分子流行病學(xué)的研

1、分子流行病學(xué)的研究進(jìn)展及臨床應(yīng)用,概述,定義 分子流行病學(xué)研究進(jìn)展 分子流行病學(xué)在醫(yī)院感染控制中的應(yīng)用,分子流行病學(xué)定義,分子流行病學(xué)是應(yīng)用先進(jìn)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)測(cè)量生物學(xué)標(biāo)志，結(jié)合流行病學(xué)現(xiàn)場(chǎng)研究方法，從分子水平闡明疾病的病因及其相關(guān)的致病過(guò)程,傳統(tǒng)流行病學(xué),應(yīng)用血清學(xué)方法對(duì)血清中各種成分（抗原、抗體、代謝產(chǎn)物、生化物質(zhì)等）的出現(xiàn)和分布進(jìn)行研究，闡明疾病及健康狀態(tài)在人群中的分布及其影響因素，并在采取預(yù)防控制措施后應(yīng)用血清學(xué)方法來(lái)考核其效果,傳統(tǒng)流行病學(xué) 暴露 疾病 揭示“黑匣子”秘密 分子流行病學(xué),傳染性疾病 耐藥性質(zhì)粒、病原體變異、新傳染病 慢性非傳染病 證實(shí)疾病的病因 多病因、多階段、多基因、長(zhǎng)

2、潛隱期 人群易感性- 研究個(gè)體的發(fā)病差異 生物個(gè)體間的遺傳和環(huán)境不同，易感性差異很大 ， 傳統(tǒng)流行病學(xué)無(wú)法有效測(cè)量,分子流行病學(xué)的產(chǎn)生,分子生物學(xué)的快速發(fā)展 理論突破 斷裂基因，操縱子模型，限制性?xún)?nèi)切酶，DNA聚合酶等 技術(shù)創(chuàng)新 凝膠電泳技術(shù)、核酸體外擴(kuò)增、DNA測(cè)序、蛋白質(zhì)測(cè)序、分子雜交等,分子流行病學(xué)的發(fā)展軌跡,1972年Kilbone博士美國(guó)傳染病學(xué)會(huì)第10次年會(huì)上首次提出 1982年P(guān)erera提出“癌癥分子流行病學(xué)” 1993年美國(guó)人Schulte出版了世界上第一本分子流行病學(xué)專(zhuān)著，即“分子流行病學(xué)” 應(yīng)用分子標(biāo)志物或生物學(xué)測(cè)量研究致病因子與所致疾病之間的聯(lián)系。 A 研究方法拓展 B

3、 研究范圍拓寬,分子流行病學(xué)和傳統(tǒng)流行病學(xué)的關(guān)系,分子流行病學(xué)與醫(yī)院感染控制 -細(xì)菌同源性分析研究在感控中的應(yīng)用,手術(shù)傷口感染！ 院內(nèi)感染？ 導(dǎo)管相關(guān)性血流感染！ 呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎,證據(jù),醫(yī)院感染,醫(yī)院感染是當(dāng)前醫(yī)療衛(wèi)生的重大問(wèn)題之一，由于院內(nèi)感染密切關(guān)系到醫(yī)療服務(wù)質(zhì)量，關(guān)系到病人的預(yù)后、病死率、住院時(shí)間、床位周轉(zhuǎn)率以及病人和國(guó)家的巨額經(jīng)濟(jì)損失等。因而，院內(nèi)感染的控制問(wèn)題已列為國(guó)家乃至世界各國(guó)醫(yī)院管理的重要內(nèi)容,醫(yī)院感染的常規(guī)檢測(cè)項(xiàng)目,醫(yī)院感染病例監(jiān)測(cè) 醫(yī)院環(huán)境衛(wèi)生學(xué)監(jiān)測(cè) 消毒滅菌效果監(jiān)測(cè),醫(yī)院感染爆發(fā)定義,指在醫(yī)療機(jī)構(gòu)或某科室的患者中短時(shí)間內(nèi)發(fā)生3例以上同種同源感染病例的現(xiàn)象 同一種病原體，

4、藥敏一致,院內(nèi)感染控制,院內(nèi)感染的研究中，一個(gè)很重要的問(wèn)題，就是如何確定感染源和傳播途徑，只有明確病原菌的感染方式，才能采取有效的預(yù)防和控制措施,臨床微生物實(shí)驗(yàn)室 基礎(chǔ) 微生物檢驗(yàn)學(xué) 分子流行病學(xué) 方法 院內(nèi)感染控制 目的 臨床診斷 基礎(chǔ),16,分子分型（分子流行病學(xué)研究,從核酸分子水平上分析醫(yī)院感染的發(fā)生、發(fā)展規(guī)律及機(jī)理，更加準(zhǔn)確有效地進(jìn)行醫(yī)院感染管理控制，已成為當(dāng)前國(guó)際醫(yī)院感染管理研究中的重要方向,從患者分離株到病區(qū)周?chē)h(huán)境株的比較分析； 從外源性感染到內(nèi)源性感染 從某一醫(yī)院的醫(yī)院感染暴發(fā)到大范圍甚至世界范圍的感染菌株流行變遷,基因多態(tài)性分析技術(shù)已成為醫(yī)院感染監(jiān)測(cè)控制的高水平研究領(lǐng)域,微生

