L-精氨酸預(yù)處理對(duì)肝硬化大鼠肝臟缺血再灌注損傷保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究的論文

1、L-精氨酸預(yù)處理對(duì)肝硬化大鼠肝臟缺血再灌注損傷保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究的論文【摘要】 目的 探討l-精氨酸(l-arginine，l-arg)預(yù)處理對(duì)硬化肝臟缺血再灌注(ischemia-reperfusion，i/r)損傷的保護(hù)作用及機(jī)制。方法 采用硫代乙酰胺(thioacetamide，taa)復(fù)制大鼠肝硬化模型，然后阻斷第5葉入肝血流30 min，再灌注60 min，建立部分肝缺血再灌注模型。24只肝硬化大鼠隨機(jī)分成4組(n=6)：?譹?訛肝硬化大鼠對(duì)照組(對(duì)照組)，僅分離肝周?chē)g帶，不進(jìn)行肝門(mén)阻斷及再灌注;?譺?訛肝硬化缺血再灌注組(缺血再灌注組);?譻?訛l-精氨酸預(yù)處理組(精氨酸組);?

2、譼?訛l-硝基精氨酸甲酯(l-nitro-arginine-methy l-ester，l-name)預(yù)處理組(硝基精氨酸甲酯組)。后三組分別于缺血前15 min經(jīng)門(mén)靜脈給予生理鹽水、l-arg和l-name處理，測(cè)定再灌注后肝內(nèi)門(mén)-體分流、血清門(mén)冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase，ast)、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase，alt)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，ldh)和肝組織超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，sod)、丙二醛(malondialdehyde，mda)、一氧化氮(

3、nitric oxide，no)、三磷酸腺苷酶(adenosine triphosphatase，atpase)等的變化。采用門(mén)靜脈連續(xù)輸注山梨醇法，測(cè)定肝臟山梨醇攝取率，計(jì)算肝內(nèi)門(mén)-體分流。wWw.11665.CoM結(jié)果 缺血再灌注組與對(duì)照組比較：功能性肝血流量(functional hepatic blood flow，fhbf)、sod顯著降低(p<0.01)，肝內(nèi)分流率、肝內(nèi)分流量(intrahepatic shunt flow，ihsf)、mda、alt、ast、ldh顯著升高(p<0.01或p<0.05);精氨酸組與缺血再灌注組比較：no、fhbf、sod、na+

4、/k+-atpase、ca2+-atpase、mg2+-atpase顯著升高(p<0.01或p<0.05)，肝內(nèi)分流率、ihsf、mda、alt、ast、ldh顯著下降(p<0.01或p<0.05);硝基精氨酸甲酯組與缺血再灌注組比較：no、fhbf顯著下降(p<0.01)，ihsf、mda顯著升高(p<0.01)。結(jié)論 l-arg對(duì)硬化肝臟缺血再灌注損傷有保護(hù)作用，其保護(hù)機(jī)制是通過(guò)增加肝臟內(nèi)源性no，從而減少肝內(nèi)門(mén)-體分流，增加功能性肝血流以及改善細(xì)胞能量代謝而實(shí)現(xiàn)的?！娟P(guān)鍵詞】 肝臟;肝硬化;缺血再灌注損傷;肝內(nèi)門(mén)-體分流;一氧化氮;山梨醇;l-精氨酸;

5、大鼠protective mechanism of l-arginine against liver ischemic-reperfusion injury in the rat model of liver cirrhosiszhang zhiqiang， cai bing， wu mingyu. department of hepatobiliary surgery， the peoples hospital of wuxi city， wuxi 214023abstract objective to explore and investigate protective mechanism

6、 of l-arginine against liver isohemic-reperfusion (i/r) injury in a rat model of liver cirrhosis. methods cirrhotic rats were induced by oral administration of thioacetamide (taa). the rats underwent partial hepatic ischemia-reperfusion. twenty-four cirrhotic rats were randomly divided into 4 groups

7、 (n=6). the control group was also served as the sham-operated control. other three groups were subjected to 30 min lobar ischemia and 60 min reperfusion. of them， groups i/r， l-arginine (l-arg) and l-name were preconditioned with normal saline， l-arg and l-nitro-arginine-methy l-ester (l-name) resp

8、ectively. all drugs were injected through catheters in the distal ileocolic veins. intraportal infusion of sorbitol (10 mmol/l， 0.2 ml/min) commenced after 60 min reperfusion， at the same time， blood sample was drawn from the jugular vein catheter for biochemistry test， such as alanine aminotransfer

