酵母基因工程ppt課件

1、第十五章 酵母基因工程,五、 酵母菌的表達系統(tǒng),第十五章 酵母基因工程,三、 酵母菌的載體系統(tǒng),二、 酵母菌的宿主系統(tǒng),一、 酵母菌作為表達外源基因受體菌的特征,六、 利用重組酵母生產乙肝疫苗,四、 酵母菌的轉化系統(tǒng),一、 酵母菌作為表達外源基因受體菌的特征,第十五章 酵母基因工程,1、 酵母菌的分類學特征,酵母菌（Yeast）是一群以芽殖或裂殖方式進行無性繁殖的單細胞真核生物，分屬于子囊菌綱（子囊酵母菌）、擔子菌綱（擔子酵母菌）、半知菌類（半知酵母菌），共由56個屬和500多個種組成。如果說大腸桿菌是外源基因最成熟的原核生物表達系統(tǒng)，則酵母菌是最成熟的真核生物表達系統(tǒng),一、 酵母菌作為表達外

2、源基因受體菌的特征,2、酵母菌表達外源基因的優(yōu)勢,全基因組測序，基因表達調控機理比較清楚，遺傳操作簡便,能將外源基因表達產物分泌至培養(yǎng)基中,具有原核細菌無法比擬的真核蛋白翻譯后加工系統(tǒng),大規(guī)模發(fā)酵歷史悠久、技術成熟、工藝簡單、成本低廉,不含有特異性的病毒、不產內毒素，美國FDA認定為安全的,基因工程受體系統(tǒng)（Generally Recognized As Safe GRAS,酵母菌是最簡單的真核模式生物,第十五章 酵母基因工程,二、 酵母菌的宿主系統(tǒng),2、提高重組蛋白表達產率的突變宿主菌,3、抑制超糖基化作用的突變宿主菌,4、減少泛素依賴型蛋白降解作用的突變宿主菌,1、廣泛用于外源基因表達的酵

3、母宿主菌,第十五章 酵母基因工程,1、廣泛用于外源基因表達的酵母宿主菌,目前已廣泛用于外源基因表達和研究的酵母菌包括,酵母屬 如釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae,克魯維酵母屬 如乳酸克魯維酵母（Kluyveromyces lactis,畢赤酵母屬 如巴斯德畢赤酵母（Pichia pastoris,裂殖酵母屬 如非洲酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe,漢遜酵母屬 如多態(tài)漢遜酵母（Hansenula polymorpha,其中釀酒酵母的遺傳學和分子生物學研究最為詳盡，但巴斯德畢赤酵母,表達外源基因最理想,2、提高重組蛋白表達產率的突變宿主菌,能

4、導致釀酒酵母中重組蛋白產量提高或質量改善的突變類型,ssc1 改善重組蛋白分泌 鈣離子依賴型的ATP酶,ssc2 提高重組蛋白表達 轉錄后加工,rgr1 提高重組蛋白表達 轉錄水平,ose1 提高重組蛋白表達 轉錄水平,ssc11 改善重組蛋白分泌 羧肽酶Y,rho- 提高重組蛋白表達 轉錄水平,突變類型,生物效應,作用位點,3、抑制超糖基化作用的突變宿主菌,能抑制超糖基化的突變類型,mnn 甘露糖生物合成缺陷型,alg 天門冬酰胺側鏈糖基化缺陷型,och 外側糖鏈添加缺陷型,突變類型,生物效應,許多真核生物的蛋白質在其天門冬酰胺側鏈上接有寡糖基團,它們常常影響蛋白質的生物活性。整個糖單位由糖

5、基核心和外側糖,鏈兩部分組成,酵母菌普遍擁有蛋白,質的糖基化系統(tǒng)，但野生,型釀酒酵母對異源蛋白的,糖基化反應很難控制，呈,超糖基化傾向，因此超糖,基化缺陷株非常重要,4、減少泛素依賴型蛋白降解作用的突變宿主菌,1）泛素、介導的蛋白質降解作用,蛋白酶體,Lys,Ubiquitin 76 aa,ubiquitin ligase E3,Lys,ubiquitin ligase E3,Lys,靶蛋白,靶蛋白,靶蛋白,2）酵母菌泛素依賴型蛋白降解系統(tǒng)的編碼基因,酵母菌共有四個泛素編碼基因,UBI 1 編碼泛素-羧基延伸蛋白52（CEP52） 對數生長期表達 穩(wěn)定期關閉,UBI 2 編碼泛素-羧基延伸蛋白

