生物工程綜合實驗

1、生物工程綜合大實驗?zāi)揪厶鞘谴嬖谟谥参锛毎谥凶钬S富的半纖維素，其化學(xué)結(jié)構(gòu)較纖維素復(fù)雜得多，它是一個以-1,4-糖苷鍵相連的木聚糖主鏈上帶著一些不同的取代基如乙?；?、阿拉伯糖基、4-O-甲基葡萄糖醛酸和阿魏酸殘基等而構(gòu)成的。Endo-1,4-木聚糖內(nèi)切酶（EC 3.2.1.8）簡稱木聚糖酶，是木聚糖降解過程中最關(guān)鍵的一個酶，也是被研究最多的一個半纖維素酶，隨機水解木聚糖主干鏈內(nèi)部的-1,4-糖苷鍵，產(chǎn)生木寡糖、木二糖和少量木糖。木聚糖酶在造紙工業(yè)、飼料工業(yè)、食品工業(yè)、低聚木糖的制備等領(lǐng)域具有重要應(yīng)用價值。本實驗主要以攜帶有編碼極端耐熱木聚糖酶基因的重組質(zhì)粒的大腸桿菌工程菌（JM109-pHsh-

2、xynB）為對象，利用它進行重組酶的發(fā)酵生產(chǎn)和分離純化。通過此次實驗，希望同學(xué)們能對微生物發(fā)酵產(chǎn)酶的一般過程、酶活性的測定、酶的提取和分離純化有一個基本的認識和了解。 實驗一 木糖-吸光度標準曲線、蛋白質(zhì)濃度-吸光度標準曲線制作在研究酶的性質(zhì)、酶的發(fā)酵生產(chǎn)、分離純化和應(yīng)用中需要經(jīng)常測定酶的活性，為了較準確的表示酶活力，必須建立一種簡便靈敏的酶活性測定方法。在酶的分離純化和酶學(xué)性質(zhì)研究中，經(jīng)常要測定酶蛋白質(zhì)的含量。Bradford法是一種迅速可靠的通過染色法測定溶液中蛋白質(zhì)濃度的方法。1、實驗?zāi)康恼莆漳咎菢藴是€和Bradford標準曲線的制作方法2、實驗原理木聚糖酶的活性通常是測定其水解底物木

3、聚糖后生成的產(chǎn)物的還原末端木糖的增加量來進行的，而木糖的含量可以利用其與某些顯色試劑（如DNS試劑，PAHBAH）反應(yīng)后生成在特定波長下有特異吸收峰的有色化合物，從而通過分光光度法測出。本實驗中，木聚糖酶活性的測定是以0.5%燕麥木聚糖為底物，利用對羥基苯甲酸酰肼（PAHBAH）與水解反應(yīng)產(chǎn)生的還原糖反應(yīng)生成的化合物在沸水浴中顯現(xiàn)出黃色，這種化合物在410 nm有最大的吸光值，化合物顏色的深淺與產(chǎn)物還原糖的多少有關(guān)，因此可檢測410nm的光吸收值的大小計算酶活。用分光光度法測定木聚糖水解產(chǎn)物還原糖的含量，先要制作標準曲線，然后根據(jù)標準曲線查出還原糖的含量，最后根據(jù)產(chǎn)物的含量就可以計算出酶的活性

4、。因此，制作標準曲線是酶活性測定的一項基本技術(shù)。Bradford法是基于考馬斯亮藍G-250有紅、藍兩種不同顏色的形式，在一定濃度的乙醇和酸性條件下，可配成淡紅色的溶液，當與蛋白質(zhì)結(jié)合后，產(chǎn)生藍色化合物，反應(yīng)迅速穩(wěn)定，反應(yīng)化合物在465595nm有最大的吸光值，化合物顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度的高低成正比關(guān)系。因此可檢測595nm的光吸收值的大小計算蛋白質(zhì)的含量。同樣，測定某一種蛋白質(zhì)的濃度時，也要先用已知濃度的一種蛋白質(zhì)制作標準曲線，然后根據(jù)標準曲線查出待測蛋白質(zhì)的濃度。3、試劑標準木糖溶液：準確稱取經(jīng)105烘至恒重的無水木糖1g,用蒸餾水定容至100ml(即1%)，實際應(yīng)用時稀釋到0.01%鄰