9、ase (alt)， aspartate aminotransferase (ast) and lactate dehydrogenase (ldh). two minutes after initiation of sorbitol infusion， blood samples were drawn simultaneously from the carotid artery， portal venous and hepatic venous catheters for sorbitol concentration assay. portal venous flow (pvf) and h

10、epatic arterial flow (haf) were measured via electromagnetic flow probes. hepatic sorbitol uptake and intrahepatic shunt flow (ihsf) were calculated by pvf， haf and sorbitol concentrations in the portal vein， hepatic vein and carotid artery. on the termination of experiments， lesion liver lobes exci

11、sed for histochemical assay， such as superox肝臟手術(shù)中出血以及肝血流阻斷都會(huì)造成肝臟缺血再灌注損傷，而大部分需要外科手術(shù)的病肝存在不同程度的肝硬化，肝硬化肝臟對(duì)缺血更敏感，也更易發(fā)生再灌注損傷。缺血再灌注損傷已經(jīng)成為硬化肝臟手術(shù)后的主要死因。硬化肝臟缺血再灌注損傷機(jī)制還不是很清楚，目前尚缺乏有效防治硬化肝臟缺血再灌注損傷的方法。近年研究表明1-2，正常肝臟及硬化肝臟均存在肝內(nèi)門(mén)-體分流(intrahepatic portal systemic shunting，ipss)。另有研究表明3-4，在硬化肝臟及其缺血再灌注損傷中，血管活性物質(zhì)一氧化氮(ni

12、tric oxide，no)及一氧化氮合酶明顯紊亂，no有可能參與了ipss的調(diào)控。我們以肝硬化大鼠肝臟缺血再灌注為模型，以l-精氨酸(l-arginine，l-arg)提供氮源，研究no能否通過(guò)調(diào)節(jié)ipss，增加功能性肝血流量(functional hepatic blood flow，fhbf)，改善細(xì)胞能量代謝，從而保護(hù)肝臟，探討預(yù)處理對(duì)硬化肝臟的保護(hù)機(jī)制。1 材料和方法1.1 肝硬化動(dòng)物模型的建立 雄性sd大鼠(徐州醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供)，體質(zhì)量250300 g。在飲用水中加入硫代乙酰胺(thioacetamide，taa)，初始濃度為0.03%，自由飲水，顆粒飼料喂養(yǎng)每周根據(jù)體質(zhì)量調(diào)整

13、飲用水中taa濃度，每周體質(zhì)量變化控制在15 g以?xún)?nèi)，共飼養(yǎng)12周，總體質(zhì)量變化控制在60 g以?xún)?nèi)5。1.2 實(shí)驗(yàn)分組 24只肝硬化大鼠隨機(jī)分成4組(n=6)：?譹?訛肝硬化大鼠對(duì)照組(對(duì)照組);?譺?訛肝硬化缺血再灌注組(缺血再灌注組);?譻?訛l-精氨酸預(yù)處理組(精氨酸組);?譼?訛l-硝基精氨酸甲酯預(yù)處理組(硝基精氨酸甲酯組)。肝臟缺血再灌注損傷模型及手術(shù)操作：參考李向農(nóng)等1及molino等6山梨醇攝取率實(shí)驗(yàn)。2%戊巴比妥腹腔麻醉(0.15 ml/100 g體質(zhì)量)，麻醉成功后，尾靜脈緩慢注射肝素(30 u/100 g體質(zhì)量)以達(dá)到肝素化。分別作左頸動(dòng)脈插管用于頸動(dòng)脈血樣的采集，右頸靜脈

14、插管用于輸液、輸血及采血。選2根回結(jié)腸靜脈插管，其中一根插入門(mén)靜脈主干，用于門(mén)靜脈血樣采集和注射藥物;另一根插入回結(jié)腸靜脈內(nèi)2 cm，連接微量注射泵，用于輸注山梨醇。分離門(mén)靜脈和肝動(dòng)脈，置入口徑合適的電磁血液流量計(jì)探頭，測(cè)定血流量。22g套管針穿刺肝葉，潛行至肝靜脈處，用于留取肝靜脈血樣。動(dòng)脈夾完全阻斷第5葉肝蒂30 min后再予開(kāi)放60 min，即建立了部分肝缺血再灌注損傷模型。對(duì)照組僅分離肝周?chē)g帶，不進(jìn)行肝門(mén)阻斷及再灌注;其余三組阻斷第5葉入肝血流30 min，再灌注60 min。其中，對(duì)照組于分離韌帶后、缺血再灌注組于缺血前15 min經(jīng)門(mén)靜脈輸注生理鹽水(2.5 ml/kg體質(zhì)量);

