基因工程常用受體細胞

1、第三章：基因藥物體外表達的受體細胞,第一節(jié)、宿主細胞選擇原則,1、容易獲得較高濃度的細胞； 2、安全，不致??； 3、遺傳背景清楚，容易進行DNA重組操作及遺傳改造； 4、產(chǎn)物的產(chǎn)量高（表達水平和穩(wěn)定性） 、生物活性高 5、產(chǎn)物容易提取純化。 6、容易進行代謝調(diào)控； 7、易培養(yǎng)（生長速度、營養(yǎng)需求、氧耗量等），培養(yǎng)成本低,第二節(jié)、宿主細胞分類及特點,分類：原核細胞（大腸桿菌、枯草芽胞桿菌、鏈霉菌等） 真核細胞（酵母細胞、哺乳動物細胞、昆蟲細胞,一、原核表達系統(tǒng)的特點,一）優(yōu)點： 1、 結(jié)構(gòu)簡單，基因組成及功能相對清楚，易于遺傳操作及轉(zhuǎn)化 2、生理代謝途徑及表達調(diào)控機制相對清楚，便于表達調(diào)控 3、

2、生長迅速，要求條件低（大腸桿菌倍增時間為17分鐘），易于大規(guī)模培養(yǎng),二）缺點,1、不能識別剪切內(nèi)含子，不能表達基因組DNA，只能表達cDNA； 2、缺乏真核生物的蛋白質(zhì)加工修飾系統(tǒng)，不能進行蛋白酶解、糖基化、磷酸化、乙?；?、硫酸化、酰胺化等修飾作用； 蛋白酶解作用：從蛋白前體中切去一段氨基酸序列，從而獲得功能性分子 糖基化意義： 賦予蛋白獨特的結(jié)合性并增強穩(wěn)定性 3、不具備真核生物的蛋白質(zhì)復性系統(tǒng)（如蛋白二硫鍵異構(gòu)酶），不能進行真核蛋白的正確折疊,二、酵母（yeast）表達體系特點,酵母菌是最簡單的真核單細胞生物； 是外源真核基因最理想的表達體系,一）優(yōu)點,1、全基因組測序，基因表達調(diào)控機理比

3、較清楚，遺傳操作簡便2、具有原核生物無法比擬的蛋白翻譯后加工修飾系統(tǒng)。對表達的蛋白可進行正確折疊和糖基化、磷酸化等修飾； 3、安全：不含特異病毒、不產(chǎn)生毒素，美國FDA認定為安全的4、繁殖迅速（倍增期約2小時 ），要求條件低，大規(guī)模發(fā)酵工藝簡單，成本低廉； 5、能外分泌,二）缺點,1、生長相對細菌緩慢 2、對有些生物活性蛋白仍無法表達或正確修飾，比如蛋白超糖基化,超糖基化修飾作用,酵母菌糖蛋白的N糖基外鏈的組成成分只有甘露糖，但其分支結(jié)構(gòu)極為復雜的的現(xiàn)象稱為超糖基化修飾作用。 酵母菌 高等真核生物 O寡聚多糖鏈 甘露糖單體 唾液酸基團 N糖基外側(cè)鏈 甘露糖 甘露糖 N乙酰葡萄糖胺 半乳糖 果糖

4、 唾液酸等,N-連接糖基化(N-linked glycosylation,新合成蛋白進行糖基化修飾的一種方式。 糖通過與蛋白質(zhì)的天冬氨酸的自由NH2基連接，所以將這種糖基化稱為N-連接的糖基化,O-連接的糖基化（O-linked glycosylation,高爾基體中進行的另一種蛋白質(zhì)的糖基化，將糖鏈轉(zhuǎn)移到多肽鏈的絲氨酸、蘇氨酸或羥賴氨酸的羥基的氧原子上,三、哺乳動物細胞表達特點,是表達哺乳動物基因（如人基因）的最好受體細胞。 優(yōu)點： 1、能識別和剪切內(nèi)含子并加工為成熟的mRNA，既可表達cDNA又可表達基因組DNA； 2、表達產(chǎn)物具有正確地高級結(jié)構(gòu)和糖基化、磷酸化等修飾。 3、表達產(chǎn)物可分泌

