局部刺激實(shí)驗(yàn)課件

1、局部刺激實(shí)驗(yàn),1,急性毒性試驗(yàn)綜合分析與評(píng)價(jià),第四實(shí)驗(yàn)室第三小組,人員名單：唐劍波 陳杰 楊文超 唐凱 張業(yè)芳 熊興菊,第三部分,局部刺激實(shí)驗(yàn),2,局部刺激實(shí)驗(yàn)?zāi)康?了解40.6%阿維菌素炔螨特微乳劑對(duì)哺乳動(dòng)物皮膚、眼睛的局部刺激性和腐蝕性，估計(jì)人體接觸該農(nóng)藥時(shí)可能出現(xiàn)的類(lèi)似危害，為農(nóng)藥生產(chǎn)和使用中的安全防護(hù)提供依據(jù),局部刺激實(shí)驗(yàn),3,局部刺激實(shí)驗(yàn),4,40.6%阿維菌素炔螨特微乳劑的眼刺激試驗(yàn),了解試驗(yàn)40.6%阿維菌素炔螨特微乳劑對(duì)眼睛的刺激作用和程度，為農(nóng)藥生產(chǎn)和使用中的安全防護(hù)提供依據(jù),一、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?二、 實(shí)驗(yàn)原理,選擇健康的成年白色家兔，受試物以一次劑量滴入每只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的眼睛結(jié)膜囊

2、內(nèi)，以未做處理的另一側(cè)眼睛作為自身對(duì)照。在規(guī)定的時(shí)間間隔內(nèi)，觀察對(duì)動(dòng)物眼睛的刺激和腐蝕作用程度并評(píng)分，以此評(píng)價(jià)受試物對(duì)眼睛的刺激作用。觀察期限應(yīng)能足以評(píng)價(jià)刺激效應(yīng)的可逆性或不可逆性,局部刺激實(shí)驗(yàn),5,三、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及飼養(yǎng)環(huán)境,首選健康成年白色家兔，至少4只，雌雄各半，體重2-3Kg，試驗(yàn)前家兔要在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房至少適應(yīng)3d時(shí)間，在開(kāi)始前的24h內(nèi)對(duì)動(dòng)物的兩只眼睛進(jìn)行檢查，有眼睛刺激癥狀，角膜缺陷和結(jié)膜損傷的動(dòng)物不能用于實(shí)驗(yàn)。 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房應(yīng)符合國(guó)家相關(guān)規(guī)定。選用常規(guī)飼料，飲水不限制,四、實(shí)驗(yàn)步驟,1、輕輕拉開(kāi)家兔一側(cè)眼睛的下眼瞼，將受試物0.1ml滴入結(jié)膜囊中，使上、下眼瞼被動(dòng)閉合1min，

3、以防止受試物丟失。另一側(cè)眼睛不處理作自身對(duì)照。滴入受試物后24h不沖洗眼睛,40.6%阿維菌素炔螨特微乳劑的眼刺激試驗(yàn),局部刺激實(shí)驗(yàn),6,40.6%阿維菌素炔螨特微乳劑的眼刺激試驗(yàn),2、記錄給藥后1、24、48、72小時(shí)角膜、虹膜、結(jié)膜以及其它所觀察到的損傷情況，以Draize眼部刺激試驗(yàn)評(píng)分表示。觀察時(shí)應(yīng)用熒光素鈉檢查角膜損害，用裂隙燈檢查角膜透明度和虹膜紋理改變。若在72小時(shí)內(nèi)未見(jiàn)任何刺激癥狀，該試驗(yàn)即可結(jié)束,3、若在72小時(shí)內(nèi)出現(xiàn)刺激癥狀，應(yīng)進(jìn)行眼部清洗試驗(yàn)：試驗(yàn)設(shè)3組，每組3只動(dòng)物，受試藥物的給藥方法同上。第1組不予清洗，第2組在眼部給受試藥4秒鐘后用20ml溫水或生理鹽水清洗受試眼，

