高級(jí)生化試驗(yàn)-南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生物化學(xué)試驗(yàn)基本原理及主要實(shí)驗(yàn)

1、目錄第一部分 生物化學(xué)技術(shù)概論1.實(shí)驗(yàn)記錄和實(shí)驗(yàn)報(bào)告的書寫2.普通實(shí)驗(yàn)技術(shù)3.實(shí)驗(yàn)樣品的制備4.離心分離技術(shù)原理及使用方法5.電泳原理6.分光分析原理7. 層析分離原理8. 實(shí)驗(yàn)室規(guī)則 第二部分 生物化學(xué)基本實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)一 維生素C的定量測(cè)定 實(shí)驗(yàn)二 考馬氏亮藍(lán)G-250染色法測(cè)定蛋白質(zhì)含量 實(shí)驗(yàn)三 蛋白質(zhì)紫外分光測(cè)定法 實(shí)驗(yàn)四 血清脂蛋白瓊脂糖電泳 實(shí)驗(yàn)五 血清蛋白質(zhì)聚丙烯酰胺凝膠電泳 實(shí)驗(yàn)六 血清蛋白質(zhì)乙酸纖維素薄膜電泳 實(shí)驗(yàn)七 pH對(duì)唾液淀粉反應(yīng)速度的影響實(shí)驗(yàn)八 堿性磷酸米氏常數(shù)的測(cè)定 實(shí)驗(yàn)九 改良Mohun法測(cè)定血清谷-丙轉(zhuǎn)氨酶活性 實(shí)驗(yàn)十 氨基轉(zhuǎn)移作用 實(shí)驗(yàn)十一 離子交換層析分離混合氨基

2、酸 實(shí)驗(yàn)十二 胡蘿卜素的柱層析分離 第三部分 生物化學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)十三 脲酶凝膠過濾分離實(shí)驗(yàn)十四 血清蛋白質(zhì)的聚丙烯酰胺凝膠等電聚焦電泳實(shí)驗(yàn)十五 質(zhì)粒DNA的微量快速提取實(shí)驗(yàn)十六 多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)實(shí)驗(yàn)十七 蛋白質(zhì)印跡分析（Western Blot）實(shí)驗(yàn)十八 堿性磷酸酶比活性測(cè)定 實(shí)驗(yàn)十九 四唑鹽比色法（MTT）法實(shí)驗(yàn)二十 核酸的提取、定量測(cè)定 實(shí)驗(yàn)二十一肝糖原提取與鑒定本部分的內(nèi)容為生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)中所涉及的主要原理。介紹如何正確記錄實(shí)驗(yàn)過程及書寫實(shí)驗(yàn)報(bào)告的一般規(guī)則，是訓(xùn)練學(xué)生進(jìn)行正規(guī)實(shí)驗(yàn)尋林的重要內(nèi)容。普通實(shí)驗(yàn)技術(shù)包括玻璃儀器的洗滌，洗液的配制，吸量管的使用、混勻的方法以及過濾、離心

3、等一般實(shí)驗(yàn)室技術(shù)。實(shí)驗(yàn)樣品的制備著重討論在生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)中，血液、尿液樣品及組織材料的采集和處理，勻漿制備和組織浸出液制備。離心分離技術(shù)、電泳原理、分光分析、層析分離技術(shù)，重點(diǎn)討論這些重要技術(shù)的原理，內(nèi)容則盡可能簡(jiǎn)潔扼要，作為具體實(shí)驗(yàn)內(nèi)容的參考。一.實(shí)驗(yàn)記錄和實(shí)驗(yàn)報(bào)告的書寫實(shí)驗(yàn)是在理論指導(dǎo)下的科學(xué)實(shí)踐，目的在于經(jīng)過實(shí)踐掌握科學(xué)觀察的基本方法和技能，培養(yǎng)學(xué)生科學(xué)思維、分析判斷和解決實(shí)際問題的能力。也是培養(yǎng)探求真知、尊重科學(xué)事實(shí)和真理的學(xué)風(fēng)，培養(yǎng)科學(xué)態(tài)度的重要環(huán)節(jié)。（一）實(shí)驗(yàn)記錄記錄實(shí)驗(yàn)中觀察到的現(xiàn)象、結(jié)果和數(shù)據(jù)，及時(shí)地記錄在激烈路本上。原始數(shù)據(jù)必須準(zhǔn)確簡(jiǎn)練、詳盡、清楚。記錄時(shí)不能夾雜主觀因素，在定

4、量實(shí)驗(yàn)中觀測(cè)的數(shù)據(jù)，如稱量物的重量、滴定管的讀數(shù)、光密度值等，都應(yīng)設(shè)計(jì)一定的表格，依據(jù)儀器的精確度記錄有效數(shù)字。完整的實(shí)驗(yàn)記錄包括實(shí)驗(yàn)日期、實(shí)驗(yàn)題目、目的、操作、結(jié)果。（二）實(shí)驗(yàn)報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，應(yīng)及時(shí)整理和總結(jié)實(shí)驗(yàn)結(jié)果及記錄，按照下列順序?qū)懗鰧?shí)驗(yàn)報(bào)告：1. 實(shí)驗(yàn)名稱（The title of experiment ）：2. 目的（Objective）：3. 原理（Principle）：最好使用簡(jiǎn)式。4. 操作步驟（Operational procedure）：5. 實(shí)驗(yàn)記錄6. 計(jì)算與結(jié)果（Calculation and Results）：7. 討論（Discussion）：對(duì)實(shí)驗(yàn)方法，實(shí)驗(yàn)結(jié)

5、果和異?，F(xiàn)象進(jìn)行探討和評(píng)論，以及對(duì)于實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的認(rèn)識(shí)、體會(huì)和建議。操作者姓名，實(shí)驗(yàn)日期。二、普通實(shí)驗(yàn)技術(shù)（一）玻璃儀器的洗滌與清潔 玻璃儀器的洗滌與清潔直接影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，因此玻璃儀器的洗滌工作是很重要的 1.新購(gòu)置玻璃儀器的清洗 新購(gòu)置來的玻璃儀器表面附著有游離堿質(zhì)，應(yīng)先用肥皂水洗刷后再用流水沖洗，浸泡于I2HCl中過夜，取出后再用流水沖洗，最后用蒸餾水沖洗23次，在干燥箱中烤干或自然晾干，備用。 2.使用過的玻璃儀器的洗滌 （1）一般玻璃儀器：燒杯、三角燒杯、試劑瓶、試管等，可先用洗衣粉或肥皂水刷洗，將器皿內(nèi)外壁細(xì)心地刷洗，使其盡量多地產(chǎn)生泡沫，然后再用自來水洗干凈，洗至容器內(nèi)壁光潔不

6、掛水珠為止，最后用蒸餾水沖洗23次，晾干備用。 （2）容量?jī)x器：吸量管、容量瓶、滴定管等在使用后立即用清水沖洗，勿使粘污物質(zhì)干涸，并及時(shí)用流水或洗衣粉水盡量洗滌，稍干后有鉻酸洗液浸泡數(shù)小時(shí)，然后用自來水反復(fù)沖洗，將洗液完全洗去，最后用蒸餾水沖洗23次，晾干備用。 （3）比色杯：用畢立即用自來水反復(fù)沖洗干凈，如不干凈時(shí)可用HCl或適當(dāng)溶劑沖洗（避免用較強(qiáng)的堿液或強(qiáng)氧化劑清洗），再用自來水沖洗干凈。切忌用試管刷或粗糙的布或紙擦洗，以保護(hù)比色杯透光性，沖洗后倒置晾干備用。（二）清洗液的原理與配制1.肥皂水，洗衣粉溶液和去污粉：是常用的洗滌劑，有乳化作用，可除去污垢，能使脂肪、蛋白質(zhì)及其它粘著性物質(zhì)溶