6、52（CEP52） 對數生長期表達 穩(wěn)定期關閉,UBI 3 編碼泛素-羧基延伸蛋白76（CEP76） 對數生長期表達 穩(wěn)定期關閉,UBI 4 編碼泛素五聚體 對數生長期關閉 穩(wěn)定期表達,酵母菌共有七個泛素連接酶基因,UBC 1、UBC 2、UBC 3、UBC 4、UBC 5、UBC 6、UBC 7,3）泛素降解途徑衰減的釀酒酵母,在釀酒酵母菌中，泛素主要由UBI 4基因表達，UBI 4-突變株能,UBI 4缺陷型,正常生長，但細胞內游離泛素分子的濃度比野生株要低得多,因此UBI 4缺陷突變株是外源基因表達理想的受體,UBA 1缺陷型,UBA1編碼泛素激活酶E1，UBA1突變株是致死性的，但其等

7、位,基因缺陷是非致死性的，而且也能削弱泛素介導的蛋白降解,Ubc4 - ubc5 雙突變型,七個泛素連接酶基因的突變對衰減蛋白降解作用同樣有效,三、 酵母菌的載體系統(tǒng),酵母菌克隆表達質粒的構建,2,酵母菌中的野生型質粒,1,第十五章 酵母基因工程,1. 酵母菌中的野生型質粒,1）釀酒酵母中的2m環(huán)狀質粒,幾乎所有的釀酒酵母中都含有2m雙鏈,同源重組,REP1,RAF,STB,ori,REP2,FLP,IR,IR,A,B,環(huán)狀質粒，拷貝數達50至100個,IRs 反向重復序列，600 bp，重組,FLP 編碼產物驅動IRs的同源重組,REP 編碼產物控制質粒的穩(wěn)定性,STB REP的結合位點,接

8、合酵母屬中的pSR1和pSB1，以及,克魯維酵母屬中的pKD1等均與2m質,粒類似,1. 酵母菌中的野生型質粒,2）乳酸克魯維酵母中的線狀質粒,乳酸克魯維酵母中含有兩種不同,pGKL1 8.9 kb,DNA聚合酶 毒素蛋白ab 免疫蛋白 g 亞基,的雙鏈線狀質粒pGKL1和pGKL1,拷貝數為50-100個，分別攜帶K1,K2兩種能使多種酵母菌致死的毒,反向重復序列,素蛋白編碼基因（a b g），同時含有毒素蛋白抗性基因,2. 酵母菌克隆表達質粒的構建,1）含有ARS的YRp質粒的構建,ARS為酵母菌中的自主復制序列，0.8-1.5kb，染色體上每30-40kb,就有一個ARS元件。酵母菌自主

9、復制型質粒的構建組成包括復制子、標,記基因、提供克隆位點的大腸桿菌質粒DNA,以ARS為復制子的質粒稱為YRp,上述兩類質粒在釀酒酵母中的拷貝數最高可達200個，但培養(yǎng)幾代,以2m質粒上的復制元件為復制子的質粒稱為YEp,后，質粒的丟失率高達50%-70%，主要是由于分配不均勻所致,2. 酵母菌克隆表達質粒的構建,2）含有CEN的YCp質粒的構建,CEN為酵母菌染色體DNA上與染色體均勻分配有關的序列,將CEN DNA插入含ARS的質粒中，獲得的新載體稱為YCp,YCp質粒具有較高的有絲分裂穩(wěn)定性，但拷貝數只有1 - 5個,3）含有TEL的YAC質粒的構建,2. 酵母菌克隆表達質粒的構建,4）

10、含有酵母菌染色體DNA同源序列的YIp質粒的構建,在大腸桿菌質粒上組裝酵母菌染色體DNA特定序列和標記基因,構建出來的質粒稱為Yip。目的基因表達盒通常插在染色體DNA特定,序列中，這樣目的基因就能高效整合入酵母菌特定的染色體DNA區(qū)域,四、 酵母菌的轉化系統(tǒng),2、轉化質粒在酵母細胞中的命運,1、酵母菌的轉化程序,3、用于轉化子篩選的標記基因,第十五章 酵母基因工程,1、酵母菌的轉化程序,1）酵母菌原生質體轉化法,早期酵母菌的轉化都采用在等滲緩沖液中穩(wěn)定的原生質體轉化,法，在Ca2+和PEG的存在下，轉化細胞可達原生質體總數的1-2,但該程序操作周期長，而且轉化效率受到原生質再生率的嚴重制約,

11、原生質體轉化法的一個顯著特點是，一個受體細胞可同時接納,多個質粒分子，而且這種共轉化的原生質體占轉化子總數的25-33,1、酵母菌的轉化程序,2）堿金屬離子介導的酵母菌完整細胞的轉化,釀酒酵母的完整細胞經堿金屬離子（如Li+等）、PEG、熱休克,處理后，也可高效吸收質粒DNA，而且具有下列特性,吸收線型DNA的能力明顯大于環(huán)狀DNA，兩者相差80倍,共轉化現象極為罕見,1、酵母菌的轉化程序,3）酵母菌電擊轉化法,酵母菌原生質體和完整細胞均可在電擊條件下吸收質粒DNA,但在此過程中應避免使用PEG，它對受電擊的細胞具有較很大的負,作用。電擊轉化的優(yōu)點是不依賴于受體細胞的遺傳特征及培養(yǎng)條件,適用范