5、苯二甲酸氫鉀緩沖液： 準確配制0.1 M pH5.8 (90) 的鄰苯二甲酸氫鉀緩沖液 500 ml，利用pH計以NaOH調(diào)節(jié)到規(guī)定鋪pH值終止劑/顯色劑PAHBAH：A: 0.5 M HCl溶解的5%（w/v）對羥基苯甲酸酰肼（p-hydroxybenzoic acid）200 ml，配好后儲藏于4冰箱B: 0.5 M NaOH 1 L使用時，將A與B按1：4的體積比混合即為PAHBAH顯色劑Bradford 儲存液：100 ml 95%乙醇，200 ml 85%磷酸，350mg 考馬斯亮藍G-250可在室溫下長期保持穩(wěn)定Bradford 工作液：425 ml雙蒸水，15 ml 95%乙醇，

6、30 ml 85%磷酸，30 ml Bradford 儲存液濾紙過濾后保存于室溫棕色瓶中標準蛋白質(zhì)溶液:以牛血清白蛋白(BSA )作為標準蛋白，配制成1 mg/ml 標準溶液，用時可稀釋。4、器材分光光度計、電子天平、水浴鍋、煮沸電爐、移液管、泡沫浮子若干、pH計、磁力攪拌器冰水5、實驗步驟：A. 木糖標準曲線的制作木聚糖酶活性的測定是以0.5% 燕麥木聚糖為底物，利用對羥基苯甲酸酰肼（PAHBAH）與水解反應(yīng)產(chǎn)生的還原糖的顯色反應(yīng)進行比色，具體方法是：反應(yīng)體系為600l，添加15 l酶液到由300 l 0.5%（w/v）燕麥木聚糖和285 l 100 mM pH 5.8的鄰苯二甲酸氫鉀緩沖液

7、組成的已經(jīng)在90下預(yù)熱的混合液中，90下保溫10 min后，最后加入1.8 mL終止劑/顯色劑PAHBAH終止反應(yīng)。其混合物在沸水浴中加熱10 min后，在冰水浴中冷卻，用分光光度計在410 nm下測其吸收值。木聚糖酶活性單位定義為每分鐘催化產(chǎn)生1 mol木糖所需的酶量。在制作木糖標準曲線時，整個體系組成也應(yīng)該與實際測定酶活性的條件一致。具體地說，在配制標準曲線時，整個體系應(yīng)為：0.6 mL溶液（ 0.3 mL100 mM pH 5.8的鄰苯二甲酸氫鉀緩沖液+ x mL 木糖溶液+(0.3-x) mL 無菌水）+ 1.8 mL終止劑/顯色劑PAHBAH。其混合物在沸水浴中加熱10 min后，在

8、冰水浴中冷卻，用分光光度計在410 nm下測其吸收值。 將適量 100 mM pH 5.8的鄰苯二甲酸氫鉀緩沖液與標準木糖溶液（0.01%）、無菌水三者混合均勻，保證整個體系的總體積為600 l，通過控制加入木糖溶液的體積量來調(diào)整混合液中木糖的量。每次得到的600l混合液與1.8 mL的PAHBAH試劑混勻后，在沸水浴中加熱10 min后，在冰水浴中冷卻，用分光光度計在410 nm下測定吸光度。以600l混合液里不含標準木糖溶液的為空白對照。0.01%木糖（l）305080100120150180200H2O(l)270250220200180150120100緩沖液(l)3003003003