7、解或松弛，一般玻璃儀器可直接用肥皂水浸泡或刷洗。2.鉻酸洗液（1） 原理：鉻酸洗液由重鉻酸鉀（或重鉻酸鈉）和濃硫酸配制而成,其清潔效力主要應(yīng)用其強(qiáng)氧化性和強(qiáng)酸性。K2Cr2O7 + H2SO4 H2Cr2O7+ K2SO4 2CrO3(鉻酐，紅色) + H2O Cr2O3（綠色） + 3（O） H2SO4 H2O + SO2 + （O）鉻酐越多硫酸越濃，其清潔效力也就越強(qiáng)，當(dāng)洗液變綠色后則不宜應(yīng)用。洗液的配制：稱取重鉻酸鉀5g放于250ml燒杯中，加熱水5ml攪拌，使其盡量溶解，燒杯下墊一一石棉網(wǎng)以防過熱，然后慢慢加入工業(yè)用濃硫酸100ml隨加隨攪拌，盡量避免紅色鉻酐沉淀析出。此時(shí)洗液由紅黃色

8、轉(zhuǎn)為黑褐色，冷卻后儲(chǔ)存于指定容器內(nèi)，蓋緊以防吸水，貼上標(biāo)簽（洗液變綠后不宜使用）。3使用：使用洗液前需將玻璃儀器用自來水沖洗數(shù)次，并將儀器上的水分盡量除去再放洗液中浸泡，數(shù)小時(shí)后取出儀器，用自來水充分清洗至無水分為止，沖洗時(shí)注意勿將洗液濺出水槽，再用少量蒸餾水沖洗數(shù)次，晾干備用。上述兩種洗液時(shí)常用的，實(shí)驗(yàn)中遇到特殊污染物，需用針對(duì)性強(qiáng)的洗滌液。（三）量器類的使用法 量器是指對(duì)液體體積進(jìn)行計(jì)量的玻璃器皿，如滴定管、移液管、容量瓶、量筒、刻度吸量管、刻度離心管及自動(dòng)加液管等。 l.滴定管： 滴定管分常量與微量滴定管。常量滴定管又分為酸式與堿式兩種，各有白色、棕色之分。酸式滴定管用于盛裝酸性、氧化性

9、以及鹽類的稀溶液。堿式滴定管用來盛裝堿性溶液。棕色滴定管用于盛裝見光易分解的溶液。常量滴定管的容積有20、25、50、100毫升四種規(guī)格。微量滴定管分為一般微量滴定管和自動(dòng)微量滴定管，容積為5、10g升等規(guī)格，刻度精度因規(guī)格不同而異。 滴定管主要用于容量分析。它能準(zhǔn)確讀取試液用量，操作比較方便。一般是左手握塞，右手持瓶；左手滴液體，右手搖動(dòng)。在滴定臺(tái)上襯以白紙或者白磁板，以便觀察錐形瓶?jī)?nèi)的顏色。滴定速度以10ml/min，即每秒34滴為宜。接近終點(diǎn)時(shí)，滴速要慢。甚至每秒半滴或l4滴地進(jìn)行滴定，以免過量。達(dá)到終點(diǎn)后稍停l2分鐘，等待內(nèi)壁掛有的溶液完全流下時(shí)再讀取刻度數(shù)。正確讀取容積刻度是減少容量

10、分析實(shí)驗(yàn)誤差的重要措施。滴定管的讀數(shù)方法，可依個(gè)人的習(xí)慣而不同。但是在同一實(shí)驗(yàn)中讀取容積刻度時(shí)，必須以液面的同一特征標(biāo)志為準(zhǔn)，以保證其系統(tǒng)誤差。 一般讀數(shù)方法普通滴定管讀取數(shù)據(jù)，雙眼與液面同水平讀數(shù)。 有色液讀取數(shù)據(jù)是溶液彎月面兩側(cè)最高點(diǎn)連線與刻度線重合點(diǎn) 無色液讀取數(shù)據(jù)是溶液彎月面最低點(diǎn)水平線與刻度線重合點(diǎn)。 2吸量管 可淮確地量取溶液的體積。 （1）分類：常用分三類： 奧氏吸量管：供推確量取05毫升、l毫升、2毫升液體時(shí)用。每根吸量管上只有一個(gè)刻度，放液時(shí)必須吹出量后殘留在吸量管尖端的液體，主要用于量取粘滯系數(shù)大的液體。 移液管：供推確量取5毫升、10毫升、25毫升等較多體積液體時(shí)用。每根

11、吸量管上只有一個(gè)刻度，放出液體流畢后，將吸量管尖在容器內(nèi)壁上繼續(xù)停留15秒，注意不要吹出尖端最后的部分。 刻度吸量管：供量取10毫升以下任意體積的液體時(shí)用。分全流出式與不完全流出式。全流出式：一般包括尖端部分，欲將所量取液體全部放出時(shí)，須將殘留管尖的液體吹出。此類吸量管的上端常標(biāo)有吹字。 不完全流出式：若吸量管上端未標(biāo)有吹字樣，則殘留管尖的液體不必吹出o其刻度不包括吸量管的最后一部分。 （2）吸量管的使用 選擇：使用前先根據(jù)需要選擇適當(dāng)?shù)奈抗埽潭任抗艿目側(cè)萘孔詈玫扔诨蛏源笥谧畲笕∫毫俊ＥR用前要看清容量和刻度。 執(zhí)管：用拇指和中指（輔以無名指），持吸量管上部，用食指堵住上口并控制液體流速，

12、刻度數(shù)字要對(duì)向自己。 取液：用另一只手捏壓橡皮球，將吸量管插入液體內(nèi)（不得懸空，以免液體吸入球內(nèi)），用橡皮球?qū)⒁后w吸至最高刻度上端l2cm處，然后迅速用食指按緊管上口，使液體不致于從管下口流出。 調(diào)準(zhǔn)刻度：將吸量管提出液面，吸粘性較大的液體（如：全血、血清、血漿）時(shí)；先用濾紙擦干管尖外壁，然后用食指控制液體緩慢下降至所需刻度（此時(shí)液體凹面，視線和刻度應(yīng)在同一水面上），并立即按緊吸量管上口o 放液：放松食指，使液體自然流入受器內(nèi)。放液時(shí)，管尖最好接觸受器內(nèi)壁。但不要插入受器內(nèi)原有的液體中，以免污染吸量管和試劑。 洗滌：吸血液、血清等粘稠液體及標(biāo)本（尿液）的吸量管，使用后要及時(shí)用自來水沖洗干凈。吸

13、一般試劑的吸量管可不必馬上沖洗，待實(shí)驗(yàn)完畢后再?zèng)_洗。沖洗干凈，最后用蒸餾水沖洗，晾干備用。 3.容量瓶 用于配制一定濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液或試樣溶液。頸上刻有標(biāo)線，表示在20，溶液裝至標(biāo)線的容積。有10、25、50、100、250、500、1000、2000毫升幾種規(guī)格，并有白色、棕色兩種顏色。 使用方法：使用前應(yīng)先檢查容量瓶的瓶塞是否漏水，瓶塞應(yīng)系在瓶頸上，不得任意更換。瓶?jī)?nèi)壁不得掛有水珠，所稱量的任何固體物質(zhì)都必須先在小燒杯中溶解或加熱溶解，冷卻至室溫后，才能轉(zhuǎn)移到容量瓶中。 4.量筒 量簡(jiǎn)是用來量取要求不太嚴(yán)格的溶液體積的。在配制要求不太準(zhǔn)確的溶液濃度時(shí)，使用量筒比較方便。它有從52000ml十余