4、第3組在給受試藥30秒鐘后用20ml溫水或生理鹽水清洗受試眼。觀察滴眼后24、48、72小時(shí)，4天，7天的眼部反應(yīng)情況，直至眼部恢復(fù)正常。（該試驗(yàn)的意義在于評(píng)價(jià)溫水或生理鹽水清洗可否改善藥物所致的眼部刺激，亦即反映該受試藥物的眼部刺激性是否可逆。,局部刺激實(shí)驗(yàn),7,40.6%阿維菌素炔螨特微乳劑的眼刺激試驗(yàn),五、結(jié)果判斷及評(píng)價(jià),按表1將每只動(dòng)物的角膜、虹膜和結(jié)膜的刺激反應(yīng)的分值相加，即是一只動(dòng)物眼刺激反應(yīng)的總積分。每個(gè)動(dòng)物的刺激反應(yīng)積分的總和除以動(dòng)物數(shù)，就是該試驗(yàn)農(nóng)藥對(duì)眼刺激性的最后分值。再按表2評(píng)定眼刺激程度。 按上述分級(jí)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)評(píng)定，如一次或多次接觸受試物，不引起角膜、虹膜和結(jié)膜的炎癥變化

5、，或雖引起輕度反應(yīng)，但這種改變是可逆的，則認(rèn)為該受試物可以安全使用。 在許多情況下，哺乳動(dòng)物眼的反應(yīng)較人敏感，從動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果外推到人可提供較有價(jià)值的依據(jù),局部刺激實(shí)驗(yàn),8,表1 Draize眼刺激試驗(yàn)中眼損傷嚴(yán)重程度的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn),局部刺激實(shí)驗(yàn),9,續(xù)表 Draize眼刺激試驗(yàn)中眼損傷嚴(yán)重程度的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn),局部刺激實(shí)驗(yàn),10,表2 眼刺激強(qiáng)度評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn),局部刺激實(shí)驗(yàn),11,40.6%阿維菌素炔螨特微乳劑的皮膚刺激試驗(yàn),一、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?測(cè)定40.6%阿維菌素炔螨特微乳劑對(duì)哺乳動(dòng)物皮膚是否有刺激或腐蝕作用，估計(jì)人體接觸該農(nóng)藥時(shí)可能出現(xiàn)的類(lèi)似危害,二、 實(shí)驗(yàn)原理,將受試樣品一次（或多次）涂（敷）于健康無(wú)破損

6、的一側(cè)皮膚，并以對(duì)側(cè)皮膚作自身對(duì)照，在規(guī)定時(shí)限內(nèi)觀察和評(píng)價(jià)刺激反應(yīng)的程度，并作詳細(xì)的記錄。觀察時(shí)間應(yīng)足以進(jìn)行可逆或不可逆效應(yīng)的觀察，以便進(jìn)行完整的評(píng)價(jià)，但一般不超過(guò)14d,局部刺激實(shí)驗(yàn),12,40.6%阿維菌素炔螨特微乳劑的皮膚刺激試驗(yàn),三、 實(shí)驗(yàn)材料,1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 首選健康成年白色家兔，至少4只，體重2kg左右，雌雄兼可，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物應(yīng)單籠飼養(yǎng)，試驗(yàn)前家兔要在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房至少適應(yīng)3d時(shí)間。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房應(yīng)符合國(guó)家相關(guān)規(guī)定。選用常規(guī)飼料，飲水不限制。 2、受試物 40.6%阿維菌素炔螨特微乳劑,四、 實(shí)驗(yàn)步驟,1、試驗(yàn)前24小時(shí)將動(dòng)物背部脊柱兩側(cè)毛脫掉，不可損傷毛皮，脫毛面積左右各4cmX4c