12、圍廣，而且轉化率可高達105 / mg DNA,2、轉化質粒在酵母細胞中的命運,單雙鏈DNA均可轉化酵母菌，但單鏈的轉化率是雙鏈的10-30倍,含有復制子的單鏈質粒進入細胞后，能準確地轉化為雙鏈并復制,不含復制子的單鏈質粒進入細胞后，能高效地同源整合入染色體,這對于體內定點突變酵母基因組極為有利,克隆在YIp整合型質粒上的外源基因，如果含有受體細胞的染色體,DNA的同源序列，會發(fā)生高頻同源整合，整合子占轉化子總,數的50-80,3、用于轉化子篩選的標記基因,用于酵母菌轉化子篩選的標記基因主要有營養(yǎng)缺陷型互補基因和,顯性基因兩大類,營養(yǎng)缺陷型互補基因主要有氨基酸和核苷酸生物合成基因，如,LEU、

13、TRP、HIS、LYS、URA、ADE,但對于多倍體酵母來說，篩選營養(yǎng)缺陷型的受體非常困難,營養(yǎng)缺陷型的互補基因,3、用于轉化子篩選的標記基因,顯性標記基因的編碼產物只要是毒性物質的抗性蛋白,顯性標記基因,aph 氨基糖苷轉移酶 抗G418,cat 氯霉素乙酰轉移酶 抗氯霉素,dhfr 二氫葉酸還原酶 抗氨甲喋呤和磺胺,cup1 銅離子螯合物 耐受銅離子,suc2 蔗糖轉化酶 耐受高濃度蔗糖,ilv2 乙酰乳糖合成酶 抗硫酰脲除草劑,標記基因,編碼產物,遺傳表型,五、 酵母菌的表達系統(tǒng),2、外源基因在酵母菌中表達的限制因素,1、酵母菌啟動子的可控性,3、酵母菌表達系統(tǒng)的選擇,第十五章 酵母基因

14、工程,1、酵母菌啟動子的可控性,pho4TS-PHO5啟動子,釀酒酵母PHO5啟動子在培養(yǎng)基中游離磷酸鹽耗盡時才能打開,PHO4基因編碼產物是PHO5啟動子的正調控因子,因此，裝在pho4TS-PHO5啟動子下游的外源基因在35時關閉,23誘導表達,1）溫度控制型啟動子,PHO4溫度敏感型突變基因pho4TS的編碼產物在35時失活,1、酵母菌啟動子的可控性,a a 型啟動子,釀酒酵母有a和a兩種單倍體，分別由MATa和MATa兩個等位基因決定。 a1因子決定a細胞特征表達a2因子阻遏a細胞特征表達a1-a2阻遏a細胞特征表達 編碼a2因子的基因突變型hmla2-102能產生a2變體，它能滅活a

15、1，同時阻遏a型,溫度控制型啟動子,a 型啟動子,hmla2-102 MATa,a1,Sir3-8TS,a 型啟動子,受體細胞基因組 重組質粒,a 型啟動子,hmla2-102 MATa,a1,Sir3-8TS,a 型啟動子,a2,a1,25,35,1、酵母菌啟動子的可控性,釀酒酵母,2）超誘導型啟動子,GAL1,GAL7,GAL10,UAS,GAL4,GAL80,半乳糖誘導效果不明顯，基因基底水平表達,GAL1,GAL7,GAL10,UAS,GAL4,GAL80,半乳糖誘導時，GAL4高效表達，GAL1、GAL1、GAL10超高效表達,GAL10,Promoter,的半乳糖,利用酶系,由GA

16、L1,GAL7和,GAL10,基因編碼,2、外源基因在酵母菌中表達的限制因素,外源基因穩(wěn)態(tài)mRNA的濃度,外源基因mRNA的翻譯活性,酵母菌對密碼子的偏愛性,在釀酒酵母中，高豐度的蛋白質（如甘油醛-3-磷酸脫氫酶,GAPDH、磷酸甘油激酶PKG、乙醇脫氫酶ADH）中96,以上的氨基酸是由25個密碼子編碼的,3、酵母菌表達系統(tǒng)的選擇,釀酒酵母的基因表達系統(tǒng)最為成熟，包括轉錄活性較高的甘油,醛-3-磷酸脫氫酶基因GAPDH、磷酸甘油激酶基因PKG、乙醇脫氫,1)釀酒酵母表達系統(tǒng),酶基因ADH所屬的啟動子，多種重組外源蛋白獲得成功表達,釀酒酵母表達系統(tǒng)的最大問題在于其超糖基化能力，往往使得,有些重組

