桃紅四物湯乙醇提取液體外抗羥自由基作用的研究

1、桃紅四物湯乙醇提取液體外抗羥自由基作用的研究摘 要 目的：研究桃紅四物湯的乙醇提取液的抗羥自由基的活性。方法：采用分光光度法, 對(duì)桃紅四物湯醇提液體外抗羥自由基活性進(jìn)行測(cè)定。鄰二氮菲與Fe2+反應(yīng)形成紅色配合物, H2O2和Fe2+產(chǎn)生 OH，加入抗羥自由基的物質(zhì)后，減弱了 OH對(duì)Fe2+/鄰二氮菲的氧化作用，引起吸光度變化，本實(shí)驗(yàn)使用721型分光光度計(jì),在510 nm處測(cè)定其吸光度值,根據(jù)吸光度的變化值間接測(cè)定其抗羥自由基能力，并以沒(méi)食子酸作為陽(yáng)性對(duì)照。結(jié)果：桃紅四物湯乙醇提取液對(duì)羥自由基清除率達(dá)到50 %時(shí)所需藥物的終濃度（IC50）為14.90.4g /mL。結(jié)論：桃紅四物湯醇提液對(duì)羥自

2、由基具有清除作用,與對(duì)照組比較,作用弱于相同劑量的沒(méi)食子酸。關(guān)鍵詞：桃紅四物湯；分光光度法；抗羥自由基桃紅四物湯出自醫(yī)宗金鑒，由桃仁、紅花、當(dāng)歸、川芎、熟地、白芍組成。桃紅四物湯在預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化和改善心血管疾病方面具有一定作用1，可能與抗氧化作用有關(guān)，因此，研究桃紅四物湯的抗氧化活性具有一定意義。在眾多的自由基中，羥自由基是最活潑的，其反應(yīng)速度極快，它是對(duì)機(jī)體危害最大的自由基，超過(guò)了其它氧自由基2，所以本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行桃紅四物湯醇提液體外抗羥自由基的實(shí)驗(yàn)研究。清除羥基自由基的測(cè)定方法很多，目前多采用鄰二氮菲-金屬鐵離子-H2O2 體系 3-5。本文通過(guò)檢測(cè)桃紅四物湯醇提液體外抗羥自由基的活性，為桃

3、紅四物湯抗氧化產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)，研究提供相關(guān)依據(jù)，對(duì)進(jìn)一步地闡明該方的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)具有重要意義。材料與方法1 儀器和試劑1.1中藥材紅花、桃仁、當(dāng)歸、川芎、熟地、白芍，購(gòu)自張?jiān)兴庯嬈邢薰?.2主要試劑無(wú)水乙醇 天津市大茂化學(xué)試劑廠鄰二氮菲 批號(hào)2002年1月28日 天津市遠(yuǎn)航化學(xué)品有限公司經(jīng)銷硫酸亞鐵 批號(hào) 2003年3月9日 天津市博迪化工有限公司磷酸氫二鈉 批號(hào)200208-3 北京市紅圣化工廠磷酸二氫鉀 批號(hào)910821 天津市化工試劑六廠H2O2 天津市東方化工廠沒(méi)食子酸 批號(hào)：110831-200302 中國(guó)藥品生物制品鑒定所。 1.3主要儀器索氏提取器，電光分析天平TG-328A型

4、（上海天平儀器廠），微量分析天平TG-322A（上海天平儀器廠），電熱恒溫水槽DK-8B型（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司），微電腦智能化控制新型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱DHG-9070AS（寧波江南儀器廠），721型可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司）2 方法2.1 實(shí)驗(yàn)原理根據(jù)文獻(xiàn)6，鄰二氮菲與Fe2+反應(yīng)生成紅色配合物H2O2 + Fe2+HO+ HO- + Fe3+ 具有抗羥自由基能力的物質(zhì)能抑制上述反應(yīng)的發(fā)生，加入抗羥自由基的物質(zhì)后，減弱了 OH對(duì)Fe2+/鄰二氮菲的氧化作用，引起吸光度變化，本實(shí)驗(yàn)利用分光光度法測(cè)定其樣品吸光度值的改變值來(lái)間接測(cè)定桃紅四物湯的抗羥自由基能力。 2.2桃紅四

5、物湯乙醇提取液的制備精密稱取桃紅四物湯5 g，石油醚脫脂后，用75的乙醇回流提取2 h，濾液常壓濃縮定容至50.0 mL備用。2.3 試液的制備2.3.1沒(méi)食子酸溶液的制備精密稱取11.14 mg的沒(méi)食子酸，加水溶解，室溫冷卻，定容至100 mL容量瓶中，得濃度為0.1114 mgmL的儲(chǔ)備溶液。使用時(shí)將儲(chǔ)備液分別稀釋20倍、25倍、35倍、50倍、100倍。2.3.2 PBS的制備稱取14.3 g的Na2HPO412H2O，加水溶解，室溫冷卻，定容至200 mL容量瓶中，得濃度為0.2 mol/L的溶液；稱取2.7 g的KH2PO4，加水溶解，室溫冷卻，定容至100 mL容量瓶中，得濃度為0

