核酸化學(xué)PPT課件

1、第五章核酸化學(xué),Nucleic Acid chemistry,2,第一節(jié) 概述 第二節(jié) 核酸的化學(xué)組成 第三節(jié) 核酸的分子結(jié)構(gòu) 第四節(jié) 核酸的性質(zhì) 第五節(jié) 核酸的研究方法,本章內(nèi)容,98核中（染色體中） 真核 線粒體（mDNA） 核外 葉綠體（ctDNA） DNA 擬核 原核 核外：質(zhì)粒（plasmid） 病毒：DNA病毒,脫氧核糖核酸 Deoxyribonucleic Acid （DNA） 核糖核酸 Ribonucleic Acid（RNA,核酸的種類、分布,RNA主要存在于細胞質(zhì)中,tRNA rRNA mRNA 其它：小分子細胞核RNA（snRNA）、染色質(zhì)RNA（chRNA）、反義RNA

2、（antisense RNA）、雙鏈RNA（dsRNA）、細胞質(zhì)小RNA（scRNA）、具有催化活性的RNA（ribozyme）、 病毒RNA：SARS,核酸:基本結(jié)構(gòu)單元核苷酸,基本元素：C、H、O、N、P ； 其中P 的含量比較穩(wěn)定，占9%-10%，通過測定P 的含量來推算核酸的含量（定磷法,第一節(jié)核酸的化學(xué)組成,兩種。DNA所含的糖為-D-2-脫氧核糖；RNA所含的糖則為-D-核糖,一、戊糖,二、堿基,1. 嘌呤（Purine,2. 嘧啶（Pyrimidine,稀有堿基，大部分是上述堿基的甲基化產(chǎn)物,二氫尿嘧啶 （DHU,修飾堿基的簡寫符號,為1時可以不寫,取代基用下列小寫英文字母表示,

3、例,三、核苷（nucleoside,核苷：戊糖+堿基 糖與堿基之間的C-N鍵，稱為C-N糖苷鍵 核苷中戊糖與堿基的連接方式,H,四、核苷酸（nucleotide） 核苷酸： 核苷+磷酸 戊糖+堿基+磷酸,第二節(jié) 核酸的分子結(jié)構(gòu),一、DNA的結(jié)構(gòu) 一級結(jié)構(gòu): DNA核苷酸鏈中脫氧核苷酸的組成和排列順序。 二級結(jié)構(gòu)：DNA的兩條多聚鏈間通過氫鍵形成的雙螺旋結(jié)構(gòu)。 三級結(jié)構(gòu)：DNA雙鏈進一步折疊卷曲形成的構(gòu)象,由dAMP、dGMP、dCMP、dTMP核苷酸單體通過3,5-磷酸二酯鍵相連而成的鏈狀聚合物,一）DNA的一級結(jié)構(gòu),核酸鏈的形成,DNA的一級結(jié)構(gòu) DNA的一級結(jié)構(gòu)是指DNA上的核苷酸排列順序

4、。 (核苷酸相當(dāng)于氨基酸、單糖的角色,脫H2O 脂鍵相連,3，5-磷酸二酯鍵,首,尾,結(jié)構(gòu)式,5-磷酸端（常用5-P表示）；3-羥基端（常用3 -OH表示） 核苷酸鏈具有方向性，當(dāng)表示一個核苷酸鏈時，必須注明它的方向是53或是35,A,核苷酸,首端,末端,5PdAPdCPdGPdTOH 3 5PAPCPGPUOH 或5ACGTGCGT 3 5ACGUAUGU 3 ACGTGCGT ACGUAUGU,DNA一級結(jié)構(gòu)的簡寫形式,二）DNA的二級結(jié)構(gòu),Watson 和 Crick 于1953年提出了DNA 雙螺旋結(jié)構(gòu)模型，說明了DNA 的二級結(jié)構(gòu)。（即B型DNA,DNA堿基組成符合： A=T；G=C