5、物室在醫(yī)院感染中的作用,鑒定 特殊耐藥菌的檢出 流行病學(xué)分型 PFGE 脈沖場(chǎng)凝膠電泳 RAPD 隨機(jī)擴(kuò)增DNA多態(tài)性,18,消化、釋放出DNA,PFGE原理,19,Enzyme,酶切,PFGE原理,約520個(gè)、長(zhǎng)度10800kb的大片段DNA,20,脈沖場(chǎng)凝膠電泳(PFGE,制備瓊脂糖栓塊,消 化,酶 切,脈沖電泳,結(jié)果解釋,PFGE原理,電場(chǎng)不斷在兩種方向（有一定夾角，而不是相反的兩個(gè)方向）變動(dòng)。DNA分子帶有負(fù)電荷，會(huì)朝正極移動(dòng)。相對(duì)較小的分子在電場(chǎng)轉(zhuǎn)換后可以較快轉(zhuǎn)變移動(dòng)方向，而較大的分子在凝膠中轉(zhuǎn)向較為困難。因此小分子向前移動(dòng)的速度比大分子快 可以用來(lái)分離大小從10kb到10Mb的DN

6、A分子,22,脈沖電泳,PFGE原理,23,PFGE結(jié)果判讀,目測(cè)法： 按美國(guó)疾病控制和預(yù)防中心(CDC)Tenover等人推薦的方法判讀。 圖譜完全相同的定為一個(gè)型，彼此之間相差一個(gè)帶的定為同一型的不同亞型，相差23個(gè)帶的認(rèn)為親緣關(guān)系密切，相差46個(gè)帶的認(rèn)為可能相關(guān)，條帶相差7個(gè)以上的認(rèn)為無(wú)親緣關(guān)系。并隨機(jī)地選擇不同的字母如A、B、C、D等的字母順序分型。 聚類(lèi)分析 計(jì)算機(jī)輸入SPSS，做樹(shù)狀圖,案例一,2006年7月，本市某醫(yī)院外科重癥監(jiān)護(hù)病房（ICU）8例患者下呼吸道感染多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌,目標(biāo)性檢測(cè),對(duì)該ICU的環(huán)境、醫(yī)療用品、醫(yī)務(wù)人員手及鼻咽拭子進(jìn)行細(xì)菌學(xué)監(jiān)測(cè)，共采樣107份，其中

7、23份檢出鮑曼不動(dòng)桿菌，陽(yáng)性率21.3%。主要分布在醫(yī)務(wù)人員手、咽部及床頭柜、輸液泵、監(jiān)護(hù)儀、治療車(chē)、地面、病人用物等環(huán)境和醫(yī)療用品,院感爆發(fā)流行的控制,空氣消毒 15%過(guò)氧乙酸銨2g/m3用量進(jìn) 行蒸熏及臭氧消毒 物表消毒 地面、臺(tái)面0.5%過(guò)氧乙酸拖擦 消毒 醫(yī)療用品消毒 高壓蒸汽滅菌 0.5%過(guò)氧乙酸浸泡消毒 感染患者 隔離治療 ，分組護(hù)理 醫(yī)務(wù)人員咽部帶菌者 每日2-3次呋喃西林滴鼻，口泰嗽口,案例二,2006年我市某院發(fā)現(xiàn)了一例攜帶耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌（痰，血）的患者 為了防止該耐藥菌在醫(yī)院內(nèi)的播散，對(duì)該病區(qū)進(jìn)行目標(biāo)性監(jiān)測(cè),四株肺炎克雷伯菌的藥敏,12 3 4 亞胺培南161616

8、16 厄他培南16161616 頭孢西丁=64=64=64=64 頭孢匹汚=64=64=64=64 頭孢曲松=4=4=4=4 妥布霉素4444 頭孢他啶=16=16=16=16 氨曲南=64=64=64=64 頭孢他啶=64=64=64=64 環(huán)丙沙星=64=64=64=64 哌拉西林他唑巴坦=128=128=128=128 左氧氟沙星=64=64=64=64 氨芐西林=32=32=32=32 氨芐西林，舒巴坦 =32=32=32=32 KB(mm） 2163219320852011 多粘菌素B20202120 美羅培南15151515 頭孢哌酮 舒巴坦6666,耐藥菌的基因型分析,1.為陽(yáng)性