9、00300300250200PAHBAH(mL)1.81.81.81.81.81.81.81.8A410A410平均值 以A410為縱坐標，木糖的量（mmol）為橫坐標（盡量選取吸光度在0.10.8之間的點），在Excel上繪制標準曲線，經(jīng)線性回歸后得到A410-木糖(mmol)的標準曲線，既：即A410 nm= a x + b, x為木糖 (mmol)，一般相關(guān)系數(shù)R2值應(yīng)在0.99以上，至少小數(shù)點后兩個9。BBradford法測定蛋白質(zhì)濃度標準曲線的制作 按下表將標準蛋白質(zhì)溶液小牛血清白蛋白轉(zhuǎn)移到試管中，補加水至終體積300l，加入3ml Bradford工作液并振蕩混勻，在2min后測定

10、A595值，測量應(yīng)在1h內(nèi)完成。樣品號標準溶液（0.2mg/ml BSA）/mlH2O (ml)Bradford試劑（ml）A595空白對照030030150250350250350250321002003100200310020033150150315015031501503420010032001003200100352505032505032505036300033000330003以A595nm為縱坐標，標準蛋白含量為橫坐標，在Excel上繪制標準曲線，經(jīng)線性回歸后得到A595-蛋白質(zhì)含量(mg)的標準曲線，既：即A595 nm= a x + b, x為蛋白質(zhì)量 (mg)，一般相關(guān)系數(shù)

11、R2值應(yīng)在0.99以上，至少小數(shù)點后兩個9。六、注意事項： 做木糖標準曲線時，要保證所有樣品液同批次煮沸顯色，以盡量避免不同批次的誤差。 稱取各種標準品要準確。Bradford法測定后玻璃比色皿容易染上顏色，用后可先用甲醇清洗，然后用水或丙酮清洗，或在濃HCl中浸泡過夜(或者用硫酸清洗)。 實驗二、重組菌發(fā)酵產(chǎn)酶過程監(jiān)測1、實驗?zāi)康牧私庵亟M菌發(fā)酵產(chǎn)酶原理和過程，掌握重組菌生長過程監(jiān)測和無菌取樣技術(shù)。2、實驗原理 通過基因重組技術(shù)可以使外源基因在大腸桿菌（Escherichia coli）中得到大量表達主要是因為：E.coli攜帶的表達載體上通常都有一個強的啟動子，這樣啟動子控制下的外源基因能夠

12、得到很高的表達量；同時，表達載體通常在細胞中是多個拷貝，這樣使得外源基因在細胞的基因劑量也大大增加，從而也能夠是目的基因的表達量增加。通常一個外源基因在E.coli中表達時，細胞內(nèi)的大部分物質(zhì)被用來產(chǎn)生外源基因的產(chǎn)物，這樣細胞本身用于自身生長繁殖的營養(yǎng)很大部分被占奪，最終導(dǎo)致E.coli細胞的生長明顯受到抑制，表現(xiàn)為最終生長密度不高，目的蛋白產(chǎn)量不高，為了克服這一缺陷，一般的做法是使表達載體上控制外源基因轉(zhuǎn)錄的啟動子是可以控制的，也就是說在細菌生長的初始階段，讓其積累較多的菌體，此時表達載體上的啟動子不表現(xiàn)出轉(zhuǎn)錄活性或者活性非常低，當細胞長到一定濃度后，改變一定的外界環(huán)境后（如添加某種物質(zhì)或培

13、養(yǎng)條件改變），啟動子的活性抑制被解除，此時外源基因便大量轉(zhuǎn)錄表達，最后目的基因編碼的產(chǎn)物能夠得到很高的產(chǎn)量。重組大腸桿菌（E.coli）生產(chǎn)木聚糖酶的途徑為：重組E.coli攜帶有重組質(zhì)粒pHsh-xynB,xynB基因是來源于極端嗜熱厭氧菌海棲熱袍菌（thermotoga maritima）的編碼木聚糖酶的一個基因，pHsh是一種新型的大腸桿菌表達載體，其上有來源于根據(jù)E.coli熱休克基因啟動子保守序列設(shè)計而成的獨特新型熱激啟動子Hsh promoter，當重組菌在30生長時，熱激啟動子Hsh promoter對它下游的目的基因xynB的轉(zhuǎn)錄活性非常低，這樣重組菌能夠快速地生長到一個較高的

