分子遺傳學(xué)基因治療

1、基因治療 Gene therapy,一）、基因治療的發(fā)展簡(jiǎn)史、概念及背景 （二）、基因治療的基因?qū)胂到y(tǒng) （三）、基因治療的途徑 （四）、基因治療的靶細(xì)胞研究 （五）、基因治療在單基因遺傳病、腫瘤和心血管疾病治療上的應(yīng)用 （六）、基因治療面臨的問(wèn)題和挑戰(zhàn) （七）、基因治療的發(fā)展方向,一）、基因治療的發(fā)展簡(jiǎn)史、概念及背景,基因治療的發(fā)展簡(jiǎn)史,基因治療的概念,經(jīng)典：針對(duì)遺傳病某一基因缺陷，將外源基因?qū)塍w內(nèi)予以矯正； 現(xiàn)在：凡是在基因水平上進(jìn)行操作而達(dá)到治療疾病的所有療法,上世紀(jì)九十年代初，一位因ADA(腺苷酸脫氨酶)基因缺陷導(dǎo)致嚴(yán)重免疫缺損的四歲女孩，由美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院用ADA基因治療，取得療

2、效?！盎蛑委煛毖芯繜釓拇瞬叭澜?，起而效顰，為保障人類健康展現(xiàn)了美好的前景,截止到2012年1月，基因治療試驗(yàn)的全球分布,截止到2012年1月，基因治療試驗(yàn)的國(guó)家分布,基因治療的疾病類型,基因治療試驗(yàn)的臨床階段,1989- 2012年1月，每年全球被批準(zhǔn)的臨床數(shù)目,基因治療選用的載體分類,世界第一個(gè)基因治療藥物在中國(guó)誕生,人民網(wǎng)深圳2003年10月22日15：30急電 正在這里召開(kāi)的深圳市政府新聞發(fā)布會(huì)向世界公布了一項(xiàng)振奮人心的消息：“世界首個(gè)基因治療藥物在中國(guó)誕生”。 深圳市賽百諾基因技術(shù)有限公司研制開(kāi)發(fā)的抗癌新藥“重組人p53腺病毒注射液”（商品名“今又生”），10月16日獲得國(guó)家儀器

3、藥品監(jiān)督管理局頒發(fā)的新藥證書。這標(biāo)志著我國(guó)在基因治療藥物研制和產(chǎn)業(yè)化方面已達(dá)世界領(lǐng)先水平，在國(guó)際競(jìng)爭(zhēng)中搶占了先機(jī)。 賽百諾公司負(fù)責(zé)人說(shuō)，這種新藥是擁有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的廣譜腫瘤基因治療藥品，可望明年一月正式上市,根據(jù)靶細(xì)胞的類型分類： 1、生殖細(xì)胞（germ cell)基因治療： 2、體細(xì)胞（somatic cell)基因治療 根據(jù)基因轉(zhuǎn)移的途徑分類： 1、in vivo(活體直接轉(zhuǎn)移或稱一步法） 2、ex vivo(回體轉(zhuǎn)移或稱二步法,基因治療的種類,1、基因置換 基因置換就是用正常的基因原位置換病變細(xì)胞內(nèi)的致病基因，使細(xì)胞內(nèi)的突變致病基因完全恢復(fù)正常狀態(tài)，這種基因治療方法最為理想。但這種方法是

4、建立在同源重組技術(shù)基礎(chǔ)上的，而目前同源重組雖然在技術(shù)上可行，但重組的效率很低，遠(yuǎn)沒(méi)達(dá)到基因治療要求的水平，在臨床試驗(yàn)上就更無(wú)法實(shí)現(xiàn)了,基因治療的策略,2、基因修復(fù) 基因修復(fù)是指將致病基因的突變堿基序列定點(diǎn)糾正，可用來(lái)治療點(diǎn)突變導(dǎo)致的疾病。但由于糾錯(cuò)效率低的原因，實(shí)踐中有相當(dāng)?shù)碾y度,3、基因增補(bǔ) 將目的基因?qū)牖颊唧w內(nèi)，其表達(dá)產(chǎn)物能補(bǔ)償缺陷細(xì)胞的功能，可用于隱性遺傳病的治療,4、基因失活 利用反義技術(shù)特異性封閉、抑制有害基因表達(dá)，可用于一些顯性遺傳病或腫瘤的基因治療,Andrew Z. Fire、Craig C. Mello,1998年Andrew Z. Fire、Craig C. Mello等

5、發(fā)現(xiàn)將很少量的雙鏈RNA注入秀麗線蟲體內(nèi)，即可高效、特異地阻斷/抑制與雙鏈RNA同源的基因表達(dá)，其阻斷/抑制率比純化后的反義RNA技術(shù)高若干個(gè)數(shù)量級(jí)。雙鏈RNA導(dǎo)入細(xì)胞后引起與該段RNA同源的mRNA發(fā)生特異性降解，進(jìn)而使相應(yīng)基因抑制的轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象稱RNA干擾,雙鏈RNA特異性核酸內(nèi)切酶（dsRNA-specific endonuclease，Dicer）切割，形成21-23nt的雙鏈短干擾RNA（short-interference RNA，siRNA）， siRNA鏈為5端磷酸化，3端有二個(gè)堿基以非配對(duì)方式懸垂,siRNA與由蛋白及酶類組成的RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RNA-Induce