7、m,局部刺激實(shí)驗(yàn),13,40.6%阿維菌素炔螨特微乳劑的皮膚刺激試驗(yàn),2、取受試樣品0.5ml直接涂布在皮膚上，用4層紗布（3cmX3cm）和一層玻璃紙或類(lèi)似物覆蓋，再用無(wú)刺激膠布和繃帶加以固定。對(duì)側(cè)皮膚作為對(duì)照。采用封閉實(shí)驗(yàn)，敷用時(shí)間為4h。試驗(yàn)結(jié)束后，用溫水或無(wú)刺激性溶劑清除殘留受試樣品。 3、如懷疑受試樣品可能引起嚴(yán)重刺激或腐蝕作用，可采用分段實(shí)驗(yàn)，將三個(gè)涂布受試樣品的紗布快同時(shí)或先后敷貼于一只家兔背部脫毛區(qū)皮膚上，分別于涂敷后3min，60min和4h取下一塊紗布，皮膚部位在任一時(shí)間點(diǎn)積分等于8分，即可停止試驗(yàn)。 4、觀察時(shí)間的確定應(yīng)足以觀察到可逆和不可逆刺激作用的全過(guò)程，一般不超過(guò)1

8、4d,局部刺激實(shí)驗(yàn),14,于清除受試樣品后的1h、24h、48h和72h各觀察受試部位的皮膚反應(yīng)，按表3進(jìn)行皮膚反應(yīng)評(píng)分，以受試物積分的平均值進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，根據(jù)24h、48h和72h各觀察時(shí)點(diǎn)最高積分均值，按表4判定皮膚刺激強(qiáng)度。 皮膚刺激評(píng)價(jià)除根據(jù)表4的評(píng)分外，還應(yīng)結(jié)合刺激作用的性質(zhì)、恢復(fù)程度等進(jìn)行化學(xué)品刺激作用的綜合評(píng)價(jià)。單獨(dú)的積分值不能作為受試樣品的刺激性質(zhì)的最后評(píng)判，可以作為參考值。 急性皮膚刺激試驗(yàn)結(jié)果從動(dòng)物外推到人的可靠性很有限。白色家兔在大多數(shù)情況下對(duì)有刺激性或腐蝕性的物質(zhì)較人類(lèi)敏感。若用其他品系動(dòng)物進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)也得到類(lèi)似結(jié)果，則會(huì)增加從動(dòng)物外推到人的可靠性,40.6%阿維菌素炔螨

9、特微乳劑的皮膚刺激試驗(yàn),五、 結(jié)果判斷及評(píng)價(jià),局部刺激實(shí)驗(yàn),15,表3 皮膚刺激反應(yīng)評(píng)分,局部刺激實(shí)驗(yàn),16,表4 皮膚刺激強(qiáng)度評(píng)價(jià),局部刺激實(shí)驗(yàn),17,40.6%阿維菌素炔螨特微乳劑的皮膚致敏試驗(yàn),一、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?測(cè)試動(dòng)物在反復(fù)接觸40.6%阿維菌素炔螨特微乳劑后，機(jī)體產(chǎn)生免疫傳遞的皮膚反應(yīng)的可能性，從而確定該農(nóng)藥的變態(tài)反應(yīng)性（致敏,二、 實(shí)驗(yàn)原理,具有致敏作用的化學(xué)物經(jīng)一定途徑進(jìn)入機(jī)體，與組織蛋白結(jié)合形成完全抗原，刺激免疫活性細(xì)胞產(chǎn)生致敏淋巴細(xì)胞或體液抗體；經(jīng)1-2周致敏期，使體內(nèi)免疫反應(yīng)得到充分發(fā)展，形成一定數(shù)量的致敏淋巴細(xì)胞或特異抗體。當(dāng)再次接觸（激發(fā)）時(shí)使機(jī)體對(duì)該化合物產(chǎn)生感受性增高