14、種規(guī)格。用量筒量取液體體積是一種粗略的計(jì)量法，所以，在使用中必須選用合適規(guī)格，不要用大量筒計(jì)量小體積，也不要用小量筒多次量取大體積的溶液。讀取刻度的方法與容量瓶和滴定管相同。（四）一般操作法1.溶液的混勻 樣品與試劑的混勻是保證化學(xué)反應(yīng)充分進(jìn)行的一種有效措施。為使反應(yīng)體系內(nèi)各物質(zhì)迅速地互相接觸，必須借助于外加的機(jī)械作用。混勻時(shí)須防止容器內(nèi)液體濺出或被污染，嚴(yán)禁用手指直接堵塞試管口或錐形瓶口振搖。溶液稀釋時(shí)也須混勻。混勻的方法通常有以下幾種： 攪動(dòng)混勻法：適用于燒杯內(nèi)溶液的混勻。如固體試劑的溶解和混勻。攪拌使用的玻璃棒必須兩頭都圓滑，棒的粗、細(xì)、長(zhǎng)、短必須與容器的大小和所配制的溶液的多少呈適當(dāng)?shù)?/p>

15、比例關(guān)系。攪拌時(shí)必須使攪棒沿著器壁運(yùn)動(dòng)，以免攪入空氣或使溶液濺出。傾入液體時(shí)必須沿著器壁慢慢傾入，以免產(chǎn)生大量氣體，傾倒表面張力低的液體更要緩慢仔細(xì)。研磨配制膠體溶液時(shí)，攪棒沿著研體的一個(gè)方向進(jìn)行，不要來回研磨。 旋轉(zhuǎn)混勻法：適用于錐形瓶；大試管內(nèi)溶液的混勻。手持容器使溶液作離心旋轉(zhuǎn)以手腕，肘或肩作軸旋轉(zhuǎn)。 指彈混勻法：適用于離心管或小試管內(nèi)溶液的混勻。左手持試管上端，用右手指輕輕彈動(dòng)試管下部，或用一只手的大拇指和食指持管的上端，用其余三個(gè)手指彈動(dòng)離心管，使管內(nèi)的液體作旋渦運(yùn)動(dòng) 振蕩混勻法：適用振蕩器使多個(gè)試管同時(shí)混勻，或試管置于試管架上，雙手持管架輕輕振蕩，達(dá)到混勻的目的。 倒轉(zhuǎn)混勻法：適用

16、于有塞量筒和容量瓶及試管內(nèi)容物的混勻。 吸量管混勻法：用吸量管將溶液反復(fù)吸放數(shù)次，使溶液混勻。 甩動(dòng)混勻法：右手持試管上都，輕輕甩動(dòng)振蕩即可混勻。 電磁攪拌混勻法：在電磁攪拌機(jī)上放上燒杯，在燒杯內(nèi)放入封閉于玻璃或塑料管中的小鐵棒，利用磁力使小鐵棒旋轉(zhuǎn)以達(dá)到混勻杯中液體的目的。適用于酸堿自動(dòng)滴定，pH梯度滴定等。2.過濾法 是分離沉淀和濾液的一種方法，可用于收集濾液，收集或洗滌沉淀?？捎寐┒芳盀V紙或吸濾法。操作時(shí)應(yīng)注意以下幾點(diǎn)： 制備血濾液等實(shí)驗(yàn)時(shí)，要用干濾紙而不能用水把濾紙先弄濕，因?yàn)闈駷V紙會(huì)影晌血液稀釋的體積。 折疊濾紙的角度應(yīng)與漏斗相合，使濾紙上緣能與漏斗壁完全吻合，不留縫隙。般采用平折法

17、（即對(duì)折后再對(duì)折）。 向漏斗中加溶液時(shí)，使其沿玻璃棒慢慢流下；玻璃棒不能在漏斗中攪動(dòng)。倒入速度不要太快，以防損失，不得使液面超過濾紙上緣。 較粗的過濾可用脫脂棉或紗布代替濾紙，有時(shí)也可用離心沉淀法代替過濾法。 3.加熱法 可直接用火（電爐）或水浴加熱，使用水浴時(shí)防止浴中容器傾倒。酒精燈使用注意：禁止頭碰頭點(diǎn)燃。用過后先用蓋子蓋一下，滅后再拿下重蓋，防止形成真空，蓋子打不開。加熱時(shí)管口不要對(duì)著人。加熱時(shí)管夾夾住試管的上l3部分，均勻加熱，再固定管底加熱。 4.烤干法 烤干試管時(shí)，應(yīng)將管口向下傾斜約成45角，由上往下，先烤管底，最后將管口的水份烤干?？靖蓵r(shí)須經(jīng)常移動(dòng)以免炸裂。試管等普通玻璃器材，也

18、可在烘箱內(nèi)烘烤干。三、實(shí)驗(yàn)樣品的制備在生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)中，無論分析組織中各種物質(zhì)的含量，或是探索組織中的物質(zhì)代謝過程，都需要利用預(yù)先處理過的特定生物樣品。掌握此種實(shí)驗(yàn)樣品的正確處理與制備方法是做好生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)的先決條件。在基礎(chǔ)生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)中，最常用的實(shí)驗(yàn)樣品是人或動(dòng)物的血、尿和組織等?，F(xiàn)將動(dòng)物或人的這些樣品制備的方法扼要介紹如下：（一）血液樣品收集動(dòng)物或人的血液樣品時(shí)應(yīng)使用清潔干燥的容器以防止溶血。1.全血 取出血液后，迅速盛于含有抗凝劑的試管內(nèi)，同時(shí)輕輕混勻，使血液和抗凝劑充分混勻，以免血液凝固。取得的全血如不立即進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，應(yīng)儲(chǔ)存于4冰箱中。常用的抗凝劑草酸鹽（12mg/ml全血）、檸檬酸鹽（5

19、mg/ml全血）、氟化鈉（510mg/ml全血）、肝素（0.010.2mg/ml全血）?？蓪⒖鼓齽┡涑蛇m度的水溶液，按需要量加入試管中，并涂布于試管壁，橫放烘干備用。2.血漿 將上述抗凝之全血在離心機(jī)中離心，白細(xì)胞下沉，上清液既為血漿。分離血漿時(shí)必須嚴(yán)格控制溶血，除采血時(shí)一切用具都需要清潔干燥外，取出之血液也不能劇烈振搖。3.血清 收集的血液不加抗凝劑，在室溫下約520分鐘即自行凝固，通常經(jīng)3小時(shí)，血塊收縮而分離出血清。血塊收縮后，應(yīng)及早分離出血清，一面溶血。若血塊粘著容器壁過緊，血清不易分離出來，可用細(xì)玻璃棒輕輕剝離，將血液離心，可分離的較快、較多。4.無蛋白血濾液 分析血液中某些成分時(shí)，為

20、了避免蛋白質(zhì)的干擾，需預(yù)先除去血中的蛋白質(zhì)成分。常用三氯醋酸、鎢酸或氫氧化鋅等沉淀劑與蛋白質(zhì)作用，然后用過濾或離心方法制成無蛋白血濾液。（二）尿液樣品一般定性實(shí)驗(yàn)樣品可以用隨時(shí)收集的新鮮尿液。定量測(cè)定尿液中各種成分時(shí)應(yīng)收集24小時(shí)的尿液，混合后再取樣。收集方法：一般在早晨一定時(shí)間排出殘余尿棄去，以后每次尿液收集于清潔大玻璃瓶中，到第二天同一時(shí)間收集最后一次尿即可。把收集地4小時(shí)尿液充分混合后用量筒量準(zhǔn)起總體積，然后取樣分析。收集的尿液不能立即進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，則應(yīng)置于冷處保存。必要時(shí)收集尿瓶中預(yù)先放入防腐劑，通常甲苯約10ml/L尿或濃硫酸10ml/L尿。收集實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的尿液時(shí)，可將動(dòng)物置于代謝籠中，按