6、d Silencing Complex，RISC）結(jié)合后，由于RISC具有解旋酶活性， siRNA中的正義鏈和反義鏈解旋、解鏈。隨后正義鏈被降解，而與RISC結(jié)合的反義鏈則按照堿基互補(bǔ)配對(duì)原則與靶mRNA中的同源序列結(jié)合，并由RISC發(fā)揮核酸內(nèi)切酶作用，在距siRNA3斷11或12個(gè)堿基處切割靶mRNA,倍增放大作用：siRNA一方面可引導(dǎo)RISC特異性切割靶mRNA；另一方面， siRNA還可作為引物與靶mRNA結(jié)合，在RNA依賴性RNA多聚酶（RNA-dependent RNA polymerase，RdRp）的作用下合成新的ds-RNA，再次經(jīng)Dicer酶切割，形成新的siRNA，并作用

7、于靶mRNA,RNA干擾,微小RNA（microRNA,微小RNA（microRNA）大量存在人類基因組中的非編碼RNA，能特異識(shí)別成熟mRNA的3非翻譯區(qū)，抑制mRNA的翻譯。 微小RNA（microRNA）1993 年Lee等在對(duì)秀麗線蟲進(jìn)行突變體的遺傳分析中首次發(fā)現(xiàn)的不能編碼蛋白質(zhì)，但能時(shí)序調(diào)控其胚胎后期發(fā)育基因表達(dá)的miRNA:Lin一4,2000年Reinhart等在線蟲中發(fā)現(xiàn)了另一 種重要的具有轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)作用的miRNA:let一7，后來(lái)發(fā)現(xiàn)了大量類似RNA，2001年起統(tǒng)一稱為miRNA,miRNA通常來(lái)源于一個(gè)大小約為 1000bp的 長(zhǎng)鏈RNA初始轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(Pri一miRNA

8、)，Pri一miRNA分子在細(xì)胞核中經(jīng)過(guò)雙鏈RNA特異性核酸酶Rnaselll一Drosha的作用形成70-100nt的具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的RNA分子(pre一miRNA)。pre一miRNA在轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白一5(Exportin一5)的作用下轉(zhuǎn)運(yùn)至胞質(zhì)中，被另一個(gè)雙鏈RNA特異性核酸酶Rnaselll一Dicer識(shí)別，進(jìn)一步被切割成長(zhǎng)約22nt的小分子RNA，即成熟的miRNA。成熟miRNA在RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物引導(dǎo)下，當(dāng)與mRNA完美互補(bǔ)時(shí)，miRNA便指導(dǎo)mRNA特異性切割;當(dāng)兩者沒(méi)有足夠的互補(bǔ)性時(shí)，miRNA則抑制mRNA轉(zhuǎn)錄后翻譯,隨著人類后基因組計(jì)劃的進(jìn)一步開(kāi)展，占類基因組90%以上的非編

9、碼序列越來(lái)越引起科學(xué)家的關(guān)注，據(jù)計(jì)算推測(cè)，人類基因組可能存在1000多個(gè)miRNA基因， 單個(gè)miRNA可調(diào)控200多個(gè)靶基因，約1/3的蛋白編碼基因受miRNA調(diào)控,miRNA是調(diào)節(jié)真核生物基因表達(dá)的天然反義寡核昔酸鏈。研究表明，miRNA參與了生命過(guò)程中一系列的重要過(guò)程，包括發(fā)育進(jìn)程、造血過(guò)程、器官形成、細(xì)胞增殖和凋亡等，與許多疾病的發(fā)生、診斷、治療和預(yù)后密切相關(guān)，miRNA也因而成為當(dāng)前研究的新熱點(diǎn),5、免疫調(diào)節(jié) 將抗原、抗體或細(xì)胞因子基因?qū)牖颊唧w內(nèi)，改變其免疫狀態(tài)，達(dá)到預(yù)防和治療疾病的目的。如可將白細(xì)胞介素-2 （IL-2）導(dǎo)入腫瘤病人體內(nèi)，提高病人（IL-2）的水平，激活體內(nèi)免疫系

10、統(tǒng)的活性,許多腫瘤都能表達(dá)一些腫瘤特異的抗原，將這些在正常機(jī)體內(nèi)并不表達(dá)的腫瘤特異抗原的編碼基因轉(zhuǎn)入腫瘤內(nèi)，制備成腫瘤DNA瘤苗，再導(dǎo)入患者體內(nèi)，通過(guò)其在機(jī)體內(nèi)的表達(dá)可以激發(fā)機(jī)體對(duì)編碼抗原的免疫反應(yīng)。如黑色素瘤相關(guān)抗原MAGE、在多種腫瘤中表達(dá)的癌胚抗原CEA、病毒基因產(chǎn)物HPV-E6、E7等,6、其他方法 增加腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。如向腫瘤細(xì)胞導(dǎo)入單純皰疹病毒胸苷激酶基因，然后給予病人無(wú)毒性核苷類似物GCV（甘昔洛韋，ganciclovir）的藥物前體，由于只有含單純皰疹病毒胸苷激酶基因的細(xì)胞才能將GCV轉(zhuǎn)化成有毒的藥物，因而腫瘤細(xì)胞被殺死，而對(duì)正常細(xì)胞影響不大,由于基因治療的人體試驗(yàn)