9、對(duì)照（KPC-2) 2.肺克（患者痰） 3.肺克（患者血） 4.肺克（隔壁床患者痰） 5.肺克（病房拖把） 6.為陰性對(duì)照 Mark,聚類(lèi)分析,院感及時(shí)控制因素,及時(shí)發(fā)現(xiàn) 醫(yī)務(wù)人員的重視 ICU 環(huán)境因素(單房間,單獨(dú)護(hù)理) 環(huán)境的消毒措施有效 半年內(nèi)未出現(xiàn)耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌,KPC酶,水解亞胺培南或美羅培南（是目前臨床上控制革蘭陰性菌感染的最有效的抗菌藥物）的一類(lèi)內(nèi)酰胺酶 屬于功能分類(lèi)法的2f組，A類(lèi)，可被克拉維酸抑制，不被乙二胺四乙酸（EDTA）所抑制 現(xiàn)已報(bào)道的KPC亞型共12種亞型 在中國(guó)主要見(jiàn)于浙江,產(chǎn)KPC酶耐藥菌的傳播,研究認(rèn)為，blaKPC位于一種新型的Tn3型的轉(zhuǎn)座子Tn

10、4401上， 其轉(zhuǎn)座子的結(jié)構(gòu)是KPC基因轉(zhuǎn)移的原因 這種新型的轉(zhuǎn)座子結(jié)構(gòu)可以使blaKPC從其原始位置轉(zhuǎn)移至各類(lèi)不同的質(zhì)粒 同時(shí)認(rèn)為轉(zhuǎn)座子Tn4401是一個(gè)復(fù)合轉(zhuǎn)座子，由2次序列插入形成,產(chǎn)KPC酶耐藥菌,有限的DNA指紋和脈沖凝膠電泳資料顯示產(chǎn)KPC酶的腸桿菌科細(xì)菌易發(fā)生醫(yī)院感染的暴發(fā)流行 最早在美國(guó)、特別在美國(guó)的東北部各州蔓延，并造成局部地區(qū)暴發(fā)流行 以后幾年再世界各地都有報(bào)告,脈沖場(chǎng)凝膠電泳（PFGE,對(duì)基因組的DNA酶切片段多態(tài)性進(jìn)行同源性分析，是短期院內(nèi)感染爆發(fā)流行判斷的金標(biāo)準(zhǔn) 是一種分離大分子DNA的方法,耐碳青酶烯腸桿菌科細(xì)菌,2007年下半年零星出現(xiàn)(肺克) 2010年1-8月

11、收集到18株.包括肺克克雷伯菌（15）大腸埃希菌（1）陰溝腸桿菌（1）枸櫞酸桿菌（1,產(chǎn)KPC-2肺克同源性分析(2010.1-8,流行病學(xué)分析,A型傳播源頭:患者來(lái)自上海某醫(yī)院，轉(zhuǎn)至我院重癥監(jiān)護(hù)室，入院次日做痰培養(yǎng)，檢出亞胺培南耐藥的肺克。后轉(zhuǎn)入康復(fù)科，耐藥菌一直被檢測(cè)到。A型患者分布于重癥監(jiān)護(hù)室，康復(fù)科，血液科。 B型和C型的七名患者住我院某外科。B型的五名患者在分離出該耐藥菌前未使用過(guò)碳青霉烯類(lèi)抗生素，推測(cè)是院內(nèi)環(huán)境感染所致 C型的兩名患者，源頭的患者住院時(shí)間長(zhǎng)達(dá)121天，在分離出該菌之前，美羅培南使用時(shí)間近二十天，推測(cè)C型可能是抗生素篩選的結(jié)果,PFGE的局限性,無(wú)法判斷2006年產(chǎn)K

12、PC酶肺克的小范圍流行與2010年出現(xiàn)的15株產(chǎn)KPC酶的肺克A,B,C,三個(gè)克隆間有無(wú)同源性 不同實(shí)驗(yàn)室間的分型結(jié)果不能進(jìn)行比較,多位點(diǎn)序列分型(Multilocus sequence typing,MLST,一種基于核酸序列測(cè)定的細(xì)菌分型方法 通過(guò)PCR擴(kuò)增管家基因內(nèi)部片段 測(cè)定其序列，分析菌株的變異,MLST的原理,一般測(cè)定610個(gè)管家基因內(nèi)部400600bp的核苷酸序列，每個(gè)位點(diǎn)的序列根據(jù)其發(fā)現(xiàn)的時(shí)間順序賦予一個(gè)等位基因編號(hào)，每一株菌的等位基因編號(hào)按照指定的順序排列就是它的等位基因譜 ，也即是這株菌的序列型（sequence type,ST）。這樣得到的每個(gè)ST均代表一組單獨(dú)的核苷酸序列信息,序列型（ST,序列型（ Sequence-typying, STs ）等同于MLEE得出的電泳型(Electrophoretic type, ET） 通過(guò)比較ST可以發(fā)現(xiàn)菌株的相關(guān)性,即密切相關(guān)菌株具有相同的ST或僅有極個(gè)別基因位點(diǎn)不同的ST,而不相關(guān)菌株的S