5、； A+G=T+C。 不對稱比率：A+T/G+C； 物種不同，DNA堿基組成不同； 物種親緣愈接近，堿基組成也愈接近，該比 率越相近似。 .具有種的特異性，沒有器官和組織的特異性，年齡、營養(yǎng)狀況、環(huán)境的改變不影響DNA的堿基組成,1提出DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型的根據(jù),1）Chargaff定則 （1950s,E. Chargaff發(fā)現(xiàn),2）x-光衍射分析,2DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型（double-helical structure,1953年Watson和Crick提出了DNA雙螺旋結(jié)構(gòu),DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型要點（1,螺旋中的兩條鏈反向平行，即其中一條鏈的方向為53，而另一條鏈的方向為35，兩條鏈共同圍

6、繞一個假想的中心軸呈右手雙螺旋結(jié)構(gòu),疏水的堿基位于雙螺旋的內(nèi)側(cè)，親水的磷酸和脫氧核糖基位于螺旋外側(cè)。堿基平面與螺旋軸垂直，脫氧核糖平面與中心軸平行。 由于幾何形狀的限制，堿基對只能由嘌呤和嘧啶配對，即A與T，G與C。這種配對關(guān)系，稱為堿基互補。A和T之間形成兩個氫鍵， G與C之間形成三個氫鍵,DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型要點（2,DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型要點（3,由于堿基對排列的方向性，使得堿基對占據(jù)的空間是不對稱的，因此，在雙螺旋的表面形成大小兩個凹槽，分別稱為大溝和小溝，二者交替出現(xiàn),DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型要點（4,雙螺旋橫截面的直徑約為2 nm，相鄰兩個堿基平面之間的距離（軸距）為0.34 nm，每1

7、0個核苷酸形成一個螺旋，其螺距（即螺旋旋轉(zhuǎn)一圈）的高度）為3.4 nm,DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型要點（5,兩條鏈借堿基之間的氫鍵和堿基堆積力（即堿基之間的范德華力）牢固的連接起來，維持DNA雙螺旋的三維結(jié)構(gòu)。 兩條鏈是堿基互補關(guān)系,該模型揭示了DNA作為遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定性特征，最有價值的是確認了堿基配對原則，這是DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和反轉(zhuǎn)錄的分子基礎(chǔ)，亦是遺傳信息傳遞和表達的分子基礎(chǔ)。該模型的提出是上個世紀生命科學(xué)的重大突破之一，它奠定了生物化學(xué)和分子生物學(xué)乃至整個生命科學(xué)飛速發(fā)展的基石,3、 DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)的意義,三）DNA的三級結(jié)構(gòu),絕大多數(shù)原核生物的DNA都是共價封閉的環(huán)狀雙螺旋。如果再進一步

8、盤繞則形成麻花狀的超螺旋結(jié)構(gòu),1）正超螺旋（變緊，過旋）和負超螺旋（變松，欠旋）。 2）人類46條染色體的DNA總長可達1.7m，經(jīng)過螺旋化壓縮，實際總長只有200nm。 提問：DNA形成三級結(jié)構(gòu)及染色體的意義何在,在真核生物中，雙螺旋的DNA分子圍繞一蛋白質(zhì)八聚體進行盤繞，從而形成特殊的串珠狀結(jié)構(gòu)，稱為核小體(nucleosome)。核小體結(jié)構(gòu)屬于DNA的高級結(jié)構(gòu),核小體的結(jié)構(gòu),核小體、染色質(zhì)與染色體,二、RNA的分子結(jié)構(gòu),一） RNA的分類及特點 （二） RNA分子的結(jié)構(gòu)特點,結(jié)構(gòu)特點： 1. 堿基組成：A、G、C、U （AU/GC）； 2. 稀有堿基較多，穩(wěn)定性較差，易水解； 3. 多為