15、精氨酸組和硝基精氨酸甲酯組于缺血前15 min分別經(jīng)門(mén)靜脈輸注l-arg(300 mg/kg體質(zhì)量7)和l-name(10 mg/kg體質(zhì)量)。再灌注60 min時(shí)(對(duì)照組于分離韌帶后105 min后)，測(cè)定各組門(mén)靜脈血流量(portal venous flow，pvf)及肝動(dòng)脈血流量(hepatic arterial flow，haf)，經(jīng)頸靜脈導(dǎo)管取靜脈血0.8 ml，待測(cè)血ast、alt、ldh。然后經(jīng)門(mén)靜脈輸注d-山梨醇(10 mmol/l，0.2 ml/min)，2 min后同時(shí)經(jīng)頸動(dòng)脈、門(mén)靜脈、肝靜脈導(dǎo)管各取血1.0 ml。取血應(yīng)緩慢、勻速，時(shí)間均控制在10 min，以保證生命體征

16、平穩(wěn)。為補(bǔ)償充血容量損失，術(shù)中適當(dāng)補(bǔ)充生理鹽水約3 ml，取血期間經(jīng)頸靜脈輸注預(yù)先準(zhǔn)備的肝素化新鮮鼠血(0.1 ml/min)。血樣注入離心管中，待測(cè)山梨醇濃度。取血結(jié)束后立即處死大鼠，迅速切下第5肝葉檢測(cè)超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，sod)、丙二醛(malondialdehyde，mda)、no、一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，nos)、鈉/鉀-三磷酸腺苷酶(na+/k+-adenosine triphosphatase，na+/k+-atpase)、ca2+-atpase、mg2+-atpase。1.3 肝內(nèi)門(mén)-體分流的測(cè)定 根據(jù)山梨

17、醇代謝特點(diǎn)，肝臟山梨醇攝取率可代表fhbf占總肝血流量(total hepatic blood flow，thbf)的比例。采用門(mén)靜脈連續(xù)輸注山梨醇的方法，測(cè)定肝臟山梨醇攝取率。血山梨醇濃度用酶分光光度法測(cè)定2-3。由于頸動(dòng)脈和肝動(dòng)脈血中的山梨醇濃度相等，所以肝臟山梨醇攝取率用以下公式計(jì)算：肝臟山梨醇攝取率(%)=100%其中，spv、sca、shv分別表示門(mén)靜脈、頸動(dòng)脈、肝靜脈的山梨醇濃度。fhbf和肝內(nèi)分流量(intrahepatic shunt flow， ihsf)分別用下列公式計(jì)算：fhbf=thbf肝臟山梨醇攝取率;ihsf=thbf-fhbf。1.4 血生化及肝組織生化定量分析

18、血清alt、ast、lah由au1000全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)。肝臟組織sod、mda、no、nos、atpase由南京建成生物工程研究所提供的試劑盒檢測(cè)。1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 以均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差表示，用sigmastat統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。對(duì)照組與缺血再灌注組比較采用t檢驗(yàn)，缺血再灌注組、精氨酸組、硝基精氨酸甲酯組之間比較采用單因素方差分析(anova)q檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)=0.05。2 結(jié)果2.1 山梨醇攝取率 對(duì)照組山梨醇攝取率為(72.0%0.9%)，缺血再灌注組山梨醇攝取率較對(duì)照組顯著降低(p<0.01)，精氨酸組山梨醇攝取率較缺血再灌注組有明顯恢復(fù)(p<0.01)(見(jiàn)表1)。2

19、.2 肝臟血流動(dòng)力學(xué) 缺血再灌注組pvf及thbf較對(duì)照組顯著降低(p<0.05);精氨酸組pvf及thbf較缺血再灌注組顯著升高(p<0.05);硝基精氨酸甲酯組pvf及thbf較缺血再灌注組顯著降低(p<0.05);肝內(nèi)分流率在對(duì)照組為(28.0%0.9%)，缺血再灌注組顯著升至(66.5%6.3%)(p<0.01)，精氨酸組較缺血再灌注組顯著降低(p<0.01)，硝基精氨酸甲酯組則顯著升高至(72.6%5.8%)(p<0.01);缺血再灌注組較對(duì)照組的ihsf明顯增加而fhbf明顯下降(p<0.01)，硝基精氨酸甲酯組fhbf進(jìn)一步降低， 精氨酸