14、細胞密度，當細胞生長到對數(shù)期（OD600=0.61.0）早期時，通過快速提高生長溫度到42（即熱激方式）使得熱激啟動子Hsh promoter的活性抑制得到解除。此時編碼木聚糖酶的基因xynB就開始大量表達。同時，該表達載體的復(fù)制子使得xynB基因在E.coli中有很高的拷貝數(shù)，拷貝數(shù)可以達到500600個細胞，這樣使得目的基因能在E.coli中達到很高的表達量。重組菌中木聚糖酶的活性隨發(fā)酵時間不斷發(fā)生變化，可以通過定時取樣監(jiān)測它的產(chǎn)酶過程。定時取樣測定重組菌的細胞密度OD600，重組菌的酶活隨著細胞密度的增加不斷增加，當細胞密度達到比較穩(wěn)定的值時，由于木聚糖酶對應(yīng)的mRNA的穩(wěn)定性很高，所以

15、在以后持續(xù)的幾個小時，酶活仍然持續(xù)的增加，當酶活性開始下降時終止發(fā)酵。3、實驗材料和設(shè)備A. 菌種大腸桿菌E. coli JM109（pHsh-xynB）攜帶有重組質(zhì)粒pHsh-xynBB. 培養(yǎng)基重組大腸桿菌的培養(yǎng)基采用LB培養(yǎng)基：液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，NaCl 10 g/L。固體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，NaCl 10 g/L，瓊脂15 g/L。滅菌前調(diào)pH到7.07.5左右，兩種培養(yǎng)基最后都要加氨芐青霉素至終濃度100 mg/mL。C. 實驗設(shè)備分光光度計，臺式離心機，離心機，離心管若干（50-100 mL/支），超凈工作臺，可以控溫的

16、搖床，無菌移液管，三角瓶（需要1 L、100 mL、500 mL各若干），1.5 mL小塑料管，無菌水 4、實驗步驟 種子培養(yǎng)實驗前一天用重組質(zhì)粒pHsh-xynB新鮮轉(zhuǎn)化大腸桿菌E. coli JM109獲得重組菌，晚上待菌落肉眼可見后，挑取單菌落接種于30ml 加有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基，在30下200rpm振蕩培養(yǎng)過夜。 發(fā)酵流程次日以1%2%接種量接入到新鮮的含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，于30下培養(yǎng)至細胞到達對數(shù)期早期（OD600值大概為0.70.8）時，將裝有重組菌的三角瓶移入42搖床中，以此時為0時刻計時，分別在0h、2h、4h、6h、8h、10h使用無菌操作取樣測OD600值，并

17、各保留1ml樣品離心收集細胞，用無菌水洗細胞一次，用1ml的無菌水重新懸浮后保存于-20用于次日酶活性測定。10h發(fā)酵結(jié)束后，將剩下的發(fā)酵液全部離心收集細胞，用無菌水洗滌一次，再次離心細胞后放置于-70用于重組酶的純化。實驗三、重組菌細胞破碎及酶活檢測1、實驗?zāi)康恼莆粘暡毎扑榉椒澳揪厶敲富钚詼y定方法2、實驗原理超聲波是指頻率超過人耳可聽范圍(1621kHz)的波，即頻率為20kHz以上的波。微生物細胞在超聲波的作用下，細胞結(jié)構(gòu)受到破壞，而使細胞破碎。超聲波進行細胞破碎的效果與微生物的種類、濃度、超聲波頻率、輸出功率和破碎時間有密切關(guān)系。使用超聲波必須注意的是控制強度在一定限度，即剛好低