9、單鏈結(jié)構(gòu)，少數(shù)局部形成螺旋（發(fā)夾結(jié)構(gòu)）； 4. 分子較小。 分類： 1. 信使RNA（ mRNA） 2. 轉(zhuǎn)運RNA （ tRNA） 3. 核糖體RNA （r RNA,一）RNA的特點及分類,二）、mRNA的結(jié)構(gòu)與功能,約占總RNA的3%-5%，含量最少，種類最多。 成熟mRNA不含內(nèi)含子，hnRNA含有。 mRNA從DNA轉(zhuǎn)錄遺傳信息，并作為蛋白質(zhì)合成的模板，決定蛋白質(zhì)的氨基酸順序,原核生物 mRNA 真核生物mRNA 多順反子 單順反子 轉(zhuǎn)錄后不需加工 轉(zhuǎn)錄后需加工成熟 直接翻譯成蛋白質(zhì) 翻譯成蛋白質(zhì) 半衰期短 半衰期長 數(shù)秒 數(shù)小時,單順反子和多順反子mRNA,2、原核生物mRNA的結(jié)構(gòu)

10、 （1）端：翻譯起始序列 端：翻譯終止序列 （2）少量的間隔序列 （3）無帽無尾,原核細胞mRNA的結(jié)構(gòu)特點,3、真核生物mRNA的結(jié)構(gòu)特點 （1）核內(nèi)不均一（HnRNA） 真核生物轉(zhuǎn)錄生成mRNA時的 初級轉(zhuǎn)錄物和各種剪接中間體的混 合物稱為核內(nèi)不均一 a.10% hnRNA通過去除內(nèi)含子等剪切，修飾而成成熟的mRNA b.hnRNA的t(1/2)短,0.4 hr,內(nèi)含子(intron)編碼序列,外顯子 (exon)編碼序列,真核細胞mRNA的結(jié)構(gòu)特點,2）真核生物成熟 mRNA結(jié)構(gòu)： a. 端帽子結(jié)構(gòu) 結(jié)構(gòu)：端:經(jīng)甲基化修飾,以5,5-磷酸 二酯鍵相連的GTP. (m7G5ppp5Np)。

11、 m7G不是轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 功能：與蛋白質(zhì)合成起始及保護mRNA不易 被降解有關(guān),b.端尾結(jié)構(gòu) 結(jié)構(gòu)：端：20-250個多聚腺 苷酸結(jié)構(gòu)（poly A）。 poly A不是轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 功能：穩(wěn)定mRNA,真核生物mRNA 5-端帽子結(jié)構(gòu),真核生物mRNA 3-端的polyA結(jié)構(gòu),約占全部RNA的80%，含量最多。 與多種蛋白質(zhì)結(jié)合成核糖體，后者是合成蛋白質(zhì)的場所。 單鏈，螺旋化程度較tRNA低 與蛋白質(zhì)組成核糖體后方能發(fā)揮其功能,5SRNA的二級結(jié)構(gòu),三）、核糖體 RNA,四）、轉(zhuǎn)運 RNA,約占總RNA的10-15%，分子最小。含有稀有堿基最多的RNA，其稀有堿基的含量可多達20%。 tRNA是保守

12、性最強的RNA。 tRNA是單鏈核酸，但其分子中的某些局部也可形成雙螺旋結(jié)構(gòu),tRNA分子的結(jié)構(gòu)特點,二級結(jié)構(gòu)特征： 單鏈 三葉草葉形 四臂四環(huán),三級結(jié)構(gòu) 特征： 在二級結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上 進一步折疊扭曲形成倒L型,攜帶氨基酸,辨認并結(jié)合氨基酰tRNA合成酶,識別mRNA上的密碼,識別并結(jié)合核蛋白體,氨基酸臂,DHU臂,反密碼臂,可變環(huán),TC臂,酵母tRNA Ala 的二級結(jié)構(gòu),第四節(jié) 核酸的性質(zhì),一、一般理化性質(zhì) 二、酸堿性質(zhì) 三、紫外吸收 四、變性與復(fù)性 五、分子雜交,一、一般物理性質(zhì),1. DNA白色纖維狀固體，RNA白色粉末狀固體，都微溶于水，不溶于乙醇，因此常用乙醇來沉淀DNA；DNA溶液黏