6、.2 mol/L的溶液。配制時(shí)取81 mL的Na2HPO4溶液，19 mL的KH2PO4溶液，混合均勻，即得PH 7.4的PBS溶液。2.3.3 鄰二氮菲溶液的制備 精密稱取0.1489 g的鄰二氮菲，加水溶解，室溫冷卻，定容至200 mL容量瓶中，得濃度為3.8 10-3 mol/L的溶液。2.3.4 硫酸亞鐵溶液的制備精密稱取0.2084 g的FeSO47H2O，加稀鹽酸溶液溶解，室溫冷卻，加蒸餾水定容至100 mL容量瓶中，得濃度為7.5 10-3 mol/L的儲(chǔ)備液，實(shí)驗(yàn)時(shí)，將儲(chǔ)備液稀釋10倍使用。2.3.5 H2O2溶液的制備 精確量取30 %的H2O2溶液0.25 mL，室溫下定容

7、至25mL的容量瓶中，得0.3 %的H2O2儲(chǔ)備液，實(shí)驗(yàn)時(shí)，將儲(chǔ)備液稀釋為0.1 %的溶液使用。2.4 羥自由基清除率測(cè)定波長(zhǎng)的選擇根據(jù)實(shí)驗(yàn)原理，羥自由基清除率的測(cè)定實(shí)際上就是根據(jù)測(cè)定鄰二氮菲-Fe2+ 溶液的吸光度值來(lái)間接測(cè)定樣品的抗羥自由基能力。 在721型分光光度計(jì)上，用0.5 cm比色皿以蒸餾水為參比溶液，在480 nm-540 nm之間，測(cè)定鄰二氮菲-Fe2+ 溶液的吸光度值，以波長(zhǎng)為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制吸收曲線，測(cè)得最大吸收波長(zhǎng)為510 nm，結(jié)果見(jiàn)圖1。2.5 羥自由基清除率的測(cè)定參照實(shí)驗(yàn)7方法，取7 支試管,分別加入pH 7.4 的PBS 溶液1.0 mL ，3.8 1

8、0-3 mol/L 鄰二氮菲溶液0.5 mL, 充分混勻后,加入7.5 10-4 mol/LFeSO4 溶液0.5 mL ,每加1管立即混勻。然后向其中5支試管分別加入0.5mL濃度不同的桃紅四物湯醇提液,混勻,另兩支試管為損傷管和未損傷管,不加醇提液，但加入相同體積的75%的乙醇溶液（目的是扣除桃紅四物湯醇提液中乙醇溶劑的影響）。再分別加入0.1 %H2O2 0.5 mL ,未損傷管不加H2O2 ,以蒸餾水補(bǔ)充體積。在37 保溫1 h ,測(cè)定A510,重復(fù)五次?？疾觳煌瑵舛鹊奶崛∫簩?duì)OH 的清除率，乙醇提取液的終濃度分別為27.78 g/mL、13.89 g/mL、6.944 g/mL、3.

9、472 g/mL、1.736 g/mL。以沒(méi)食子酸為陽(yáng)性對(duì)照,進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。OH 的清除率（E%）= (A2 - A1) / (A0 - A1） 100 %其中:A0 未損傷管的吸光度值,A1 損傷管的吸光度值,A2 加樣品管的吸光度值。3 結(jié)果3.1鄰二氮菲-Fe2+溶液的吸收曲線在721型分光光度計(jì)上，用0.5 cm比色皿以蒸餾水為參比溶液，在480 nm-540 nm之間，測(cè)定鄰二氮菲-Fe2+ 溶液的吸光度值，以波長(zhǎng)為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制吸收曲線，最大吸收波長(zhǎng)為510 nm，結(jié)果見(jiàn)圖1。3.2 沒(méi)食子酸對(duì)羥自由基的清除作用按實(shí)驗(yàn)方法，分別測(cè)定各濃度的沒(méi)食子酸稀釋液的吸光度值，以濃度

10、為橫坐標(biāo)，清除率為縱坐標(biāo)作圖。求出回歸方程為：y=70.7x+3.52，r=0.9873，IC50值為0.6610.04 gmL，結(jié)果見(jiàn)表1和圖2。3.3 桃紅四物湯醇提液對(duì)羥自由基的清除作用按實(shí)驗(yàn)方法，分別測(cè)定三份各濃度的桃紅四物湯稀釋液的吸光度值，計(jì)算相應(yīng)的清除率。以濃度為橫坐標(biāo)，清除率為縱坐標(biāo)作圖，求出回歸方程為：y = 2.385x + 10.683， IC50值為14.90.4gmL。3.4桃紅四物湯乙醇提取液清除羥自由基的IC50值按實(shí)驗(yàn)方法，對(duì)三份桃紅四物湯的乙醇提取液清除羥基自由基的能力進(jìn)行了研究，結(jié)果見(jiàn)表2。3.5精密度實(shí)驗(yàn)按照實(shí)驗(yàn)方法，對(duì)樣品管、損傷管、未損傷管分別重復(fù)測(cè)定