11、引發(fā)了爭(zhēng)論，為了規(guī)范這一新生事物，使其更好地為人類健康服務(wù)，但同時(shí)又在人類倫理學(xué)的接受范圍內(nèi)，1975年美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院（NIH）召集和組織了重組DNA顧問(wèn)委員會(huì)（Recombinant DNA Advisory Committee,RAC）,制定了一系列有關(guān)重組DNA研究的法規(guī)，接著RAC又任命了一個(gè)人體基因治療的分委員會(huì)（Human Gene Therapy Subcommittee）,并于1985年頒布了一個(gè)權(quán)威性的文件，稱為“人體細(xì)胞基因治療方案的設(shè)計(jì)和提請(qǐng)批準(zhǔn)的注意要點(diǎn)”，該文件要點(diǎn)如下,基因治療的守則,1、什么病可以采用基因治療？即被治療的疾病是否嚴(yán)重到必須要用這種全新和從未嘗試

12、過(guò)的療法？試圖增加一個(gè)人的能力而不是治療疾病，將立即被否決,2、該病目前是否有其他治療方法？要求基因治療必須用于目前尚無(wú)滿意療法的疾病，在其他所有因素均等同的情況下，基因治療應(yīng)較其他療法更有效,3、根據(jù)已有的實(shí)驗(yàn)室和臨床研究，基因治療對(duì)于患者及其子女和接觸者的安全性如何估計(jì)？即基因治療的安全性必須有保證,4、根據(jù)已有的實(shí)驗(yàn)室和臨床研究，基因治療的療效預(yù)計(jì)將如何？即基因治療的有效性在進(jìn)行人體試驗(yàn)前要有足夠的動(dòng)物試驗(yàn)證據(jù),5、如果滿意地回答了上述4個(gè)問(wèn)題，那么如何公正地選擇受試者？ 6、如果上述5個(gè)問(wèn)題都有滿意的答案，那么醫(yī)生將如何把基因治療的各種情況恰當(dāng)正確地告知患者，以及他們將如何表達(dá)同意和不

13、同意？即要保證患者的知情同意權(quán),7、在滿意地回答了上述所有問(wèn)題后，將采取什么步驟來(lái)保護(hù)接受基因治療患者的隱私權(quán)？ 臨床申請(qǐng)的基因治療方案經(jīng)過(guò)審議，如果不符合這些條件，則禁止實(shí)施,二）、基因治療的基因?qū)胂到y(tǒng),基因?qū)胂到y(tǒng)（gene delivery system）是基因治療的核心技術(shù)，可分為病毒載體系統(tǒng)和非病毒載體系統(tǒng),1.病毒載體系統(tǒng) 用于基因治療的病毒載體應(yīng)具備以下基本條件： 1).攜帶外源基因并能包裝成病毒顆粒；2).介導(dǎo)外源基因的轉(zhuǎn)移和表達(dá)；3).對(duì)機(jī)體不致病,大多數(shù)野生型病毒對(duì)機(jī)體都具有致病性。因此需要對(duì)其進(jìn)行改造后才能用于人體。原則上，各種類型的病毒都能被改造成病毒載體。但是由于病

14、毒的多樣性及與機(jī)體復(fù)雜的依存關(guān)系，人們至今對(duì)許多病毒的生活周期、分子生物學(xué)、與疾病發(fā)生及發(fā)展的關(guān)系等的認(rèn)識(shí)還很不全面,從而限制了許多病毒發(fā)展成為具有實(shí)用性的載體。近20年來(lái)，只有少數(shù)幾種病毒如反轉(zhuǎn)錄病毒（包括HIV病毒）、腺病毒、腺病毒伴隨病毒、皰疹病毒（包括單純皰疹病毒、痘苗病毒及EB病毒）等被成功地改造成為基因轉(zhuǎn)移載體并開(kāi)展了不同程度的應(yīng)用,病毒載體產(chǎn)生的原理 病毒載體的產(chǎn)生建立在對(duì)病毒的生活周期和分子生物學(xué)認(rèn)識(shí)的基礎(chǔ)之上。研究病毒載體首先要對(duì)病毒的基因組結(jié)構(gòu)和功能有充分的了解，最好能獲得病毒基因組全序列信息。病毒基因組可分為編碼區(qū)和非編碼區(qū)。編碼區(qū)基因產(chǎn)生病毒的結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白；根據(jù)

15、其對(duì)病毒感染性復(fù)制的影響，又可分為必需基因和非必需基因。非編碼區(qū)中含有病毒進(jìn)行復(fù)制和包裝等功能所必需的順式作用元件,各種野生型病毒顆粒都具有一定的包裝容量，即對(duì)所包裝的病毒基因組的長(zhǎng)度有一定的限制。一般來(lái)說(shuō)，病毒包裝容量不超過(guò)自身基因組大小的105110?；蛑亟M技術(shù)的發(fā)展使病毒載體的產(chǎn)生成為可能。最簡(jiǎn)單的做法是，將適當(dāng)長(zhǎng)度的外源DNA插入病毒基因組的非必需區(qū)，包裝成重組病毒顆粒,然而，這樣的重組病毒作為基因轉(zhuǎn)移載體有許多缺點(diǎn)。首先，許多野生型病毒通過(guò)在細(xì)胞中產(chǎn)毒性復(fù)制而導(dǎo)致細(xì)胞裂解死亡；或帶有病毒癌基因而使細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化。因此必須經(jīng)過(guò)改造使其成為復(fù)制缺陷性病毒并且刪除致癌基因后才能用于基因治療