21、以上方法通過籠下的漏斗收集動(dòng)物24小時(shí)的尿液。（三）組織樣品在生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)中，常常利用離體組織研究各種物質(zhì)代謝的突擊功能與酶系的作用，也可以從組織中提取各種代謝物質(zhì)或酶進(jìn)行研究。但生物組織離體過久，其所含物質(zhì)的含量和生物活性都將發(fā)生變化。因此，利用離體組織作為提取材料或代謝研究材料時(shí)應(yīng)在冰冷條件下迅速取出所需要的組織，并盡快進(jìn)行提取或測(cè)定。1. 組織糜 將組織用剪刀迅速剪碎，或用絞肉機(jī)絞成糜狀即可。2. 組織勻漿 向剪碎的新鮮組織中加入適量的冰冷的勻漿制備液，用高速電動(dòng)勻漿機(jī)或玻璃勻漿器制成勻漿。3. 組織浸出液 將上述制成的組織勻漿加以離心，其上清液即為組織浸出液。四、離心分離原理（一）原理

22、離心機(jī)是利用離心力把溶液中的粒子進(jìn)行分離的一種儀器。所謂離心力是指物體作圓周運(yùn)動(dòng)時(shí)形成的一種使物體脫離圓周運(yùn)動(dòng)中心的力。離心力的單位為g，即重力加速度（980.6cm/S2），離心力的大小可根據(jù)離心時(shí)的旋轉(zhuǎn)速度（r/min，每分鐘轉(zhuǎn)速）和物體離旋軸中心的距離r（cm）按下式計(jì)算：g=rV21.11810-5或按下式計(jì)算所需要的轉(zhuǎn)速V=（g89445）/r-2 制備離心幾乎包括兩種方法：一是分級(jí)離心法，另一種是密度梯度離心法。（二）分類1. 分級(jí)離心法：非均一的粒子懸浮液在離心機(jī)中離心時(shí)，各種粒子以各自的沉降速度移向離心管底部，逐步字底部形成一層沉淀物質(zhì)。這層沉淀物質(zhì)含有各種組分，但是最多的是那

23、些沉降得最快的組分。為了分出某一些特定的組分，通常需要進(jìn)行一系列離心。通常先選擇一個(gè)離心速度和離心時(shí)間，進(jìn)行第一次利息，使大部分不需要的大粒子沉降去掉。這時(shí)需要的組分大部分仍留在上清液內(nèi)。然后將收集到的上清液用更高的轉(zhuǎn)速離心，把需要的粒子沉積下來。離心時(shí)間要選擇得當(dāng)，使大部分不需要的小粒子仍留在上清液中。傾去上清液，再把沉淀懸浮起來，用較低轉(zhuǎn)速離心。如此反復(fù)直至達(dá)到所需純度。2. 密度梯度離心法密度梯度離心法具有很好的分辨能力?？赏瑫r(shí)使樣品中幾個(gè)或全部組分分離。將樣品粒子在一個(gè)密度梯度介質(zhì)中離心，這個(gè)介質(zhì)由一合適的小分子和樣品粒子可在其中懸浮的溶劑組成。離心時(shí)離軸心愈遠(yuǎn)介質(zhì)密度愈大。（三）電動(dòng)

24、離心機(jī)的使用方法 欲使沉淀和母液分開，過濾和離心都可達(dá)到目的，但當(dāng)沉淀粘稠，或顆粒過小能通過濾紙、總?cè)萘刻儆中枰繙y(cè)定時(shí)，使用離心沉淀法比過濾法要好。 使用方法： 1.應(yīng)先將離心機(jī)放在穩(wěn)定的臺(tái)面上，放平、放穩(wěn)，檢查離心機(jī)轉(zhuǎn)動(dòng)狀態(tài)是否平穩(wěn)，以確定離心機(jī)的性能。 2檢查套管與離心管大小是否相配，離心管應(yīng)能在套管內(nèi)自由轉(zhuǎn)動(dòng)不至太緊，套管軟墊（用棉花或橡皮）是否鋪好。套管底部是否有碎玻璃片或漏孔（玻璃片必須取出，漏孔經(jīng)修補(bǔ)好后才能使用）。 3檢查合格后，將一對(duì)離心管分別放入一對(duì)套管中，然后連同套管一起分別置粗天平兩側(cè)，使兩側(cè)的總重量平衡（包括離心管、離心套管、離心管內(nèi)裝溶液的重量的總和），用滴管向

25、較輕的一側(cè)離心管與套管之間加水，直至天平兩側(cè)彼此相等為止。將各對(duì)已平衡的套管連同內(nèi)容物放置于離心機(jī)內(nèi)，兩個(gè)等重的管必須放在對(duì)稱位置，嚴(yán)禁在對(duì)稱兩側(cè)離心管套中，僅一側(cè)放置離心管。離心時(shí)離心機(jī)內(nèi)不得留有離心管套。 4將離心管放要后，應(yīng)先蓋好離心機(jī)蓋，檢查所需電源電壓的大小，再按要求將電源接通。打通電源開關(guān)，逐步旋轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)速旋鈕，速度調(diào)節(jié)應(yīng)緩慢，增加離心機(jī)轉(zhuǎn)速直至所需的轉(zhuǎn)速。 5離心機(jī)轉(zhuǎn)動(dòng)時(shí)，如果機(jī)身不穩(wěn)或聲音不均勻時(shí)，應(yīng)立即停止離心，重新檢查重量是否對(duì)稱和離心機(jī)是否放平穩(wěn)。離心時(shí)，玻璃管、套管打碎應(yīng)立即清除，重新配平后再離心。 6離心達(dá)規(guī)定時(shí)間后，將轉(zhuǎn)速旋鈕逐步回轉(zhuǎn)到零。再關(guān)閉電源。不可以用手強(qiáng)制使其

26、停止轉(zhuǎn)動(dòng)，因這樣既損傷離心機(jī)，同時(shí)沉淀又可能被攪動(dòng)浮起，待離心機(jī)停穩(wěn)后，取出離心管及管套，最后將電源插頭撥下。注意事項(xiàng)：在配平時(shí)，勿使離心管套外部沾水，否則會(huì)影響結(jié)果。五、電泳原理（一）電泳的基本原理 帶電荷的質(zhì)點(diǎn)，在一定條件的電場(chǎng)作用下，可向一極移動(dòng)，如帶電荷的質(zhì)點(diǎn)移向負(fù)極，這種現(xiàn)象稱為電泳。許多生物分孑都帶有電荷，其電荷多少取決于分孑性質(zhì)及其所合在介質(zhì)的pH和組戍，由于混合物中各組分所帶電荷性質(zhì)、電荷數(shù)量以及分子量、顆粒形狀的不同，在同一電場(chǎng)的作用下，各組分泳動(dòng)的方向和速度也各異，因此，在一定時(shí)間內(nèi)，由于各組分移動(dòng)距離的不同，而達(dá)到分離鑒定各組分的目的。 設(shè)一帶電分子在電場(chǎng)中所受的力為F，