5、到培養(yǎng)液中，純化容易,缺點,1、細胞生長慢，培養(yǎng)條件刻苛，大規(guī)模培養(yǎng)工藝復雜、費用高 2、培養(yǎng)液中產(chǎn)物濃度較小 3、轉(zhuǎn)化細胞篩選麻煩,主要基因工程表達體系比較,第三節(jié)、常用原核表達細胞,大腸桿菌 枯草芽孢桿菌 短小芽孢桿菌,一、大腸桿菌表達體系,一）生物學特性 革蘭氏陰性桿菌 大小24um0.40.1um； 無芽孢； 一般無莢膜(capsule) 裂殖(Fission)分裂，3717分鐘繁殖一代,二）特點,優(yōu)點： 1、載體受體系統(tǒng)完備 2、外源基因表達水平高，可達總蛋白530； 3、下游技術(shù)成熟,缺點,1、 胞內(nèi)表達蛋白易形成無活性的包涵體，需進行復性操作；可溶性表達的胞內(nèi)真核蛋白易被細菌蛋白

6、酶水解 2、蛋白分泌機制不健全，外源真核基因很難實現(xiàn)分泌表達，且分泌產(chǎn)物大多只能分泌到細胞周質(zhì)（細胞質(zhì)與外膜之見的間隙）；少數(shù)分泌表達的蛋白表達效率比包含體形式低很多。 3、胞內(nèi)表達產(chǎn)物蛋白質(zhì)N端多余一個甲硫氨酸殘基（由起始密碼ATG編碼），影響活性或容易引起免疫反應 4、 細胞壁含脂多糖（內(nèi)毒素），增加了分離純化難度,包涵體,細胞內(nèi)由生物大分子致密聚集形成的被膜包裹或無膜的水不溶顆粒狀物（相差顯微鏡或電子顯微鏡下可見）。 組成： 1、外源重組蛋白：50以上 2、宿主蛋白：RNA聚合酶、核糖核蛋白體、外膜蛋白等 3、質(zhì)粒編碼蛋白：如標記基因產(chǎn)物 4、非蛋白分子：DNA、RNA、脂多糖等 蛋白特

7、點：氨基酸序列組成正確，空間構(gòu)象往往錯誤,三）在基因工程中的應用,擴增外源DNA（雙鏈、單鏈） 構(gòu)建基因文庫（DNA文庫、cDNA文庫） 高效表達原核生物基因 表達不需翻譯后加工、修飾的真核蛋白,五、實驗室常用的大腸桿菌,用于接受質(zhì)粒： C600 W3110 HB101 JM83 JM101（Aps、Tcs、Cms,用于接受l-DNA： LE392、ED8654,二、芽孢桿菌（Bacillus subtilis）表達體系,一）生物學特性 革蘭氏陽性桿菌 大小0.70.823m 能產(chǎn)生芽孢,二）特點,優(yōu)點： 1、具有高效分泌機制，可將表達的外源蛋白高效分泌到培養(yǎng)基中，且多數(shù)真核蛋白經(jīng)芽孢桿菌分泌

8、后便具有天然構(gòu)象和生物活性 2、胞壁不含脂多糖，不產(chǎn)生內(nèi)毒素,缺點,1、載體受體系統(tǒng)不完備 2、常規(guī)方法不易轉(zhuǎn)化 3、野生型芽孢桿菌合成和分泌大量的胞外蛋白酶，直接影響表達產(chǎn)物的穩(wěn)定性 4、發(fā)酵技術(shù)不如大腸桿菌成熟,三）基因制藥目前普遍使用的芽孢菌表達系統(tǒng)及載體,枯草芽孢桿菌：蛋白分泌能力強，但同時至少分泌6種蛋白酶 短小芽孢桿菌：蛋白分泌能力與枯草芽孢桿菌接近，但胞外蛋白酶活性遠低于枯草芽孢桿菌，且可分泌蛋白酶抑制劑,多重蛋白酶基因缺陷枯草芽孢桿菌受體菌,DB428WB500 WB600 DB428、WB500 、WB600蛋白酶活性分別只及野生型的3.1、0.8、0.3，若加入蛋白酶抑制劑

9、苯甲基磺酰氟（PMSF）則WB600胞外檢測不到蛋白酶活性,兩株胞外蛋白分泌水平較高的短小芽孢桿菌野生株,芽孢桿菌47株 HPD31株 在合適培養(yǎng)條件下，每升培養(yǎng)液可積累30g蛋白產(chǎn)物,芽孢桿菌使用的表達載體,pNU210 PYQL pUB18,四）在基因工程制藥中的應用,重組蛋白多肽藥物的分泌表達 白細胞介素2 白細胞介素3 表皮生長因子（EGF） 人干擾素 乙肝病毒核心抗原,第四節(jié)、基因制藥常用酵母表達細胞,釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） 巴斯德畢赤酵母（Pichia pastoris)） 乳酸克魯維酵母（Kluyveromyces lactis） 多型漢遜酵