10、的狀態(tài)，以一定的異常形式表現(xiàn)出來(lái),局部刺激實(shí)驗(yàn),18,三、 實(shí)驗(yàn)材料,1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 成年白色豚鼠，體重200-300g，雌雄均可，雌性動(dòng)物不能發(fā)生過(guò)性行為。在同一次試驗(yàn)中，應(yīng)使用同一性別動(dòng)物。如果使用兩種性別動(dòng)物，則應(yīng)雌、雄各半。試驗(yàn)前動(dòng)物應(yīng)在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室至少喂養(yǎng)3d，以適應(yīng)環(huán)境和淘汰不合格動(dòng)物。 2、受試物 40.6%阿維菌素炔螨特微乳劑。 3、 陽(yáng)性致敏物 2,4一二硝基氯代苯制成1的致敏濃度和0.1的激發(fā)濃度。 4、賦形劑 水或無(wú)刺激性表面活性劑,40.6%阿維菌素炔螨特微乳劑的皮膚致敏試驗(yàn),局部刺激實(shí)驗(yàn),19,四、 實(shí)驗(yàn)步驟,1、用23只動(dòng)物進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)，尋找能引起皮膚輕度刺激反應(yīng)的最高濃

11、度（劑量）。激發(fā)濃度一般低于致敏濃度，不得引起原發(fā)刺激性炎癥反應(yīng)。 2、實(shí)驗(yàn)分組：將豚鼠按體重性別隨機(jī)分成三組，第一組20只（雌雄各半），二、三組各10只（雌雄各半）。第一組給農(nóng)藥，第二組空白對(duì)照（給賦形劑），第三組陽(yáng)性對(duì)照（給陽(yáng)性致敏物）。 3、致敏接觸：實(shí)驗(yàn)前24h將動(dòng)物背部左側(cè)去毛3cm3cm。試驗(yàn)組：將試驗(yàn)農(nóng)藥0.10.2ml涂在2cm2cm濾紙上，并將其敷貼在去毛區(qū)，以1層油紙或玻璃紙和2層大于備皮面積的紗布覆蓋，再以無(wú)刺激膠布封閉固定，持續(xù)6h。用清水或無(wú)刺激性溶劑洗去殘留的受試物。第7d和第14d以同樣方法重復(fù)一次?？瞻讓?duì)照組與陽(yáng)性對(duì)照組方法同上,40.6%阿維菌素炔螨特微乳劑的

12、皮膚致敏試驗(yàn),局部刺激實(shí)驗(yàn),20,4、激發(fā)接觸：實(shí)驗(yàn)前24h將動(dòng)物背部右側(cè)去毛3cm3cm。試驗(yàn)組和對(duì)照組：末次致敏后第14天，將0.10.2mL或低于誘導(dǎo)濃度的試驗(yàn)農(nóng)藥斑貼于右側(cè)去毛區(qū)，覆蓋方法同2的步驟，持續(xù)6h，去掉去掉斑貼及試驗(yàn)農(nóng)藥后，每日觀察皮膚過(guò)敏反應(yīng)情況至第12d，主要觀察有無(wú)紅斑、水腫。如無(wú)致變，可再次激發(fā)以確定試驗(yàn)農(nóng)藥能否引起過(guò)敏反應(yīng)。 陽(yáng)性對(duì)照組給陽(yáng)性致敏物，方法同上,40.6%阿維菌素炔螨特微乳劑的皮膚致敏試驗(yàn),局部刺激實(shí)驗(yàn),21,五、結(jié)果判斷及評(píng)價(jià),40.6%阿維菌素炔螨特微乳劑的皮膚致敏試驗(yàn),在24h、48h后分別觀察局部皮膚反應(yīng)。用盲法觀察對(duì)照組和試驗(yàn)組。按表5對(duì)局部皮膚反應(yīng)評(píng)分。當(dāng)受試樣品組出現(xiàn)皮膚反應(yīng)積分不小于2時(shí)，判為該動(dòng)物出現(xiàn)皮膚致敏反應(yīng)陽(yáng)性，并計(jì)算致敏率，按表6判定受試樣品的致敏強(qiáng)度,局部刺激實(shí)驗(yàn),22,表5 皮膚致敏反應(yīng)試驗(yàn)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn),局部刺激實(shí)驗(yàn),23,表6 致敏率強(qiáng)度分級(jí)表,局部刺激實(shí)驗(yàn),24,若實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下： 皮膚刺激平均分值