16、,其次，插入外源DNA的長(zhǎng)度受到很大限制，尤其對(duì)于基因組本身較小的病毒如腺病毒相關(guān)病毒（AAV，4.7kb）、反轉(zhuǎn)錄病毒（810kb）、腺病毒（36kb），如果不去除病毒基因，可供外源DNA插入的容量就十分小。因此，必須刪除更多的病毒基因以騰出位置插入較大的外源DNA。 為了增加病毒載體插入外源DNA的容量，除了可以刪除病毒的非必需基因外，還可以進(jìn)一步刪去部分或全部必需基因，這些必需基因的功能由輔助病毒或包裝細(xì)胞系反式提供,LTR,gag,pol,env,LTR,長(zhǎng)末端 重復(fù)序列,調(diào)節(jié)和 啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄,產(chǎn)生病毒 核心蛋白,產(chǎn)生 逆轉(zhuǎn)錄酶,產(chǎn)生病毒 外膜蛋白,包裝信號(hào),以反轉(zhuǎn)錄病毒為例： DNA前病

17、毒的結(jié)構(gòu)特征,逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建,常用的是莫洛尼小鼠白血病病毒(MoMLV)構(gòu)建的各類逆轉(zhuǎn)錄病毒載體,LTR,gag,pol,env,LTR,長(zhǎng)末端 重復(fù)序列,調(diào)節(jié)和 啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄,包裝信號(hào),目的基因,標(biāo)記基因,LTR,gag,pol,env,LTR,Gag蛋白,PoL蛋白,Env蛋白,包裝細(xì)胞系,LTR,LTR,靶細(xì)胞,目的基因,標(biāo)記基因,LTR,LTR,目的基因,標(biāo)記基因,1,2,3,4,5,假病毒顆粒的產(chǎn)生并感染靶細(xì)胞,逆轉(zhuǎn)錄病毒載體,重組逆轉(zhuǎn)錄病毒 (核酸部分是逆轉(zhuǎn)錄病毒載體,輔病毒,1）物理方法,1）電穿孔法（electroporotion）將細(xì)胞置于高壓脈沖電場(chǎng)中，通過(guò)電壓使細(xì)胞產(chǎn)生

18、可逆性的穿孔。周圍基質(zhì)中的DNA可滲進(jìn)細(xì)胞，進(jìn)而表達(dá)。 瞬間 細(xì)胞 細(xì)胞膜核膜通透性增加 高壓脈沖 DNA滲入細(xì)胞,2）顯微注射法（microinjection,利用顯微操作把目的基因直接注入靶細(xì)胞或細(xì)胞核,不需要進(jìn)行基因工程的繁瑣操作，直接將裸露基因DNA注入動(dòng)物肌肉或某些器官組織內(nèi)。 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明：接受注射外源DNA的小鼠能夠按其基因編碼合成相應(yīng)的蛋白質(zhì)，并能維持?jǐn)?shù)月之久。 1.將促進(jìn)心臟血管生長(zhǎng)的基因直接注入實(shí)驗(yàn)鼠的心臟，可使其心臟壁內(nèi)毛細(xì)血管增加30%40%； 2.將胰島素基因直接注入鼠骨骼肌細(xì)胞，能分泌糖尿病所缺少的胰島素； 3.肌內(nèi)注射凝血因子基因，可產(chǎn)生血友病所需的凝血因子等等,

19、基因直接注射法的優(yōu)點(diǎn),1.制備具有調(diào)控部件的質(zhì)粒DNA重組體的技術(shù)較容易； 2.排除病毒載體可能潛在的致癌性或其他副作用； 3.導(dǎo)入的基因不需整合即可表達(dá)，避免了逆轉(zhuǎn)錄病毒載體導(dǎo)入整合后，一旦發(fā)生副作用不易中止或逆轉(zhuǎn)的缺點(diǎn)； 4.基因直接注射法可反復(fù)使用，而病毒載體則可能誘導(dǎo)體內(nèi)免疫應(yīng)答，致使反復(fù)治療效果下降,例：轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的制備,重組基因 DNA 微注射 （體外） 小鼠受精卵 回植 假妊娠 仔 鼠 動(dòng)物模型：轉(zhuǎn)基因鼠 (每個(gè)鼠細(xì)胞中都含有外源基因，按孟德?tīng)柗绞竭z傳,clone sheep Dolly 體細(xì)胞 提取 核 重組細(xì)胞 回植 Dolly 卵細(xì)胞 去核 細(xì)胞,3）微粒子轟擊法,利用亞微

20、粒的鎢和金能吸附DNA，并將其包裹起來(lái)形成微粒，通過(guò)物理途徑獲得高速度，微粒瞬間既可進(jìn)入靶細(xì)胞，達(dá)到轉(zhuǎn)移目的基因的目的，而不損傷靶細(xì)胞。 該方法可使目的基因在皮膚、肝、胰、胃及乳腺等細(xì)胞中表達(dá),2）化學(xué)法,磷酸鈣沉淀法： 目的基因與磷酸鈣等物質(zhì)混合，形成沉淀的DNA微細(xì)顆粒，易通過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，并整合到受體細(xì)胞基因組中，在適當(dāng)條件下得以表達(dá),磷酸鈣+DNA 混合微細(xì)顆粒 沉淀反應(yīng)2030min 細(xì)胞在沉淀物中暴露 524h 方法簡(jiǎn)單，但轉(zhuǎn)化效率低,3 脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移技術(shù)使用方便、成本低廉。 基本原理:利用陽(yáng)離子脂質(zhì)體單體與DNA混合后，可以自動(dòng)形成包埋外源DNA的脂質(zhì)體，然后與細(xì)胞一