27、F的大小取決于質(zhì)點(diǎn)所帶電荷Q和電場(chǎng)強(qiáng)度X，即FQX根據(jù)Stoke氏定律，一球形的分子運(yùn)動(dòng)時(shí)受的阻力F與分子運(yùn)動(dòng)的速度V、分子的半徑r、介質(zhì)的粘度的關(guān)系為 F6r 當(dāng)F=F時(shí)，即達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡時(shí)： Qx=6r移項(xiàng)得vxQ6r (1) 當(dāng)vx表示帶電分子在單位電場(chǎng)強(qiáng)度下運(yùn)劫速度，移為遷移率，也稱為電泳速度，以v表示，即vvxQ6r （2） 由式（2）可見，一個(gè)帶電分子的遷移率不僅取訣于其本身所帶的電荷，而且還與電場(chǎng)強(qiáng)度介質(zhì)的pH、禹子強(qiáng)度、粘度、電滲等因素有關(guān)。在具體實(shí)驗(yàn)中，移動(dòng)速度v為單位時(shí)內(nèi)t（以秒計(jì)）內(nèi)移動(dòng)的距離d（以cm計(jì)），即 Vd/t 又電場(chǎng)強(qiáng)度為單位距離I（以cm計(jì)）內(nèi)電勢(shì)差E（以伏待

28、計(jì)），即以vdt，XEI代入（2）式即得v=vx=（dt）（E/I）dIEt 故遷移率的單位為cm2.秒1伏待1。 物質(zhì)（A）在電場(chǎng)中移動(dòng)的距離為：dAVA EtI 物質(zhì)（B）在電場(chǎng)中移動(dòng)的距離為：dB=VBEt/I 兩物質(zhì)移動(dòng)的距離之差為ddA-dB（VA-VB）Et （3） （3）式表明物質(zhì)A、B能否分離取訣于兩者的迂移率，如相同則不能分離；如有差別則能分離。實(shí)驗(yàn)所選擇的條件如電壓和電泳時(shí)間與兩物質(zhì)的分離成正比；電場(chǎng)距離如濾紙與離距離成反比。 （二）影響電泳的主要因素 1.電泳介質(zhì)的pH當(dāng)介質(zhì)等于其兩性物質(zhì)的等電點(diǎn)時(shí)，該物質(zhì)處于等電狀態(tài)即不向正極或負(fù)極移動(dòng)。當(dāng)保質(zhì)pH小于其等電點(diǎn)時(shí)，則呈正

29、離子狀態(tài)移向負(fù)極；反之，介質(zhì)pH大于其等電點(diǎn)時(shí)，則呈負(fù)離孑狀態(tài)，移向正極。因此，任何一種兩性物質(zhì)均受介質(zhì)pH的影晌，即訣定兩性物質(zhì)的帶電狀態(tài)及其量，為了倮持介質(zhì)pH的穩(wěn)定性，常用一定pH的緩沖液。 2.緩沖液的離子強(qiáng)度 離子強(qiáng)度對(duì)電泳的影響是：離子強(qiáng)度低，電泳速度快，分離區(qū)帶不易清晰；離子強(qiáng)度高，電泳速度慢，但區(qū)帶分離清晰，如離子強(qiáng)度低，緩沖液的緩沖量小，不易維持pH的恒定；離子強(qiáng)度過高，則降低蛋白質(zhì)的帶電量（壓縮雙電層）使電泳速度減慢。所以常用離子強(qiáng)度為0020.2之間。 溶液離子強(qiáng)度的計(jì)算Il2CiZi2 I表示離子強(qiáng)度Ci為克分子濃度（指離子而言）Zi表示離子的價(jià)數(shù)。 3.電場(chǎng)強(qiáng)度 電場(chǎng)

30、強(qiáng)度和電泳速度成正比關(guān)系。電場(chǎng)強(qiáng)度以每厘米的電勢(shì)差計(jì)算，也稱電勢(shì)梯度。電場(chǎng)強(qiáng)度越高，則帶電粒子的移動(dòng)越快。電壓增加，相應(yīng)電流也增大，電流過大時(shí)易產(chǎn)生熱效應(yīng)可使蛋白變性而不能分離。 4.電滲作用 在電場(chǎng)中液體對(duì)于固體支持物的相對(duì)移動(dòng)，稱為電滲。如濾紙中含有表面帶負(fù)電荷的羧基，溶液則向負(fù)極移動(dòng)。由于電滲現(xiàn)象與電泳同時(shí)存在，所以電泳的粒子移動(dòng)距離也受電滲影響。如果紙上電泳蛋白移動(dòng)的方向與電滲現(xiàn)象相反，則實(shí)際上蛋白泳動(dòng)的距離，等于電泳移動(dòng)距離減去電滲距離。如果電泳方向和電滲方向一致，其蛋白質(zhì)移動(dòng)距禹等于二者相加。電滲現(xiàn)象所適成的移動(dòng)距離可用不帶電的有色染料或有色葡聚糈點(diǎn)在支持物的中問。觀察電滲方向和距

31、離。4. 其它因素例如濾紙、緩沖溶液的粘度以及電泳時(shí)的溫度變化等因素也都影響泳動(dòng)速度。 （三）區(qū)帶電泳分類 按支持物物理性狀不同，可分為： l濾紙及其他纖維素膜。如乙酸纖維素膜，玻璃纖維膜、聚胺纖維膜電泳。 2粉末電泳如纖維素粉、淀粉、玻璃粉電泳o 3凝膠電泳如瓊脂糖、硅膠、淀粉膠、聚丙烯酰胺電泳。 4.絲線電泳知尼龍絲、人造絲電泳 按支持物的裝置形式不同，可分為： I平板式電泳，支持物水平置，是最常見的電泳方式。 2垂直板式電泳。 3連緩一流動(dòng)電泳，首先應(yīng)用于紙電泳將濾紙垂直豎立，兩邊各放一電極，緩沖液和樣品白頂端下流，與電泳方向垂直。可分離較大量的蛋白質(zhì)，以后有用淀粉、纖維素粉、玻璃粉等代

32、替濾紙，分離效果更好。 按pH的連續(xù)性不同，可分為： l.連續(xù)pH電泳 電泳的全部過程中緩沖液的pH保持不變，如紙電泳、乙酸纖維膜電泳。 2非連續(xù)pH電泳 緩沖液和支持物間有不同的pH，如聚丙烯酰胺凝膠圓盤電泳、等電聚焦電泳，等速電泳等，能使分離物質(zhì)的區(qū)帶更加清晰，并可對(duì)極微量物質(zhì)（ng即109g）迸行分離。 （四）電泳技術(shù)的應(yīng)用。 電泳技術(shù)是目前醫(yī)學(xué)研究的重要手段。它可分離各種有機(jī)物（氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、酶、酯類、核苷、核酸等）和無機(jī)鹽。并可用于某種物質(zhì)的純度及分子量的測(cè)定。電泳技術(shù)與層析技術(shù)結(jié)合和指紋圖可用于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的分析?，F(xiàn)免疫結(jié)合的免疫電泳，提高了對(duì)蛋白質(zhì)的鑒別能力。與酶方法結(jié)合發(fā)

33、現(xiàn)了同功酶。電泳技術(shù)是目前應(yīng)用極廣的分離物質(zhì)的一種很好方法。也是醫(yī)學(xué)科學(xué)中的重要研究技術(shù)。六、分光分析原理分光分析原理許多物質(zhì)的溶液是具有顏色的，如高錳酸鉀顯紫紅色，硫酸銅溶液顯藍(lán)色，這些溶液的顏色深淺是和溶液的濃度有關(guān)。在一定濃度范圍內(nèi)溶液的濃度越大，表現(xiàn)為溶液的顏色越深，因此，可以用比較溶液顏色的深淺來測(cè)定所含有色物質(zhì)的含量，這種方法稱力比色分析法，簡(jiǎn)稱比色法。光是一種電磁波，具有一定的波長(zhǎng)范圍。波長(zhǎng)在400700nm范圈內(nèi)的電磁波為可見光。自然界的白光是一種混合的光，是由七種顏色的光按一定的比例混合而成的；知果把兩種適當(dāng)?shù)墓獍匆欢ǖ膹?qiáng)度比例混合也可得到白光，這兩種顏色就叫互補(bǔ)色。溶液對(duì)可

