(shù)）,6. 傾注平板法,將標(biāo)本經(jīng)適當(dāng)稀釋后，取一定量加入已滅菌的平皿內(nèi)，傾入已溶化并冷卻至45左右的定量培

15、養(yǎng)基，混勻，待凝固后倒置、培養(yǎng)。根據(jù)培養(yǎng)基內(nèi)的菌落數(shù)和稀釋倍數(shù)，即可計算出標(biāo)本的細(xì)菌數(shù)。,測定牛乳、飲水和尿液等標(biāo)本細(xì)菌數(shù)（菌落計數(shù)）,2020/12/19,59,1需氧培養(yǎng)法 2二氧化碳培養(yǎng)法 3厭氧培養(yǎng)法 4. 微需氧培養(yǎng)法,（三）細(xì)菌培養(yǎng)方法,大氣環(huán)境,5%-10%CO2,10% H2 10%CO2 85%N2,5% O2 10%CO2 85%N2,（四）細(xì)菌的生長現(xiàn)象,（1）細(xì)菌在固體培養(yǎng)基上的生長現(xiàn)象 菌落：固體培養(yǎng)基上一個細(xì)菌分裂繁殖而形成的肉眼可見的單個細(xì)菌集落。圖 菌苔：多個菌落連接成片的細(xì)菌群落。圖 （2）細(xì)菌在液體培養(yǎng)基中的生長現(xiàn)象 圖 渾濁生長、表面生長、沉淀生長 （3）

16、細(xì)菌在半固體培養(yǎng)基中的生長現(xiàn)象,2020/12/19,60,各種菌落,2020/12/19,62,菌苔,細(xì)菌生長現(xiàn)象觀察,表面 superficial growth,沉淀precipitate growth,對照contrast,混濁t(yī)urbid growth,細(xì)菌在半固體中生現(xiàn)象,動力+ -,2020/12/19,64,根據(jù)標(biāo)本來源和可能存在的病原菌，確定選用各種分離培養(yǎng)基。 1.糞便或肛拭子標(biāo)本：GN肉湯增菌，轉(zhuǎn)種或直接接種SS和Mac平板或中國藍(lán)平板，疑似霍亂接種堿性蛋白胨水。,（五）培養(yǎng)基的選擇,2020/12/19,65,2.血液、骨髓和腦脊液標(biāo)本：用血液增菌培養(yǎng)基(需氧、厭氧），再轉(zhuǎn)種血平板或巧克力平板或厭氧平板。,2020/12/19,66,3. 痰標(biāo)本：選擇血平板、巧克力平板、Mac或中國藍(lán)平板。 4. 尿液標(biāo)本：選擇血平板、 麥康凱 5. 膿標(biāo)本：選擇血平板 6. 泌尿生殖道分泌物：血平板、巧克力平板 7. 其他標(biāo)