21、起孵育，即可通過(guò)細(xì)胞內(nèi)吞作用將外源DNA（即目的基因）轉(zhuǎn)移至細(xì)胞內(nèi)，并進(jìn)行表達(dá),人工脂質(zhì)體膜具有如下特點(diǎn)： 與體細(xì)胞相容，無(wú)毒性和免疫原性 可生物降解，不會(huì)在體內(nèi)堆積 可制成球狀(0.0350 m)，包容大小不同的生物活性分子 可帶有不同的電荷 具有不同的膜脂流動(dòng)性、穩(wěn)定性、及溫度敏感性，能適應(yīng)不同的生理要求,64,脂粒與細(xì)胞膜之間四種可能的相互作用形式 1、膜間傳遞 2、吸附 3、細(xì)胞吞噬 4、融合,2）受體介導(dǎo)轉(zhuǎn)移技術(shù),將DNA與細(xì)胞或組織親和性的配體偶聯(lián)，可使DNA具有靶向性。這種偶聯(lián)通常通過(guò)多聚陽(yáng)離子（如多聚賴氨酸）來(lái)實(shí)現(xiàn)。多聚陽(yáng)離子與配體共價(jià)連接后，又通過(guò)電荷相互作用與帶負(fù)電荷的DN

22、A結(jié)合，將DNA包圍，只留下配體暴露于表面。這樣形成的復(fù)合物可被帶有特異性受體的靶細(xì)胞吞飲，從而將外源DNA導(dǎo)入靶細(xì)胞,受體介導(dǎo)轉(zhuǎn)移技術(shù)示意圖,三)、基因治療的途徑,根據(jù)基因轉(zhuǎn)移的途徑分類： 1、ex vivo(回體轉(zhuǎn)移或稱二步法）將人體細(xì)胞從體內(nèi)取出, 基因改造, 再移植到人體中。 2、in vivo(活體直接轉(zhuǎn)移或稱一步法）直接將基因轉(zhuǎn)移到人體中, 如DNA注射,口服, 噴霧等。 有如普通治療藥物, 商業(yè)化發(fā)展方向所在,基因治療的ex vivo 途徑,家族性高膽固醇血癥是由于肝細(xì)胞表面低密度脂蛋白（LDL）受體缺乏所致。取出一小部分肝臟，打碎體外培養(yǎng)，用反轉(zhuǎn)錄病毒攜帶的LDL受體基因轉(zhuǎn)染培

23、養(yǎng)細(xì)胞，將整合有LDL受體基因的肝細(xì)胞通過(guò)門靜脈輸回肝臟,基因治療就向打針和吃藥一樣,基因治療的in vivo 途徑,在大多數(shù)基因治療臨床試驗(yàn)中，來(lái)自患者血液或骨髓的細(xì)胞在實(shí)驗(yàn)室中培養(yǎng)。這些細(xì)胞被暴露在帶有目的基因的病毒中。病毒進(jìn)入細(xì)胞后，目的基因就成為宿主細(xì)胞DNA的一部分。這些細(xì)胞在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)后，通過(guò)靜脈注射重新回到患者體內(nèi)。這類基因治療被稱為ex vivo，就是體外的意思?；蚴潜贿\(yùn)送到患者細(xì)胞中，但這些細(xì)胞存在于患者體外。 在其他研究中，載體被用于將目標(biāo)基因運(yùn)送到患者體內(nèi)的細(xì)胞中。這種基因治療被稱為“體內(nèi)，in vivo,四）、基因治療的靶細(xì)胞研究,基因治療的靶細(xì)胞/器官,1. 基因缺

24、陷的細(xì)胞: 如受體缺陷細(xì)胞, 腫瘤細(xì)胞等原位細(xì)胞. 2. 廣泛的細(xì)胞類型: 造血干細(xì)胞 皮膚成纖維細(xì)胞 血液淋巴細(xì)胞 肌細(xì)胞 肝細(xì)胞 骨髓基質(zhì)細(xì)胞,根據(jù)靶細(xì)胞的類型分類： 1、生殖細(xì)胞（germ cell)基因治療 2、體細(xì)胞（somatic cell)基因治療,1)生殖細(xì)胞基因治療：生殖細(xì)胞基因治療(germ cell gene therapy)是將正?；蜣D(zhuǎn)移到患者的生殖細(xì)胞（精細(xì)胞、卵細(xì)胞、早期胚胎中）使其發(fā)育成正常個(gè)體。 由于有著床前診斷技術(shù)，生殖細(xì)胞基因治療已無(wú)必要,2)體細(xì)胞基因治療：體細(xì)胞基因治療(somatic cell gene therapy)是指將正?；蜣D(zhuǎn)移到體細(xì)胞，或

25、整合到染色體上，或獨(dú)立于染色體外，使之表達(dá)基因產(chǎn)物，以達(dá)到治療目的。這種方法的理想措施是將外源正?；?qū)氚畜w細(xì)胞內(nèi)染色體特定基因座位，用健康的基因確切地替換異常的基因，使其發(fā)揮治療作用，同時(shí)還須減少隨機(jī)插入引起新的基因突變的可能性。對(duì)特定座位基因轉(zhuǎn)移，目前還有很大困難,五）、基因治療在單基因遺傳病、腫瘤和心血管疾病治療上的應(yīng)用,遺傳病的治療,遺傳病的治療分為三個(gè)層次：（1）生理水平的治療對(duì)癥治療 苯丙酮尿癥限制膳食中苯丙氨酸含量 白 化 病戴帽子和墨鏡,2）蛋白質(zhì)水平治療 向病人體內(nèi)補(bǔ)充缺失的蛋白質(zhì)。 如：血友病補(bǔ)充凝血因子。 有時(shí)，補(bǔ)充必要的酶也很起作用。纖維性囊泡化病（CF）是美國(guó)白色人