10、母（Hansenula polymorpha,一、釀酒酵母,是第一個用于基因藥物表達的酵母菌，遺傳背景已相當清楚：有17條染色體，1996年完成其全基因組測序，基因組為12068 kb，閱讀開放開架5887個，編碼約6000個基因，比單細胞的原核生物和古細菌大一個數(shù)量級。 受體細胞舉例：釀酒酵母GRF18,應用,1981年釀酒酵母表達了 第一個外源基因一干擾素基因，隨后又有一系列外源基因在該系統(tǒng)得到表達。 FDA批準的第一個基因工程疫苗就是釀酒酵母表達的乙肝疫苗（Merck公司） 上市產(chǎn)品還有人胰島素（丹麥Novo Nordisk公司）和人粒細胞集落刺激因子（Immunex公司）等,存在問題,

11、1、外源基因表達水平不高。 原因： （1）密碼子使用的偏向性（tRNA與外源基因密碼子不匹配） （2）乙醇發(fā)酵途徑活躍導致生物大分子合成普遍受到抑制 （3）質(zhì)粒的不穩(wěn)定性 2、重組異源蛋白超糖基化修飾,二、巴斯德畢赤酵母（Pichia pastoris,是近年來發(fā) 展最為迅速，應用最為廣泛的酵母細胞。 是一種甲基營養(yǎng)菌，能在相對較為廉價的甲醇培養(yǎng)基中生長,優(yōu)點,除具有一般酵母所具有的特點 外，還有以下幾個優(yōu)點： 1、具有目前最強，調(diào)控機理最嚴格的啟動子之一 乙醇氧化酶AOX1基因啟動子,外源蛋白表達量高（一般 500-4000mg/L，最高為破傷風毒素C達到12g/l） 。 2、表達質(zhì)粒能在基

12、因組的特定位點穩(wěn)定整合。 3、蛋白產(chǎn)物糖基化修飾作用大多數(shù)情況下接近哺乳動物細胞且可直接以天然可溶形式分泌到胞外,缺點,發(fā)酵周期長，要添加甲醇 分子生物學基礎不清楚，遺傳改造難度大,應用,生產(chǎn)重組真核藥物蛋白： 近年來，Invitrogon公司開發(fā)了畢赤酵母表達系統(tǒng)的系列產(chǎn)品，短短幾年已經(jīng)有300多種外源蛋自在該系統(tǒng)得到有效表達，被認為是目前最有效的酵母表達系統(tǒng)。 藥物蛋白已有20多種，見 李元基因工程藥物P52表。如人IL2、人血清白蛋白、TNF、HBsAg、EGF、破傷風毒素C片斷、人巨細胞病毒抗原、抗凝血因子水蛭素衍生物等，有些即將進入市 場,常用畢氏酵母菌,KM71和GS115:都具有

13、HIS4營養(yǎng)缺陷標記。 GS115茵株：具有AOX1基因，是Mut，即甲醇利用 正常型； KM71菌株：AOX1位點被ARG4基因插入，表型為Muts，即甲醇利用緩慢型 共同特點:為組氨醇脫氫酶缺陷株，與帶有his標記基因的表達質(zhì)粒配合使用,三、乳酸克魯維酵母,具有可穩(wěn)定存在的附加體型質(zhì)粒pKD1載體及高拷貝整合型質(zhì)粒pMIRK1 外源基因表達水平比釀酒酵母高，如由重組乳酸克魯維酵母合成的人IL1是重組釀酒酵母的80100倍,四、多型漢遜酵母表達系統(tǒng),蛋白糖基化修飾作用接近哺乳動物細胞。 也是一種甲基營養(yǎng)菌,舉例：利用重組酵母生產(chǎn)乙肝疫苗,第一代乙肝疫苗：病毒攜帶者體內(nèi)提取 存在問題： 1、來