34、見光區(qū)的各色光幾乎都吸收，則溶液呈黑色。如果溶液對(duì)各種不同波長(zhǎng)的可見光有不同的吸收能力，則溶液呈現(xiàn)出被它吸收色光的補(bǔ)色。例如：白色光照射KmnO4溶液，溶液將其中的綠色光大部分吸收，而其它各色光透過溶液，通過溶液的光除紫色外其它顏色的光都兩兩互補(bǔ)成白色光，所以看到的是透過高錳酸鉀溶液的紫色。從上面可知，有色溶液顯現(xiàn)的顏色實(shí)質(zhì)上是它所選擇吸收光的互補(bǔ)色。（一）比色法 主要有目視比色法、光電比色法和分光光度法。它們的基本原理是相同的。光電比色法，分光光度法被用來測(cè)定溶液中存在的光吸收物質(zhì)的濃度，其理論依據(jù)是Lambert和Beer定律。 1.Lambert定律當(dāng)一束平行單色光通過有色溶液時(shí)，光的一

35、部分被溶液吸收，一部分透過，使光的強(qiáng)度減弱，若溶液的濃度不變，則溶液的厚度愈大，光線強(qiáng)度的減弱也愈顯著。若I0表示入射光的強(qiáng)度，I表示光線透過溶液后的強(qiáng)度，L表示溶液的厚度。 則一dIdII dIdIaI或dIIa.dI IoIdII=-aIoIdI ln（II0）-aI 所以ln I0I= aI或II0eaI 或lgI0IK1e（K1e=a2303）（II010Kie） K1是一常數(shù)，受光線波長(zhǎng)，溶液性質(zhì)和溶液濃度影響。從上述公式可知，透過溶液后光線I0強(qiáng)度的減弱（II0）與溶液厚度L呈指數(shù)函數(shù)關(guān)系。 2.Beer定律當(dāng)一束單色光通過一溶液時(shí)，若溶液的厚度不變，則溶液濃度愈高光線強(qiáng)度的減弱也

36、愈顯著，與Lambert定律推導(dǎo)相似；兩者的關(guān)系可表示如下： lgI0Ik2C或II0 =10K2C 其中，C表示溶液的濃度，K2是一常數(shù)，受光線波長(zhǎng)，溶液性質(zhì)和溶液厚度的影響。上式公式所表示的光線強(qiáng)度與溶液濃度的關(guān)系稱為Beer定律。 然所有的溶液均符合Lambert定律，但并非所有的溶液都符合Beer定律，這是由于有些物質(zhì)在不同濃度條件下其顏色可能發(fā)生改變，即在不同濃度條件下其吸收光的波長(zhǎng)發(fā)生改變。 3.LambertBeer定律及應(yīng)用 IgII0-KCL 如果將通過溶液后的光線強(qiáng)度（I）和入射光I0的比值稱為透光度（T），將-lgII0用光密度（A）表示，則它們之間的關(guān)系為： A-lgI

37、I0-lgT=KCL （1） 其中K為常數(shù)，稱為消光系數(shù)（E），表示物質(zhì)對(duì)光線吸收的本領(lǐng)，受物質(zhì)種類和光線波長(zhǎng)的決定.從公式（l）可知，對(duì)于相同物質(zhì)和相同波長(zhǎng)的單色光（消光系數(shù)不變）來說，溶液的光密度和溶液的濃度呈正比。 A1/A2=C1/C2或?qū)懽鰿1A1A.C2 （2）如果C2為標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，則可根據(jù)光密度值，按公式（2）求得待測(cè)液的濃度。（二）光電比色計(jì)和分光光度計(jì)的基本結(jié)構(gòu)。 不論光度計(jì)、比色計(jì)還是分光光度計(jì)，其基本結(jié)構(gòu)原理是相似的，都由光源、單色光器、狹縫、比色杯和檢測(cè)器系統(tǒng)等部分組成。 1.光源 一個(gè)良好的光源要求具備發(fā)光強(qiáng)度高，光亮穩(wěn)定，光譜范圍較寬和使用壽命長(zhǎng)等特點(diǎn)。一般的光

38、度計(jì)采用穩(wěn)控的鎢燈，適用子340900nm范圍的光源，更先進(jìn)的分光光度計(jì)外中有穩(wěn)壓調(diào)控的氫燈，適宜于作200360nm的紫外分光分析光源。 2.單色光器單色光器的作用在于根據(jù)需要選擇一定波長(zhǎng)的單色光。所謂單色光是指某特定波長(zhǎng)有最大發(fā)射，而在相鄰較長(zhǎng)和較短波長(zhǎng)的發(fā)射能量較少而言。最簡(jiǎn)單的單色光器是光電比色上所采用的濾光片（一定顏色的玻璃片），由于通過光線光譜范圍較寬，所以光電比色分辨效果較差。棱鏡和光柵是較好的單色光器，它們能在較寬光譜范圍內(nèi)分離出相對(duì)純的光線，因此分光光度計(jì)有較高的分辨效果。 3.狹縫通過單色光器的發(fā)射強(qiáng)度可能過強(qiáng)，也可能過弱，不適于檢測(cè)。狹縫是由一對(duì)隔板在光起路上形成的縫隙，

39、通過調(diào)節(jié)縫隙的大小來調(diào)節(jié)入射單色光的強(qiáng)度使入射光形成平行光線，以適應(yīng)檢測(cè)器的需要。光電比色計(jì)的狹縫是固定的，而光度計(jì)和分光光度計(jì)的縫隙大小是可調(diào)的。 4.比色杯又叫吸收杯、樣品杯。是光度測(cè)量系統(tǒng)中最重要的部件之一，在可見光范圍內(nèi)測(cè)量時(shí)選用光學(xué)玻璃比色杯，在紫外線范圍內(nèi)測(cè)量時(shí)要選用石英比色杯。保護(hù)比色杯的質(zhì)量是取得良好的分析結(jié)果的重要條件之一，不得用粗糙堅(jiān)硬物質(zhì)接觸比色杯，不能用手指拿取比色杯的光學(xué)面，用后要及時(shí)洗滌比色杯，不得殘留測(cè)定液。 5.檢測(cè)器系統(tǒng)硒光電池、光電管或光電倍增管等光電元件常用來作為受光器，將通過比色杯的光線能量轉(zhuǎn)變成電能。進(jìn)一步再用適量的方法測(cè)量所產(chǎn)生的電能。光電比色計(jì)用硒

40、光電池作為受光器，其光敏感性低，不能檢出強(qiáng)度非常弱的光線，對(duì)波長(zhǎng)在270nm以下和700nm以上的光線不敏感。較精密的分光光度計(jì)都采用真空光電管或光電倍增管作為受光器，并應(yīng)用放大裝置以提高敏感度，雖然光譜范圍狹窄的單色光的能量比范圍寬的弱得多，但這種有放大線路的靈敏檢流系統(tǒng)仍可準(zhǔn)確的將其檢測(cè)出來。（三）幾種常用國(guó)產(chǎn)光電比色計(jì)和分光光度計(jì) 1.721型分光光度計(jì)光譜范圍在360800nm，所有部件均在一主機(jī)內(nèi)，操仵方便，靈敏度高。原理：以12伏25瓦白灼鎢燈為光源，經(jīng)透鏡聚光后射入單色光器內(nèi)，經(jīng)棱鏡色散反射到準(zhǔn)直鏡，穿狹縫得到，波長(zhǎng)范圍更窄的光波作為入射光進(jìn)入比色皿，透出的光波被受光器光電管所接