17、蛋白（如人血清白蛋白等）與受體細胞緊密結合，而不能,大量分泌。這一缺陷可用非釀酒酵母型的表達系統(tǒng)來彌補,3、酵母菌表達系統(tǒng)的選擇,乳酸克魯維酵母的雙鏈環(huán)狀質粒pKD1已被廣泛用作重組異源,蛋白生產的高效表達穩(wěn)定性載體，即便在無選擇壓力的條件下，也,2) 乳酸克魯維酵母表達系統(tǒng),能穩(wěn)定遺傳40代以上,乳酸克魯維酵母表達分泌型和非分泌型的重組蛋白，性能均優(yōu),于釀酒酵母表達系統(tǒng),3、酵母菌表達系統(tǒng)的選擇,巴斯德畢赤酵母是一種甲基營養(yǎng)菌，能在低廉的甲醇培養(yǎng)基中生,3)巴斯德畢赤酵母表達系統(tǒng),長，甲醇可高效誘導甲醇代謝途徑中各酶編碼基因的表達，因此生長,迅速、乙醇氧化酶基因AOX1所屬強啟動子、表達的可

18、誘導性是巴斯,德畢赤酵母表達系統(tǒng)的三大優(yōu)勢,由于巴斯德畢赤酵母沒有合適的自主復制型載體，所以外源基因,的表達序列一般整合入受體的染色體DNA上。在此情況下，外源基因,具有經濟價值的重組蛋白在巴斯德畢赤酵母系統(tǒng)中獲得成功表達,的高效表達在很大程度上取決于整合拷貝數的多寡。目前已有20余種,3、酵母菌表達系統(tǒng)的選擇,多型漢遜酵母也是一種甲基營養(yǎng)菌。其自主復制序列HARS已被,4)多型漢遜酵母表達系統(tǒng),克隆，并用于構建克隆表達載體，但與巴斯德畢赤酵母相似，這種載,體在受體細胞有絲分裂時顯示出不穩(wěn)定性。所不同的是，HARS質粒,能高頻自發(fā)地整合在受體的染色體DNA上，甚至可以連續(xù)整合100多,目前，包

19、括乙型肝炎表面抗原在內的數種外源蛋白在該系統(tǒng)中獲,個拷貝，因此重組多型漢遜酵母的構建也是采取整合的策略,得成功表達,六、 利用重組酵母生產乙肝疫苗,由乙型肝炎病毒（HBV）感染引起的急慢性乙型肝炎是一種嚴重,的傳染病，每年約有200萬病人死亡，并有3億人成為HBV攜帶者，其,中相當一部分人可能轉化為肝硬化或肝癌患者。目前對乙型肝炎病毒,還沒有一種有效的治療藥物，因此高純度乙型疫苗的生產對預防病毒,感染具有重大的社會效益，而利用重組酵母大規(guī)模生產乙型疫苗為其,廣泛應用提供了可靠的保證,第十五章 酵母基因工程,六、 利用重組酵母生產乙肝疫苗,2、產乙肝表面抗原的重組釀酒酵母,1、乙型肝炎病毒的結構

20、與性質,3、產乙肝表面抗原的重組巴斯德畢赤酵母,1、乙型肝炎病毒的結構與性質,乙肝病毒是一種蛋白包裹型的雙鏈DNA病毒，具有感染力的病毒,乙型肝炎病毒的結構,顆粒呈球面狀，直徑為42 nm，基因組僅為3.2 kb。病毒顆粒的主要,結構蛋白是病毒的表面抗原多肽（HBsAg）或S多肽，它具有糖基化,和非糖基化兩種形式。顆粒內的蛋白成份包括核心抗原（ HBcAg ）,除此之外，被乙肝病毒感染的人的肝臟還能合成并釋放大量的22,病毒DNA聚合酶、微量病毒蛋白,nm的空殼亞病毒顆粒，其免疫原性是未裝配的各種包裝蛋白組份的,1000倍。包裝蛋白共有三種轉膜糖蛋白：S、M、L多肽,1、乙型肝炎病毒的結構與性質,乙型肝炎病毒的包裝蛋白編碼基因,ATG,ATG,ATG,TAA,108 aa,55 aa,226 aa,preS1,preS2,S,S 多肽,226 aa,M 多肽,281 aa,L 多肽,399 aa,1、乙型肝炎病毒的結構與性質,乙肝病毒在體外細胞培養(yǎng)基中并不能繁殖，因此第一代的乙肝疫,傳統(tǒng)乙肝疫苗的制備,苗是從病毒攜帶者的肝細胞質膜上提取出來的。雖然這種質膜來源的,疫苗具有較高的免疫原性，但由于