20、組與缺血再灌注組比較，ihsf降低(p<0.05)，而fhbf顯著升高(p<0.01)(見(jiàn)表2)。2.3 血生化指標(biāo) 缺血再灌注組alt、ast、ldh顯著高于對(duì)照組(p<0.01);精氨酸組alt、ast、ldh則顯著低于缺血再灌注組(p<0.01);硝基精氨酸甲酯組alt、ast、ldh分別與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)(見(jiàn)表3)。2.4 肝組織生化指標(biāo) 缺血再灌注組sod顯著低于對(duì)照組(p<0.01)，而mda顯著高于對(duì)照組(p<0.05);精氨酸組 sod顯著高于缺血再灌注組(p<0.01)，而mda顯著低于缺血再灌注組(p

21、<0.01)，硝基精氨酸甲酯組mda卻顯著高于缺血再灌注組(p<0.01)(見(jiàn)表4)。缺血再灌注組與對(duì)照組比較no以及nos均沒(méi)有顯著變化(p>0.05);精氨酸組no、總一氧化氮合酶(t-nos)、內(nèi)皮型一氧化氮合酶(enos)均顯著高于缺血再灌注組(p<0.01或(p<0.05)，硝基精氨酸甲酯組no顯著低于缺血再灌注組(p<0.01)(見(jiàn)表5)。精氨酸組na+/k+-atpase、mg2+-atpase、ca2+-atpase均顯著高于缺血再灌注組(p<0.01或p<0.05)(見(jiàn)表6)。3 討論本研究表明：l-arg預(yù)處理對(duì)硬化肝臟i/r

22、損傷有明顯的拮抗作用，表現(xiàn)在肝酶alt、ast、ldh以及肝組織內(nèi)氧自由基介導(dǎo)的脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物mda明顯低于缺血再灌注組，而反映細(xì)胞能量代謝的na+/k+-atpase、mg2+-atpase、ca2+-atpase以及細(xì)胞內(nèi)氧自由基清除劑sod明顯升高，當(dāng)用nos抑制劑l-name抑制no合成后，alt、ast、ldh、mda顯著升高，提示肝臟損害加重，說(shuō)明no在l-arg對(duì)硬化肝臟i/r損傷的保護(hù)中起了重要作用。no是由nos催化底物l-arg生成。nos包括三種同工酶，即神經(jīng)型(nnos)、內(nèi)皮型(enos)和誘生型(inos)。肝內(nèi)只有后兩者，其中enos是血管內(nèi)皮固有的，inos是由

23、以?xún)?nèi)毒素為代表的細(xì)胞因子誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、肝細(xì)胞等產(chǎn)生的8-9。雖然理論上肝硬化大鼠門(mén)靜脈中內(nèi)毒素水平較高并可在 i/r時(shí)進(jìn)一步升高，刺激肝臟nos表達(dá)加強(qiáng)和no的合成增加，但我們的研究顯示，硬化肝臟i/r后，肝臟組織no含量減少，但是差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)。這可能是由于內(nèi)毒素等刺激所造成的nos表達(dá)加強(qiáng)及no合成增加與內(nèi)皮細(xì)胞受損所造成的nos活性降低及no減少相抵消，故i/r后肝組織no含量變化不大。精氨酸組t-nos較缺血再灌注組顯著升高(p<0.05)，主要體現(xiàn)在enos升高(p<0.01)，說(shuō)明l-arg能夠誘導(dǎo)肝內(nèi)enos表達(dá)，并利用底物l-arg

24、合成更多的no。我們的研究顯示，no和ipss具有密切的關(guān)系。李向農(nóng)等的研究證實(shí)1，正常肝臟存在ipss。這些分流管道直徑大多小于15 ?滋m，于竇前區(qū)起自門(mén)靜脈末梢分支，繞過(guò)肝竇直接注入肝靜脈。生理情況下這些分流處于關(guān)閉狀態(tài)，當(dāng)肝竇阻力升高時(shí)，ihsf可高達(dá)門(mén)靜脈血流量的70%。血管鑄型研究已經(jīng)證實(shí)2，肝硬化肝臟存在大量門(mén)靜脈-肝靜脈吻合。我們通過(guò)測(cè)定山梨醇肝清除率發(fā)現(xiàn)，肝硬化大鼠存在大量的ipss，肝內(nèi)分流率達(dá)(28.0%0.9%)。當(dāng)硬化肝臟再灌注時(shí)，缺血再灌注組肝內(nèi)分流率顯著增加至(66.5%6.3%)(p<0.01)，fhbf也由對(duì)照組(6.10.7)ml/min/100 g

25、body weight顯著下降到缺血再灌注組的(2.40.4)ml/min/100 g body weight(p<0.01)，肝臟的有效灌注減少，進(jìn)一步加重肝臟的損傷，從而參與了硬化肝臟的i/r損傷。肝臟損傷加重主要體現(xiàn)在血清ast、alt、ldh升高，肝臟mda增加，sod、atpase下降。缺血前給予no底物l-arg，再灌注后測(cè)定肝組織no含量為(0.860.11)?滋mol/gprot，顯著高于缺血再灌注組(0.660.07)?滋mol/gprot(p<0.01);精氨酸組thbf較缺血再灌注組也顯著增加，更為重要的是肝內(nèi)血流分配發(fā)生了變化，即ihsf減少(p<0.