13、度大于RNA 。 2. DNA難溶于0.14mol/L的NaCl溶液，可溶于1-2 mol/L的NaCl溶液，RNA則相反，可據(jù)此分離二者。 3. 加熱條件下， D核糖濃鹽酸苔黑酚 綠色 D2脫氧核糖酸二苯胺 藍紫色,核酸分子中的磷酸二酯鍵可在酸或堿性條件下水解切斷。 DNA和RNA對酸或堿的耐受程度有很大差別。室溫條件下，DNA在堿中變性，但不水解，RNA水解。 在細胞內(nèi)核酸分子受核酸酶作用,4. 水解,二、酸堿性質(zhì),兩性電解質(zhì) 核酸等電點一般在34左右 （DNA的等電點為44.5，RNA的等電點為22.5,可在pH2.05.0之間分離各種核苷酸,pH3.5時各核苷酸所帶電荷,三、紫外吸收,

14、最大吸收峰在260nm附近 可以作為區(qū)別蛋白質(zhì)和對核酸及其組份定性和定量測定的依據(jù)，進行核酸純度鑒定，也可作為核酸變性和復(fù)性的指標,根據(jù)A260/A280的比值判斷核酸樣品的純度,純DNA：A260/A280=1.8 純RNA：A260/A280=2.0,若樣品中含有雜蛋白或苯酚，則A260/A280比值明顯降低,純的核酸樣品可根據(jù)260nm的光吸收值算出其含量,若260nm光吸收值為1相當(dāng)于50g/ml雙螺旋DNA,或相當(dāng)于40g/ml單鏈DNA或RNA,或相當(dāng)于20g/ml寡核苷酸,1. 概念：是指核酸雙螺旋區(qū)的多聚核苷酸鏈間的氫鍵斷裂，變成單鏈結(jié)構(gòu)的過程,四、DNA的變性,能夠引起核酸變

15、性的因素有： 1）溫度升高； 2）酸堿度改變、pH（11.3或5.0）； 3）有機溶劑如甲醛和尿素、甲酰胺等； 4）低離子強度,2.DNA的變性的條件,變性核酸將失去其部分或全部的生物活性。 一級結(jié)構(gòu)(堿基順序)保持不變。 紫外吸收值明顯增加，即增色效應(yīng)。 DNA的變性過程是突變性的，它在很窄的溫度區(qū)間內(nèi)完成。DNA解鏈溫度 粘度降低，浮力密度增大,3.DNA變性的特征,天然DNA分子在熱變性條件下，雙螺 旋結(jié)構(gòu)破壞，堿基暴露，在紫外光260nm 波長處的吸收度明顯增加，此現(xiàn)象稱為 增色效應(yīng)。 變性DNA分子復(fù)性形成雙螺旋結(jié)構(gòu)時 其紫外吸收降低的現(xiàn)象稱為減色效應(yīng),增色效應(yīng)與減色效應(yīng),當(dāng)50% 的DNA變性時的溫度稱為該DNA的解鏈溫度，即增色效應(yīng)達到一半時的溫度；一般DNA的Tm值在70-85C之間。 影響Tm的因素 DNA的均一性 分子中G和C的含量?？赏ㄟ^經(jīng)驗公式計算：（G+C)%=(Tm-69.3)X2.44 Tm值隨溶液鹽濃度增加而增大,DNA解鏈溫度（熔點，Tm,溶解曲線與Tm和G+C含量,Tm與介質(zhì)離子強度有關(guān),一定條件下，去除變性因素后，核酸恢復(fù)二級結(jié)構(gòu)及生物活性的現(xiàn)象；通常使用熱復(fù)性,DNA的復(fù)性,對于熱變性的DNA，