11、5次，并計(jì)算各自的RSD值，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3，結(jié)果表明該實(shí)驗(yàn)精密度良好。3.6 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)精密稱取同一批藥材3份，制備乙醇提取液，測(cè)定其各自抗羥自由基的能力，并計(jì)算IC50和RSD值，RSD值為2.7%，結(jié)果表明重復(fù)性良好。4討論4.1羥自由基是目前所知活性氧中對(duì)生物體毒性最強(qiáng)、危害最大的一種自由基。它可以通過(guò)電子轉(zhuǎn)移、加成以及脫氫等方式與生物體內(nèi)的多種分子作用, 造成糖類、氨基酸、蛋白質(zhì)、核酸和脂類等物質(zhì)的氧化性損傷, 使細(xì)胞壞死或突變；羥自由基還與衰老、腫瘤、輻射損傷和細(xì)胞吞噬等有關(guān)。故羥自由基的清除, 對(duì)維持生物機(jī)體正常的生理活動(dòng)和抗衰老具有重要意義，羥自由基消除率是反映抗氧化作用的重要指

12、標(biāo)8。4.2沒(méi)食子酸抗氧化的能力很強(qiáng)，本文用桃紅四物湯乙醇提取液與沒(méi)食子酸溶液清除羥基自由基的能力進(jìn)行對(duì)比，為進(jìn)一步研究桃紅四物湯的抗氧化活性提供依據(jù)。4.3 桃紅四物湯乙醇提取液的IC50值為14.90.4 gmL（以生藥的質(zhì)量計(jì)算），沒(méi)食子酸的IC50值為0.6610.04 gmL，桃紅四物湯乙醇提取液的IC50值是沒(méi)食子酸IC50值的22.5倍，如果進(jìn)一步提純分離有望開(kāi)發(fā)為天然抗氧化產(chǎn)品。附 表表1 沒(méi)食子酸對(duì)羥自由基的清除作用（S, n=5）Table 1 The scavenging effect of gallic acid on hydroxyl radical（S, n=5）沒(méi)

13、食子酸濃度（gmL）吸光度（A510 nm）清除率（E%）0.92830.74270.53040.37130.18570.4200.0130.4090.0080.3590.0030.3330.0020.3100.00566.35.961.53.739.21.328.17.717.52.1表2桃紅四物湯醇提液清除羥自由基的IC50值（S, n=3）Table 2 IC50 of the hydroxyl radical scavengers of Taohongsiwu ethanol extract（S, n=3）序號(hào)123IC50(gmL)14.515.614.614.90.4表3 精密度實(shí)

14、驗(yàn)（n=5）Table 3 Precision experiments（n=5）吸光度（A1）吸光度（A2）吸光度（A3）吸光度（A4）吸光度（A5）SRSD%樣品管損傷管未損傷管0.3370.2640.4900.3420.2670.5000.3340.2600.4900.3370.2600.4970.3400.2630.4890.3380.0030.2630.0030.4930.0050.891.11.0表4 桃紅四物湯乙醇提取液與沒(méi)食子酸清除羥自由基的IC50值（S, n=3）Table 4 IC50 of the hydroxyl radical scavengers of Taohon

15、gsiwu ethanol extract and gallic acid scavenging（S, n=3）桃紅四物湯醇提液沒(méi)食子酸IC50（gmL）14.90.40.6610.04P0.01（與沒(méi)食子酸相比）附 圖圖1 鄰二氮菲-Fe2+體系的吸收光譜Fig 1 Absorption spectra of phenanthroline-Fe2+ 圖2 沒(méi)食子酸對(duì)羥自由基的清除作用Fig 2 The scavenging effect of gallic acid on hydroxyl radical圖3 桃紅四物湯醇提液對(duì)羥自由基的清除作用參考文獻(xiàn)1 周小青,羅堯岳,謝小兵,等.五首活血化瘀方對(duì)實(shí)驗(yàn)性動(dòng)脈粥樣硬化家兔血脂、載脂蛋白變化的影響J.中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志,2003,10(4):29-31.2 王海寬,趙新淮,姜巖. 甘草有效成分分離及其對(duì)自由基的清除能力 J.食品與機(jī)械,2000,(4),23-24.3 蔡仲軍,陳仕江,尹定華,等.不同產(chǎn)地冬蟲(chóng)夏草清除羥自由基作用的研究J.中草藥, 2004, 35 (1) : 57 - 59.4 張靜麗,王宏勛,張?chǎng)?等.靈芝、枸杞多糖復(fù)合抗氧化作用J.食品與機(jī)械, 2004, 20 (6) : 11 - 12.5 毛紹春,李竹英,李聰.白花丹提取物抗氧化活性研究 J .應(yīng)用科技, 2007, 34