26、種中較為常見(jiàn)的遺傳病。病兒從肺、胰腺等處分泌粘液，阻礙呼吸、消化等功能。5歲前可能因呼吸阻礙致死,CF病兒 吸入基因工程法制備的 DNA 酶粉， 癥狀大為改善,3）基因治療 遺傳病的根治應(yīng)該是基因治療，但是基因治療的難度很高。 1990 年第一例基因治療臨床試驗(yàn)使腺苷酸脫氨酶（ADA）基因進(jìn)入骨髓細(xì)胞，再送回病人體內(nèi)，治療嚴(yán)重綜合免疫缺失癥（SCID）獲得初步效果,基因治療的策略,1.替代缺失的基因 （CFTR for CF） 2.正?；蛲庠椿虻漠惓１磉_(dá) (insulin) 3.靶細(xì)胞中表達(dá)毒素（TK gene） 4.封閉靶細(xì)胞中有害基因的表達(dá)（antisense） 5.核酶（ribozym

27、e,實(shí)施基因治療的必要步驟如下： 找到致病基因 克隆得到大量與致病基因相 應(yīng)的正?；?采取適當(dāng)方法把正常基因放回 到病人身體內(nèi)去 進(jìn)入體內(nèi)的正?；驊?yīng)正常表達(dá),腺苷脫氨酶（ADA）缺乏癥,ADA缺乏癥是一種罕見(jiàn)的遺傳病，患者沒(méi)有正常的ADA基因，他們的缺陷基因不能產(chǎn)生功能性ADA酶。ADA缺乏的孩子一出生就有嚴(yán)重的免疫缺陷，十分容易受感染，有生命的危險(xiǎn)。雖然ADA缺乏癥能用PEG-ADA治療，但這種藥物十分昂貴（一年要花60000美元），而且必須通過(guò)靜脈注射來(lái)維持生命,嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺失癥（SCID）患兒從出生時(shí)起就必須生活在隔離室中,ADA缺乏癥被選為第一個(gè)基因治療試驗(yàn)有以下幾點(diǎn)原因： 這種

28、疾病是由單個(gè)基因的缺陷導(dǎo)致的，基因治療成功的可能性高；基因調(diào)控很簡(jiǎn)單，總是開(kāi)啟的狀態(tài)，不像許多其他基因，調(diào)控很復(fù)雜 ；ADA的數(shù)量無(wú)需精確調(diào)控。即使很少量的酶也能受益，即使數(shù)量很多也能忍受,腺苷脫氨酶（ADA）缺乏癥,1990年9月14日，安德森將經(jīng)過(guò)改造的含有健康基因的白細(xì)胞輸入因腺苷脫氨酶缺乏造成先天性免疫功能不全，只能生活在無(wú)菌的隔離帳里的4歲女孩的左臂靜脈血管，以后的10個(gè)月內(nèi)她又接受了7次同樣的治療。1991年1月，另一名患同樣病的女孩也接受了同樣的治療。兩患兒經(jīng)治療后，免疫功能日趨健全，走出了隔離帳，過(guò)上了正常人生活，并進(jìn)入普通小學(xué)上學(xué),基因治療遺傳病,繼安德林之后，法國(guó)巴黎奈克兒

29、童醫(yī)院的費(fèi)舍爾博士與卡波博士也對(duì)兩例SCID患兒成功地進(jìn)行了基因治療,基因治療遺傳病,2）、血友病B：是基因治療的模式病種之一。常規(guī)治療以輸血和血制品為主，既會(huì)引起嚴(yán)重輸血反應(yīng)，還容易感染病毒，此外還因凝血因子在血液中半衰期短，需要經(jīng)常性輸入，不僅不方便而且治療費(fèi)用昂貴。基因治療為血友病B的治療開(kāi)辟了一條新的途徑,血友病B是基因治療的理想病種，其發(fā)病的生化和遺傳機(jī)制已被闡明，而且hFIX是分泌型蛋白，能在多種組織中被表達(dá)、加工和分泌，基因治療的靶組織選擇范圍廣。另外，血友病B的基因治療對(duì)靶細(xì)胞表達(dá)量的要求不高，只要達(dá)到正常人hFIX血漿濃度的10%（約500ng/mL）左右，就能治愈患者凝血功

30、能的缺陷，同時(shí)血友病B有基因剔除的動(dòng)物模型，有成熟的hFIX表達(dá)量和凝血活性的測(cè)定方法，便于進(jìn)行基因治療的療效評(píng)價(jià),目前，血友病B的基因治療取得了一定的進(jìn)展，但在大動(dòng)物和人體試驗(yàn)的結(jié)果還不夠理想，需進(jìn)一步提高h(yuǎn)FIX的表達(dá)水平以提高治療的有效性和安全性,2、腫瘤基因治療,腫瘤基因治療是通過(guò)將外源基因?qū)肽康募?xì)胞并有效表達(dá)從而達(dá)到治療腫瘤的目的。按目的基因的功能分為以下幾種,1）、抑癌基因的導(dǎo)入和癌基因的反義核酸導(dǎo)入療法 腫瘤形成的分子機(jī)制涉及到癌基因的激活和抑癌基因的失活。 近年來(lái)相繼克隆了Rb、p53、NF1、DCC、ERBA、APC、MTS等抑癌基因。 Rb基因缺陷會(huì)導(dǎo)致視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、小