18、于溶液產(chǎn)生泡沫的水平。木聚糖酶的活性通常是測定其水解底物木聚糖后生成的產(chǎn)物的還原末端木糖的增加量來進行的，而木糖的含量可以利用其與某些顯色試劑（如DNS試劑，PAHBAH）反應(yīng)后生成在特定波長下有特異吸收峰的有色化合物，從而通過分光光度法測出。3、實驗材料和設(shè)備A. 試劑測定酶活用試劑：在實驗一已配制0.5 %燕麥木聚糖：0.5木聚糖溶于100 mL無菌水中，在磁力攪拌器上攪拌使之呈均一的懸浮液，加終濃度0.02%的疊氮化鈉防止微生物生長。 8X Binding buffer：40 mmol/L 咪唑，4 mol/L NaCl, 160 mmol/L pH7.9 Tris-HCl ，最終pH調(diào)

19、到7.9B實驗設(shè)備分光光度計、水浴鍋、pH計、冰、燒杯、煮沸電爐、煮沸用的浮漂、移液管、磁力攪拌器、超聲破碎儀、高速離心機、離心管4、實驗步驟 取前日分別在0h、2h、4h、6h、8h、10h所取的1mL樣品及用適量1X Binding buffer懸浮的10h發(fā)酵結(jié)束后的細胞（由100 ml發(fā)酵液離心來的細胞用4 ml 1X Binding buffer重懸），室溫溶化后，用超聲波破碎儀破碎細胞。1mL樣品的超聲條件為：50 Hz超聲15s,間隔10 秒，如此多次即可。用1X Binding buffer懸浮的細胞次數(shù)應(yīng)該適當延長，當溶液變清即可停止。 破碎后的樣品在12000g，4離心20

20、min，棄沉淀。1mL的樣品用來檢測酶活性，用1X Binding buffer懸浮的細胞樣品次日用于酶的純化，此時放置于-70保存。 0h、1h、4h、6h、8h、9h、10h時的樣品中木聚糖酶活性的測定：記錄好各個取樣點時測得的數(shù)據(jù)，將其代入實驗一所得標準曲線方程中后算出每ml發(fā)酵液的酶活性。注意：每個時刻的樣品需做三次平行，所有平行樣品應(yīng)該一批次同時做完，以減小不同批次實驗引起的誤差；酶液可能要適當經(jīng)過稀釋，以使最后讀出的A405值在0.11之間，正式實驗前應(yīng)該做預(yù)實驗摸索好稀釋倍數(shù)。實驗四、重組木聚糖酶的純化1、 實驗?zāi)康恼莆誋is-tag親和層析柱純化蛋白的方法2、 實驗原理由xyn

21、B基因編碼的木聚糖酶有很高的熱穩(wěn)定性，在90下保溫2h，仍然有90%的活性，基于這一點，我們可以先用加熱的方法除去酶液中的大部分不耐熱的雜蛋白。蛋白質(zhì)表面的某些氨基酸殘基如：組氨酸的咪唑基團，半胱氨酸的巰基，色氨酸的吲哚基團（后兩種與金屬離子的作用要小得多），可與金屬離子親和結(jié)合。用螯合劑可以將金屬離子（Cu2+、Zn2+、Ni2+、Co2+）螯合到母體。洗脫時，可以通過改變鹽的濃度等降低金屬離子與蛋白質(zhì)的親和力將其洗脫。經(jīng)典的如組氨酸標簽-鎳離子親和柱子（His-tag）：組氨酸是具有雜環(huán)的氨基酸，每個組氨基酸含有一個咪唑基團，這個化學(xué)結(jié)構(gòu)帶有很多額外電子，對于帶正電的化學(xué)物質(zhì)有靜電引力，親