41、受，產(chǎn)生光電流，再經(jīng)放大在微安表上反映出電流大小，并直接讀出光密度。使用方法如下： 靈敏度選擇鈕放在“l(fā)”（如調(diào)不到“0”的選用較高檔）。 轉(zhuǎn)動(dòng)波長(zhǎng)旋鈕，選用所需波長(zhǎng)。 接通電源，打開電源開關(guān)，將儀器預(yù)熱。 打開吸收杯暗箱蓋（光門檔板自動(dòng)遮住光路），轉(zhuǎn)動(dòng)零點(diǎn)謂節(jié)旋鈕，使電流指針圓復(fù)到透光度“0”。 將吸收杯放入杯架中，使空白杯對(duì)向光路，蓋好吸收杯暗蓋，轉(zhuǎn)動(dòng)“100%電位器”，調(diào)準(zhǔn)電表指針使之指向透光度100位置上。若空白杯液對(duì)光吸收能力過強(qiáng)，儀器靈敏度不夠不能調(diào)到100時(shí)，可將“100%電位鈕”向回旋再將靈敏度選擇開關(guān)拔到較高檔（25檔）。 將標(biāo)椎液及測(cè)定的吸收杯依次推入光道，即可自電流計(jì)直接

42、讀出其光密度值。 用完畢后，將開關(guān)放回“關(guān)”的位置，切斷電源，并將吸收杯取出，用蒸餾水充分洗干凈。 注意事項(xiàng)a分光光度計(jì)屬精密儀器，應(yīng)糈心愛護(hù)使用。防震、防潮、防腐蝕。b要保持吸收杯的清浩干凈，保護(hù)光學(xué)面的透明度。 c讀取光密度值的時(shí)間應(yīng)盡量縮短，以防光電系統(tǒng)疲勞，如連續(xù)使用時(shí)，中間應(yīng)適當(dāng)使之避光體息。 d比色杯不要放置在儀器面上，以免液體腐蝕儀器表面。 e調(diào)0位及100旋鈕要輕旋，旋到終點(diǎn)時(shí)指針仍未指到位，一定不能再用力旋，以免損壞電位器。2.722型分光光度計(jì)722型分光光度計(jì)是將光電管和微電流放大器同裝在一密閉暗盒內(nèi)，光信號(hào)由光電管接受后通過高值電阻轉(zhuǎn)換成微弱的信號(hào)，再經(jīng)微電流放大器加以

43、放大后，在數(shù)字顯示器上讀出。操作方法如下： 將儀器的電源開關(guān)接通，打開樣品室蓋，選擇所需用的單色波長(zhǎng)。靈敏度選擇在“1”檔，調(diào)節(jié)“0T”旋鈕，使數(shù)字顯示為“000”，然后將樣品室蓋合上。 將裝有溶液的比色皿置于比色架中，蓋上樣品室蓋，將蒸餾水校正或空白對(duì)照管置于光路，調(diào)節(jié)透過率“100T”旋鈕，使數(shù)字顯示為100.0T”。儀器預(yù)熱15分鐘。注意：如果顯示不到100.0T，請(qǐng)調(diào)節(jié)靈敏度檔。調(diào)節(jié)原則是保證空白檔良好。調(diào)到“100%T”情況，盡可能采用靈敏度較低檔，這樣儀器具有更高的穩(wěn)定性。特別指出的是：改變靈敏度后應(yīng)按重新調(diào)節(jié)“0T”旋鈕，使數(shù)字顯示為“000”和透光度為100T”。 將選擇開關(guān)置

44、于A，旋動(dòng)吸光度調(diào)零旋鈕，使數(shù)字顯示為“000”，然后移入被測(cè)溶液，顯示值即為試樣的吸光度A值。 濃度C的測(cè)量：將選擇開關(guān)旋至C，將已標(biāo)定濃度的溶液移入光路，調(diào)節(jié)濃庋旋鈕，使數(shù)字顯示為標(biāo)定值。將被測(cè)溶液移入光路，即可讀出相應(yīng)的濃度值。 測(cè)畢，打開樣品室蓋，關(guān)電源，將各旋鈕停在起始位置上，沖洗比色杯。 注意：如果需大幅度改變波長(zhǎng)時(shí)，需等數(shù)分鐘才能正常工作，（因波長(zhǎng)由長(zhǎng)波向短波或短波向長(zhǎng)波移動(dòng)時(shí)，光能量變化急劇，光電管響應(yīng)緩慢，需一段光響應(yīng)平衡時(shí)間，使數(shù)字顯示穩(wěn)定后，重新進(jìn)行“”和“”。在實(shí)際應(yīng)用中常使用的待測(cè)介質(zhì)顏色所對(duì)應(yīng)的應(yīng)使用的波長(zhǎng)表選擇波長(zhǎng)（nm）波長(zhǎng)對(duì)應(yīng)顏色待測(cè)介質(zhì)顏色400-435青紫

45、黃綠435-480藍(lán)黃480-490藍(lán)綠桔黃490-500綠藍(lán)紅500-560暗綠深紫560-580綠黃藍(lán)紫580-595黃藍(lán)595-610桔黃藍(lán)綠610-750紅綠藍(lán)3.UV-756MC紫外可見分光光度計(jì)使用（1）接通電源，打開電源開關(guān)（關(guān)好暗箱蓋），儀器顯示“756”并進(jìn)行自檢和初始化，整個(gè)過程約需要10分鐘，結(jié)束后顯示“220”，DATA顯示“0.000”。2.按下“MODE”鍵，顯示“2”，然后按下“ENTER”鍵，顯示“220”。3.按下“GOTO”鍵，用數(shù)字鍵輸入所需波長(zhǎng)，顯示所輸入數(shù)值，按下“ENTER”鍵，等待出現(xiàn)所選擇波長(zhǎng)，DATA顯示“0.000”。4.按順序?qū)⒖瞻妆?、?biāo)準(zhǔn)

46、杯、測(cè)定杯置于比色槽中，將空白杯對(duì)向光路，Cell面板顯示“R”位置（注意，比色杯中液體不得超過杯高的3/4）。5. 按“A/T”鍵，再“2”，按下“ENTER”，再按下“ABSO/100%T”鍵，ABSO/位顯示“0.000”。6.按下START/STOP鍵，將標(biāo)準(zhǔn)杯、測(cè)定杯分別對(duì)向光路，CELL顯示“S”，DATA顯示測(cè)定的A值。7.記錄或打印數(shù)據(jù)。8.按下START/STOP鍵，關(guān)閉電源。七、層析分析原理層析法又稱色譜法，色層法和層離法（Chromatography），是廣泛應(yīng)用的一種生物化學(xué)技術(shù)，層析法是利用混合物各組分物理化學(xué)性質(zhì)（如溶解度、吸附能力、電荷和分子量等）的差別，使各組分

47、在支持物上集中分布在不同區(qū)域；借此將各組分分離。層析利用兩個(gè)相，一個(gè)相稱為固定相；另一個(gè)相稱為流動(dòng)相。由于各組分受固定相的阻力和受流動(dòng)相的推力影響不同，各組分移動(dòng)速度各異，從而使各組得到分離。層析法有多種類型，液體作為流動(dòng)相的稱為液相層析，氣體作為流動(dòng)相稱為氣相層析。按層析過程的機(jī)理不同，層析法可以分為下列幾種類型： l.吸附層析 利用吸附劑表面對(duì)不同物質(zhì)吸附性能的差異進(jìn)行分離。 2.分配層析 利用不同物質(zhì)在流動(dòng)相和固定之間的分配系數(shù)和溶解度不同，使物質(zhì)分離。 3.離子交換層析 利用不同物質(zhì)對(duì)離子交換劑親和力不同分離。 4.凝膠層析 利用某些凝膠對(duì)不同分子量的物質(zhì)阻滯作用不同進(jìn)行分離，亦稱分子