31、細(xì)胞肺癌和膀胱癌等腫瘤，將正常的Rb基因?qū)胍暰W(wǎng)膜母細(xì)胞瘤中，該細(xì)胞將失去致瘤能力,在超過(guò)50%的腫瘤中都發(fā)現(xiàn)有p53基因的突變。將野生型p53基因轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞，腫瘤細(xì)胞會(huì)發(fā)生凋亡，在動(dòng)物體內(nèi)致瘤能力下降。Clayman等采用腺病毒攜帶p53基因治療頭頸部腫瘤取得了較好的療效,在癌基因的反義基因治療中，目前已經(jīng)選取的靶基因很廣泛，癌基因包括c-src、c-fos、H-ras、K-ras、c-myc等；自分泌的生長(zhǎng)因子及其受體基因包括IGF-1、 IGF-1受體、EGF、TGF-等。Amini等首先將表達(dá)src反義基因的質(zhì)粒導(dǎo)入v-src過(guò)度表達(dá)的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，結(jié)果該細(xì)胞的致瘤性下降。Laird將帶

32、有TGF-反義基因的反轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞株，細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的致瘤性下降；Lian將IGF-1反義基因?qū)隒6大鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞，該細(xì)胞致瘤性下降,2）、免疫基因療法 由于在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中存在機(jī)體免疫系統(tǒng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫耐受狀態(tài)，而這種狀態(tài)可能源于腫瘤細(xì)胞本身的免疫原性不強(qiáng)（如MHC表達(dá)量不足），也可能源于抗原遞呈細(xì)胞不能提供足夠的共刺激信號(hào)（如B7）或者機(jī)體免疫因子分泌不足等。因此可以通過(guò)以下方法糾正機(jī)體腫瘤的免疫耐受狀態(tài),1）、MHC抗原 MHC抗原與免疫識(shí)別和免疫應(yīng)答有關(guān)，只有T細(xì)胞識(shí)別了抗原呈遞細(xì)胞上的MHC抗原后，才能識(shí)別外來(lái)抗原并產(chǎn)生免疫應(yīng)答。由于腫瘤細(xì)胞存在功能性MHC I類抗

33、原和/或共刺激信號(hào)表達(dá)較少，因而可能逃避免疫系統(tǒng)的監(jiān)視?？梢詫⒁恍┡c免疫識(shí)別有關(guān)的基因（如HLA、B7等）轉(zhuǎn)染到體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞，經(jīng)照射后再植入患者體內(nèi)；或?qū)⒈磉_(dá)HLA、B7的病毒載體或質(zhì)粒DNA與脂質(zhì)體復(fù)合物直接注射到瘤體內(nèi)，以增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)的免疫原性，激活機(jī)體的抗腫瘤免疫活性,2）、制備腫瘤DNA瘤苗 許多腫瘤都能表達(dá)一些腫瘤特異的抗原，將這些在正常機(jī)體內(nèi)不表達(dá)的腫瘤特異抗原的編碼基因?qū)牖颊唧w內(nèi)，通過(guò)其在機(jī)體內(nèi)的表達(dá)從而可以激發(fā)機(jī)體對(duì)編碼抗原的免疫反應(yīng)。如黑色素瘤相關(guān)抗原MAGE、酪氨酸酶、癌基因融合基因產(chǎn)物P210bcl-abl和病毒基因產(chǎn)物HPV-E6、E7及癌胚抗原C

34、EA等，這些腫瘤特異性抗原編碼基因可用于制備腫瘤DNA瘤苗。腫瘤DNA瘤苗的轉(zhuǎn)移途徑包括重組病毒感染、直接注射等,3）、細(xì)胞因子基因轉(zhuǎn)移抗腫瘤免疫效應(yīng)細(xì)胞 將細(xì)胞因子基因（如IL-2、IL-4、IL-1、IL-6、IL-7、IL-12、INF-、TNF-、G-CSF、GM-CSF等）導(dǎo)入抗腫瘤的免疫效應(yīng)細(xì)胞（如TIL(tumor infiltrating lymphocyte,腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞)、LAK（lymphokine activated killer cell，淋巴因子活化的殺傷細(xì)胞）及CTL（cytotoxotity T lymphcyte，細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞）中，以提高機(jī)體免疫系統(tǒng)對(duì)

35、腫瘤細(xì)胞的識(shí)別和反應(yīng)能力，這實(shí)際上是免疫治療和基因治療技術(shù)的組合，一定程度上克服了細(xì)胞因子注射療法需反復(fù)多次、副作用大等缺點(diǎn)，療效也有所提高。腫瘤免疫細(xì)胞因子基因治療因其簡(jiǎn)單、有效、安全，已成為腫瘤免疫基因治療研究的最常用方法,4）細(xì)胞因子基因轉(zhuǎn)移腫瘤細(xì)胞 腫瘤細(xì)胞經(jīng)過(guò)細(xì)胞因子轉(zhuǎn)移后，其MHC抗原分子表達(dá)增強(qiáng)，成為免疫原性更強(qiáng)的瘤苗，使多種免疫細(xì)胞在腫瘤局部浸潤(rùn)，增強(qiáng)機(jī)體對(duì)腫瘤的免疫功能,5） “自殺基因”療法 將“自殺基因”（suicide gene)導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞，其能將無(wú)毒性前體藥物在腫瘤細(xì)胞內(nèi)代謝為毒性產(chǎn)物，進(jìn)而選擇性的殺傷腫瘤細(xì)胞。能夠編碼產(chǎn)生將非活性或無(wú)毒性前體藥物轉(zhuǎn)化成活性活毒性藥