22、和層析是利用這個原理來進行吸附的，親和配體（也就是填料）上的陽離子（一般是鎳離子）帶正電對組氨酸有親和作用。洗脫的時候用高濃度的咪唑?qū)⒌鞍紫聪?。組氨酸標簽是原核表達載體上6個組氨酸的區(qū)段。在xynB基因編碼的C端，我們引物的編碼六個組氨酸的CAC 密碼子，使得重組酶帶上組氨酸標簽。3、實驗材料和設(shè)備A. 試劑Ni-NTA親和層析介質(zhì)5ml8X Binding buffer：40 mmol/L 咪唑，4 mol/L NaCl, 160 mmol/L pH 7.9 Tris-HCl ，最終pH調(diào)到7.94X Elute buffer：4 mol/L咪唑，2 mol/L NaCl, 80 mmol/

23、L pH 7.9 Tris-HCl ，最終pH調(diào)到7.98X Charge buffer：400 mmol/L NiSO48X Wash buffer：480 mmol/L咪唑，4 mol/L NaCl, 160 mmol/L pH 7.9 Tris-HCl ，最終pH調(diào)到7.94X Strip buffer：400 mmol/L EDTA，2 mol/L NaCl, 80 mmol/L pH 7.9 Tris-HCl ，最終pH調(diào)到7.9B.實驗設(shè)備移液管、試管、分光光度計、pH計、控溫水浴鍋、煮沸電爐、煮沸用的浮漂、鐵架臺4、實驗步驟 熱處理：將樣品裝入洗干凈的玻璃試管中，在70水浴鍋中保

24、溫30min，然后18000g離心4離心30min除去雜蛋白。his-tag親和柱處理取1mL Ni-NTA親和層析介質(zhì)填料裝柱（根據(jù)說明書上填料的吸附能力和樣品的多少使用適當體積的填料），接著用3倍柱體積的無菌水洗柱子，再用5柱體積的1X Charge buffer洗柱子，再用3柱體積的1X Binding buffer洗柱子。上樣樣品上樣前，取出少量樣品作為后面的SDS-PAGE實驗用。把樣品加入柱子，用10柱體積的1X Binding buffer洗柱子，接著用6柱體積的1X Wash buffer洗柱子，然后用6柱體積的1X Elute buffer洗脫柱子，此時注意用干凈的EP管分部

25、收集洗脫液。洗脫完后用1X Strip buffer洗柱子。 對上述收集的洗脫液測定木聚糖酶活，得到較高酶活的部分合并，并留出少量樣品作為后面的SDS-PAGE實驗用，余下樣品在-20保存?zhèn)溆?。實驗五、純化酶的電泳檢測及比酶活測定1、實驗?zāi)康膶W(xué)會采用SDS-PAGE(SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳)分析基因工程產(chǎn)物和蛋白質(zhì)的純度鑒定及測定酶的比酶活2、實驗原理SDS-PAGE電泳是主要用來測定蛋白質(zhì)分子量大小及純度分析的技術(shù)。如果在PAGE系統(tǒng)中加入十二烷基硫酸鈉(SDS)，則蛋白質(zhì)的遷移率主要取決于其分子量的大小，而與蛋白質(zhì)所帶的電荷和形狀無關(guān)。SDS是陰離子去污劑，它能與蛋白質(zhì)的疏水部分結(jié)合，

26、并能把大多數(shù)的蛋白質(zhì)分子拆分成亞基形式。由于大多數(shù)蛋白質(zhì)與SDS結(jié)合的摩爾比為1.4：1，結(jié)合量很大，因此，加人SDS增加了蛋白質(zhì)表面的負電荷，屏蔽了沒有SDS時正常存在的任何一種電荷。SDS與蛋白質(zhì)結(jié)合后，引起了蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化，使得雪茄形狀的蛋白質(zhì)分子的軸比發(fā)生改變。在巰基乙醇的作用下，二硫鍵還原為巰基，不同蛋白質(zhì)組成的短軸趨于一致，長軸與分子量成正比。因此，它們的電泳速度不取決于電荷和形狀，僅與蛋白質(zhì)的分子量有關(guān)。目前較流行的SDS-PAGE使用的都是線性垂直薄板狀膠，這種膠是指在兩層支持的玻璃板之間形成的薄片狀凝膠。由于薄片膠可在同一膠上跑很多樣品，使聚合、染色脫色具有一致性，所以薄片