48、篩層析。 5.親和層析利用某些蛋白質(zhì)能與配體分子特異而非共價(jià)地結(jié)合進(jìn)行分離。層析法采用的方式主要是柱層和薄層層析，前者將固定相或載體裝入柱內(nèi)，使被分離物質(zhì)沿一個(gè)方向移動(dòng)而達(dá)到分離。后者將吸附劑涂成薄層，使樣品在薄層上進(jìn)行分離。（）吸附層析（absorption chromatography）氧化鋁、硅膠等物質(zhì)具有吸附其它一些物質(zhì)的性質(zhì)，而且對(duì)各種被吸附物質(zhì)的吸附能力不同。吸附力的強(qiáng)弱，除與吸附劑本身的性質(zhì)有關(guān)外，也與被附物質(zhì)的性質(zhì)有關(guān)。l、柱層析法柱層析是用一根玻璃管，管內(nèi)加吸附劑粉末，用溶解劑濕潤(rùn)后，即成為吸附柱。然后在柱頂部加入要分離的樣品溶液，假如樣品內(nèi)含兩種成分A與B，則三者被吸附在柱

49、上端，形成色譜。樣品溶液全部流入吸附柱之后，加入合適的溶劑洗脫，A與B也就隨著溶劑向下流動(dòng)而移動(dòng)，最后達(dá)到分離。在洗脫過程中，管內(nèi)連續(xù)發(fā)生溶解、吸附、再溶解、再吸附的現(xiàn)象。例如，被吸附的A粒子被溶解隨溶劑下移，但遇新的吸附劑，又將A吸附，隨后，新溶劑又使A溶解下移，由于溶劑與吸附劑對(duì)A與B的溶解力與被吸附力不完全相同，A與B移動(dòng)的距離也不同。連續(xù)加入溶劑，連續(xù)分段收集洗脫液，各成分即可順序洗出。最常用的吸附劑是硅膠和氧化鋁，硅膠的吸附能力和含水量關(guān)系極大，硅膠吸水后，吸附能力下降。甘油酯、磷脂、膽固醇等非極性的與極性不強(qiáng)的有機(jī)物用這種方法分離效果較好。2.薄層層析法 薄層層析法是將吸附劑在玻璃

50、板上或其它薄膜上均勻地鋪成薄層，把要分析的樣品加到薄層上，然后用合適的溶劑展開，而達(dá)到分離鑒定的目的。優(yōu)點(diǎn)是設(shè)備簡(jiǎn)單，操作容易，層析展開時(shí)間短，分離效率高，并可采用腐蝕性顯色劑，而且可以在高溫下顯色。 （二）分配層析（partition chromatography）溶質(zhì)在兩種不相混的溶劑中溶解分配是逐步達(dá)到平衡的，平衡后，溶質(zhì)在兩種溶劑中的濃度取決于分配系數(shù)（a）a=SXOX在溶劑1中的濃度X在溶劑2中的濃度，分配層析即是利用物質(zhì)在兩種溶劑中的分配平衡。溶劑之一通常是水，它是保持在圈定的支持相之中（用淀粉、纖維素粉、濾紙等惰性材料制成），另一溶劑是移動(dòng)相，由以水飽和過的有機(jī)溶劑組成，被分離的

51、物質(zhì)，如果彼此之間分配系數(shù)相差較大，就容易被分離開來。 （三）離子交換層析（iOn-exchange chromatography）離子交換層析，是利用離子交換劑上的可交換離子與周圍介質(zhì)中被分離的各離子的親和力的不同，經(jīng)過交換平衡達(dá)到一種柱層析法。目前大多數(shù)采用合成的離子交換劑，例知：以苯乙烯與二乙烯交聯(lián)聚合的樹脂為母體的離子交換樹脂對(duì)分離小分子物質(zhì)（如氨基酸，核苷，核苷酸等）是理想的。但對(duì)大分子物質(zhì)（如蛋白質(zhì)）是不適當(dāng)?shù)?。因?yàn)樗荒軘U(kuò)散到樹脂的鏈狀結(jié)構(gòu)中，所以分離大分子物質(zhì)常選用葡聚凝膠進(jìn)行分子篩層析。（四）凝膠層析（gelchromatography）凝膠層析即分子篩層析，是選用孔徑大小一

52、定的凝膠，將混合液中的小分子物質(zhì)“篩”開來的一種分離方法。當(dāng)一混合的蛋白質(zhì)溶液通過凝膠柱時(shí)，分子直徑小于凝膠孔隙的可以進(jìn)入膠粒內(nèi)部，分子直徑大于孔隙的不能進(jìn)入。因此，小分子蛋白質(zhì)在前進(jìn)路上通過膠粒時(shí)遇到的阻力大，所以流速慢。相反地，大分子蛋白質(zhì)不會(huì)進(jìn)入膠粒內(nèi)部，可以比較順利地通過膠粒的空隙而流出，所以阻力小，流速快。由于流速不同，就可以把分子大小不同的蛋白質(zhì)分開，因?yàn)槟z具有這種性能，所以把它稱為“分子篩”。凝膠顆粒是多孔性的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，凝膠作為一種層析介質(zhì)，它是不帶電荷的物質(zhì)，在層析時(shí)一般不換洗脫液，只是一種濾過仵用。故又稱為凝膠過濾。用于生物材料分離的凝膠主要有以下幾類：交聯(lián)萄聚糖（Ssph

53、adex），聚丙烯酰胺膠（BioGel），瓊脂糖凝膠（Sepharose）和交聯(lián)瓊脂糖（Sepharose CI）。 （五）親和層析（aff1nity Chromatography）親和層析法是分離蛋白質(zhì)的一種極為有效的方法。它經(jīng)常只需經(jīng)過一種處理即可使某種待提純的蛋白質(zhì)從很復(fù)雜的蛋白質(zhì)混合物中分離出來，并且純度很高。這種方法是根據(jù)某些蛋白質(zhì)具有的生物學(xué)性質(zhì)，與另一種稱為配體的分子能特異而非共價(jià)地結(jié)合，如某些酶可以通過其共價(jià)鍵與其特異的輔酶牢固結(jié)合。親合層析的基本原理是：先把待提純的某一蛋白的配體，通過適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)反應(yīng)共價(jià)地連接到象瓊脂一類的多糖顆粒表面的功能團(tuán)上，構(gòu)成層析體。這種多糖材料在性能方面允許其它蛋由質(zhì)白由通過。但能與配體結(jié)合的蛋白質(zhì)則保留在柱內(nèi)，然后改變洗脫條件，使蛋白質(zhì)和配體分離，即可將蛋白質(zhì)純化。八、實(shí)驗(yàn)室規(guī)則（一） 保持實(shí)驗(yàn)室安靜，認(rèn)真仔細(xì)地按實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。（二） 穿戴好實(shí)驗(yàn)服。保持實(shí)驗(yàn)臺(tái)的清潔整齊。（三） 愛護(hù)儀器，謹(jǐn)慎使用。節(jié)約使用藥品試劑，蒸餾水，自來水，煤氣和電。（四） 不得將高溫、強(qiáng)酸強(qiáng)堿、有毒污垢物品拋灑在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上。（五） 公用物品用畢放回原處，不得私自占有。（六） 取完試劑應(yīng)將瓶蓋蓋好，切勿錯(cuò)蓋，用畢放回原處。（七） 加熱、用電，使用劇毒腐蝕試劑應(yīng)注意安全操作，避免事故。（八） 廢棄液體除指定有專門容器收集者外，應(yīng)倒入水池，并放水沖走，