36、物的酶的基因，稱“自殺基因”,自殺基因的作用機(jī)制,TK/GCV 單純皰疹病毒（herps simplex virus, HSV）型胸苷激酶（thymidine kinase, tk）基因編碼胸苷激酶，特異性地將無(wú)毒的核苷類似物丙氧鳥苷（ganciclovir, GCV）轉(zhuǎn)變成毒性GCV三磷酸核苷，后者能抑制DNA聚合酶活性，導(dǎo)致細(xì)胞死亡,CD/5-FC 大腸桿菌胞嘧啶脫氨酶（cytosine deaminase, CD）基因，在細(xì)胞內(nèi)將無(wú)毒性5-氟胞嘧啶（5-FC）轉(zhuǎn)變成毒性產(chǎn)物5-氟尿嘧啶（5-FU,1.自殺基因系統(tǒng),旁觀者效應(yīng):“自殺基因”治療不僅使轉(zhuǎn)導(dǎo)了“自殺基因”的腫瘤細(xì)胞在用藥后被殺

37、死，而且與其相鄰的未轉(zhuǎn)導(dǎo)“自殺基因”的腫瘤細(xì)胞也被殺死,2. 旁觀者效應(yīng),3、心血管疾病基因治療,心血管基因治療: VEGF165（血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子）對(duì)于血管的生成具有重要作用, 而一些心腦血管疾病由于血管堵塞,狹窄導(dǎo)致, 可以采用該策略進(jìn)行血管再生, 旁路再通, 使病人免受開(kāi)刀搭橋之苦. 美國(guó)已經(jīng)有多項(xiàng)方案進(jìn)入臨床試驗(yàn), 臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示:新血管生長(zhǎng)、心肌血流灌注和室壁功能改善，大多數(shù)病人的心絞痛減輕,六）基因治療面臨的問(wèn)題和挑戰(zhàn),基因治療的發(fā)展經(jīng)歷了“樂(lè)觀與熱情失望與懷疑理性與挑戰(zhàn)”的過(guò)程，這是符合事物發(fā)展規(guī)律的。目前，基因治療領(lǐng)域存在的主要問(wèn)題是有效性和安全性,主要表現(xiàn)為：(1)基因?qū)?/p>

38、系統(tǒng)缺乏靶向性，效率也較低。如以腺病毒為載體的p53基因轉(zhuǎn)移治療惡性腫瘤的方案中，只能直接將腺病 毒注射到腫瘤局部。若靜脈注射，病毒顆粒將很快被清除，真正能夠到達(dá)腫瘤組織的很少，難以達(dá)到治療效果，且增加了副作用。前面提到的第一例逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)ADA 基因轉(zhuǎn)移成功治療SCID 的病例，因?yàn)閷?dǎo)入效率較低，前后經(jīng)歷了11 次體外轉(zhuǎn)導(dǎo)和回輸,2)目前針對(duì)遺傳性疾病的基因治療方案大多采用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，其插入或整合到染色體的位置是隨機(jī)的，有引起插入突變及細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的潛在危險(xiǎn)。而理想的基因治療方案應(yīng)該是在原位補(bǔ)充、置換或修復(fù)致病基因，或者將治療基因插入到宿主細(xì)胞染色體上不致病的安全位置,3)理想的基因治

39、療應(yīng)能根據(jù)病變的性質(zhì)和嚴(yán)重程度不同，調(diào)控治療基因在適當(dāng)?shù)慕M織器官內(nèi)和以適當(dāng)?shù)乃交蚍绞奖磉_(dá)。但目前還達(dá)不到這一目標(biāo)，其主要原因是：現(xiàn)有的基因?qū)胼d體容量有限，不能包容全基因或完整的調(diào)控順序，同時(shí)人們對(duì)導(dǎo)入的基因在 體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)理的認(rèn)識(shí)有限,1999年9月份，18歲美國(guó)青年Jesse Gelsinger因一種在醫(yī)學(xué)上稱為鳥氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶不足癥的罕見(jiàn)遺傳性疾病而在美國(guó)賓夕法尼亞州大學(xué)人類基因治療中心接受基因治療時(shí)不幸死亡，成為被報(bào)道的首例死于基因治療中的患者,基因治療出現(xiàn)的問(wèn)題,2002年，法國(guó)患有重癥聯(lián)合免疫缺陷病11名兒童基因治療獲得成功。但是，沒(méi)過(guò)多久，檢查出1名兒童患上某種類似白血病，有關(guān)專家認(rèn)為這是由基因治療引起的。這立刻引起各國(guó)的廣泛關(guān)注,基因治療出現(xiàn)的問(wèn)題,治療基因插入逆轉(zhuǎn)錄酶病毒載體，再進(jìn)入患者細(xì)胞中與DNA結(jié)合。這些病毒載體雖經(jīng)過(guò)處理可防止感染，但無(wú)法控制病毒載體在DNA上的插入位置。擔(dān)心病毒載體會(huì)破壞重要基因，導(dǎo)致“插入型突變”。如果破壞的是負(fù)