27、膠比管狀膠的應(yīng)用更廣泛，本實驗是按照Bio-rad的小凝膠系統(tǒng)來設(shè)計的，這些步驟也適用于其他系統(tǒng)。經(jīng)過親和層析和加熱純化后，重組木聚糖酶應(yīng)該在SDS膠片上顯示出一個單一的條帶，分子量應(yīng)該與預(yù)期的一樣，為40 kDa左右。同一個酶在相同的測定條件下，如果比酶活越高，則表示該酶的純度越大，本實驗中的木聚糖酶經(jīng)過了親和層析和加熱兩步純化后，比酶活應(yīng)該逐漸升高，且經(jīng)過親和層析后和加熱后的比酶活相差不大。3、實驗材料和設(shè)備A. 試劑丙烯酰胺（電泳級）雙丙烯酰胺（N,N-甲叉雙丙烯酰胺）Tris堿SDS (十二烷基磺酸鈉，分析純)TEMED過硫酸銨甘氨酸B. 工作液：A液: 丙烯酰胺儲存液，100ml 3

28、0% (w/v) 丙烯酰胺，0.8% (w/v)雙丙烯酰胺注意：未聚合的丙烯酰胺是一種皮膚刺激物和神經(jīng)毒劑，操作時必須戴手套29.2 g丙烯酰胺0.8 g 雙丙烯酰胺加蒸餾水溶至100 ml，棕色瓶4保存B液：4分離膠緩沖液，100ml75ml 2 mol/l Tris-HCl(pH 8.8)4ml 10% SDS21ml 蒸餾水可在4存放數(shù)月C液：4堆積膠（濃縮膠）緩沖液，100 ml50ml 1mol/l Tris-HCl(pH 6.8)4ml 10% SDS46ml 蒸餾水可在4存放數(shù)月10%過硫酸銨，5ml0.5 g過硫酸銨5ml 蒸餾水可在密封的管內(nèi)，4存放數(shù)月電泳緩沖液：1L3g

29、Tris 堿14.4g 甘氨酸1g SDS加蒸餾水至1LpH 應(yīng)該在8.3左右，在室溫下長期保存5樣品緩沖液，10ml0.6 ml 1mol/l Tris-HCl(pH 6.8)5ml 50%甘油2ml 10% SDS0.5ml 2-巰基乙醇1ml 1% 溴酚藍0.9ml 的蒸餾水可在-20保存數(shù)月C. 實驗設(shè)備蛋白質(zhì)電泳裝置（垂直板蛋白電泳儀和電源）電源(電壓200V，電流500mA)100沸水浴移液槍搖床1.5 mL小所料管4、實驗步驟待檢測的蛋白質(zhì)分子量的大小決定了所使用的分離膠的濃度，下面為不同濃度的分離膠的分離范圍：丙烯酰胺在凝膠中的百分比 分離膠的范圍 15% 1545kDa 12

30、.5% 1560kDa 10% 1875kDa 7.5% 30120kDa 5% 60212kDa制膠所需時間：制分離膠 60min制堆積膠 30min上樣 15min電泳 45min染色（考馬斯亮藍染色） 1h完全脫色 812hX%分離膠的計算：A液 x/3mlB液 2.5ml蒸餾水 （7.5- x/3）ml10%過硫酸銨 50mlTEMED 5ml總量 10ml灌制分離膠A.將玻璃板洗干凈，烘干或者自然風(fēng)干，裝配好灌膠的模具，關(guān)鍵是確保凝膠玻璃板和墊片的表面緊密接觸，有細微的不匹配就會導(dǎo)致凝膠的滲漏。B.將A液、B液在一個小燒杯中混合，丙烯酰胺是神經(jīng)毒素，操作時必須戴手套。C.加入過硫酸銨和TE