14、源有限 2、提取過程復雜 3、致病潛在危險 4、成本高,第二代乙肝疫苗重組乙肝疫苗,第一階段：大腸桿菌重組乙肝疫苗。20世紀70年代末嘗試用大腸桿菌表達乙肝表面抗原HBsAg，但表達水平極低 第二階段：釀酒酵母重組乙肝疫苗。起始于20世紀80年代初，將HBsHg（或s多肽）的編碼序列置于ADH1（釀酒酵母的乙醇脫氫酶1基因）啟動子或PGK（磷酸甘油酯激酶基因）啟動子后面，表達出具有免疫活性的非糖基化HBsHg 。目前已作為乙肝疫苗商品化，商品名為RecombivaxB或EngerixB,第三階段：巴斯德畢赤酵母重組乙肝疫苗,HBsAg基因穩(wěn)定整合在巴斯德畢赤酵母染色體上 表達產(chǎn)物量比在釀酒酵母

15、中高1倍，并且表達蛋白效價高出釀酒酵母數(shù)十倍,第五節(jié)、常用哺乳動物表達細胞,能在培養(yǎng)基中無限生長的哺乳動物細胞系。 一般為與正常細胞生理特性基本接近、無平面接觸抑制特性的腫瘤細胞系或異倍體連續(xù)細胞系,有限細胞系和無限細胞系,有限細胞系（finite cell line）：正常細胞經(jīng)過多次傳代后，一般可連續(xù)培養(yǎng)3050代，就會逐漸失去增殖能力，也就是說它們只能生長有限的時間，經(jīng)過若干傳代培養(yǎng)后將老化死 亡，把這類細胞稱為有限細胞系。 無限細胞系（infinite cell line）或連續(xù)細胞系（continuous cell line）：當細胞經(jīng)過自然或人為的因素轉(zhuǎn)化為異倍體后，能變?yōu)闊o限細胞

16、系，沒有分裂次數(shù)的限制,藥物生產(chǎn)應用的主要細胞系,非洲綠猴腎細胞（COS）、中國倉鼠卵巢細胞（CHO ）、小倉鼠腎細胞（BHK）、人胚胎腎細胞（HEK239）、 C127 用于基因瞬時表達： COS、 BHK、 HEK239 用于基因穩(wěn)定表達：CHO,一、CHO細胞（ Chinese hamster ovary cells,一）一般特性： 分離自中國倉鼠卵巢（Chinese hamster ovary，CHO） 上皮樣細胞，貼壁生長型 對水泡性口炎和Getah病毒敏感,細胞貼壁培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng),二）優(yōu)點,1、外源基因整合到宿主細胞后能穩(wěn)定保持； 2、可分泌表達外源蛋白，而內(nèi)源蛋白分泌很少。 3、

17、蛋 白質(zhì)翻譯后的修飾準確，表達產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)和生物活性接近天然。 4、培養(yǎng)條件要求低。對剪切力和滲透壓有較高的忍受能力；能在無血清的條件生長,三）應用,有多個衍生突變株應用于藥物的生產(chǎn)，培養(yǎng)時需要添加脯氨酸。 采用二氫葉酸還原酶 （DHFR）的缺陷株（*CHO/dhFr）表達的藥物有人組織性纖溶酶原激活劑 tPA、 IFN、IFN 、EPO、HBsAg疫苗、G-CSF、凝血因子等已投放市場。 可在在氨甲酰喋呤 （methotrexate,MTX）存在下，增加外源基因的拷貝數(shù)，提高蛋白的表達水平，使外源基因高效表達,二、BHK細胞,一）一般特性： 分離自幼倉鼠的腎臟（baby hamster

18、kidney, BHK） 成纖維樣細胞，非整倍體，2n=44。 （二）應用：用于增殖病毒制備疫苗和重組蛋白。 兩種重組凝血因子，Bayer的Kogenate FS、Aventis Behring的Helixate分別于1989和1994被FDA獲準上市，1999年FDA批準Novo Nordisk的重組凝血因子VIIa（NovoSeven）上市，用于治療血友病,三、C127細胞,一）一般特性： 分離自小鼠乳腺腫瘤 上皮樣細胞，貼壁型生長。 被牛乳頭瘤病毒（bovine polyoma virus，BPV）DNA載體轉(zhuǎn)染后，細胞形態(tài)發(fā)生明顯變化。 （二）常用細胞系： C127：LT細胞系：生長密度高，表達組成型大T抗原。 C127I細胞：適合于牛 乳頭瘤病毒DNA載體的轉(zhuǎn)化。 （三）應用：已表達多種外源基因，