26、05)，fhbf增加(p<0.01)。從精氨酸組與缺血再灌注組的比較中我們可以看出：thbf的增加主要是由于pvf增加所造成的，而haf無(wú)明顯變化。缺血前給予非選擇性nos抑制劑l-name，no較缺血再灌注組顯著降低(p<0.01);隨著no的減少， fhbf較缺血再灌注組也顯著降低(p<0.05)，肝臟損傷加重，表現(xiàn)在較缺血再灌注組血清alt、ast和ldh升高(p<0.01)，肝組織mda增加(p<0.01)。l-arg預(yù)處理和l-name預(yù)處理，分別促進(jìn)和阻斷了硬化肝臟再灌注后肝臟內(nèi)源性no的合成，繼而分別增加和減少了fhbf，最終分別減輕和加重了肝臟的i

27、/r損傷。l-arg預(yù)處理上調(diào)的no不但調(diào)節(jié)了ipss，還可以增加門(mén)靜脈血流，更有效地增加fhbf。通過(guò)本實(shí)驗(yàn)，我們認(rèn)為l-arg預(yù)處理能夠增加no合成，從而增加fhbf，發(fā)揮對(duì)肝硬化大鼠肝臟i/r損傷的保護(hù)作用。l-arg預(yù)處理還改善了細(xì)胞的能量代謝，表現(xiàn)在精氨酸組肝組織na+/k+-atpase、 mg2+-atpase、ca2+-atpase較缺血再灌注組顯著升高(p<0.01)。l-arg預(yù)處理增加肝臟no含量的機(jī)制有以下幾方面：?譹?訛缺血期因肝臟損傷而釋放大量精氨酸酶，再灌注后進(jìn)入體循環(huán)，使內(nèi)源性l-arg消耗，no生成原料不足10。l-arg預(yù)處理為no的合成提供了底物。?

28、譺?訛精氨酸組enos較缺血再灌注組顯著升高(p<0.01)，提示l-arg能誘導(dǎo)肝細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞enos表達(dá)增強(qiáng)，從而增加了肝臟組織no含量。?譻?訛當(dāng)no發(fā)揮肝臟的保護(hù)作用后，有效灌注的改善也將提供更多的氧及atp，并使l-arg更有效地與肝細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞作用，產(chǎn)生更多的no。綜上所述，我們的研究證明l-arg預(yù)處理對(duì)硬化肝臟i/r損傷具有保護(hù)作用。l-arg通過(guò)增加肝臟no含量，從而增加了fhbf，改善肝細(xì)胞能量代謝，發(fā)揮對(duì)硬化肝臟i/r損傷的保護(hù)作用。但確切機(jī)制還不很清楚，尤其在相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄和調(diào)控水平上所知甚少，有待更深入的研究。【參考文獻(xiàn)】1 li x， benjamin i

29、s， naftalin r， et al. location and function of intrahepatic shunts in anaesthetised ratsj. gut，2003，52(9)：1339-1346.2 張愛(ài)龍，楊鎮(zhèn)，肖亮，等. 血吸蟲(chóng)病性門(mén)脈高壓癥兔肝臟微血管構(gòu)造變化的研究j. 微循環(huán)學(xué)雜志，2007，17(2)：11-12.3 goh bj， tan bt， hon wm， et al. nitric oxide synthase and heme xygenase expressions in human liver cirrhosisj. world j

30、 gastroenterol，2006，12(4)：588-594.4 jorge gs， barbara l， aina rv， et al. increased oxidative stress in cirrhotic rat livers： a potential mechanism contributing to reduced nitric oxide bioavailabilityj. hepatology，2008， 47(4)：1248-1256.5 li x， benjamin is， naftalin r. reproducible production of thioacetamide-induced macronodular cirrhosis in the rat with no mortalityj. j hepatol，2002，36(4)：488-493.6 molino g， avagnina p， ballare m， et al. combined evaluation of total and functional liver plasma fl