下一代基因組測序

1、下一代基因組測序,主講人：周文,什么是基因組測序技術(shù),基因組測序技術(shù)最早可以追溯到,20,世紀(jì),50,年代，早在,1954,年就,已經(jīng)出現(xiàn)了關(guān)于早期測序技術(shù)的報(bào)導(dǎo)，即,Whitfeld,等用化學(xué)降,解的方法測定多聚核糖核苷酸序列,1,9,7,7,年,S,a,n,g,e,r,等發(fā)明的雙脫氧核苷酸末端終止法和,Gilbert,等發(fā)明的化學(xué)降解法，標(biāo)志著第一代測序技術(shù)的誕生,此后在三十幾年的發(fā)展中陸續(xù)產(chǎn)生了第二代，第三代測序技術(shù),測序技術(shù)正在向著高通量、低成本、長讀取長度的方向發(fā)展,CNTENTS,02,03,04,01,第一代基因測序,基因組測序的意義,第三代基因測序,第二代基因測序,第一代,傳統(tǒng)

2、的化學(xué)降解法、雙脫氧鏈終止法以及在它們基礎(chǔ)上發(fā)展,起來的各種基因組測序技術(shù)統(tǒng)稱為第一代基因組測序技術(shù),化學(xué)降解法,雙脫氧鏈終止法,熒光自動(dòng)測序技術(shù),雜交測序技術(shù),化學(xué)降解法,1977,年,A.M.Maxam,和,W.Gilbert,首先建立了,DNA,片段序列的測定方法,其原理為,將一個(gè),DNA,片段的,5,端磷酸基,作放射性標(biāo)記，再分別采用不同的化學(xué),方法修飾和裂解特定堿基,表,6-1,從而,產(chǎn)生一系列長度不一而,5,端被標(biāo)記的,DNA,片段，這些以特定堿基結(jié)尾的片段,群通過凝膠電泳分離，再經(jīng)放射線自顯,影，確定各片段末端堿基，從而得出目,的,DNA,的堿基序列,雙脫氧鏈終止法,核酸模板在核

3、酸聚合酶、引物、四種單脫氧堿基存在條件下,復(fù)制或轉(zhuǎn)錄時(shí)，如果在四管反應(yīng)系統(tǒng)中分別按比例引入四種雙,脫氧堿基，只要雙脫氧堿基摻入鏈端，該鏈就停止延長，鏈端,摻入單脫氧堿基的片段可繼續(xù)延長,如此每管反應(yīng)體系中便合成以共同引物為,5,端，以雙脫氧堿基,為,3,端的一系列長度不等的核酸片段,反應(yīng)終止后，分四個(gè)泳道進(jìn)行電泳。以分離長短不一的核酸,片段,長度相鄰者僅差一個(gè)堿基,根據(jù)片段,3,端的雙脫氧堿基,便可依次閱讀合成片段的堿基排列順序,第二代,第二代測序技術(shù)的核心思想是邊合成邊測序，即通過捕捉新合成的,末端的標(biāo)記來確定,DNA,的序列,合成法測序,Solexa,測序技術(shù),454,GS-FLX,連接法

4、測序,SOLiD,測序技術(shù),Polonator,Solexa,測序技術(shù),原理：生成新,DNA,互補(bǔ)鏈時(shí)，要么加入的,dNTP,通過酶促級(jí)聯(lián)反,應(yīng)催化底物激發(fā)熒光，要么直接加入被熒光標(biāo)記的,dNTP,或半簡,并引物，在合成或鏈接生成互補(bǔ)鏈時(shí)，釋放出熒光信號(hào),通過捕獲光信號(hào)并轉(zhuǎn)化為一個(gè)測序峰值，獲得互補(bǔ)鏈序列信息,具體流程,1,添加接頭,adapters,利用物理方法將待測樣品,DNA,打碎，在單鏈,DNA,碎片兩端加上,接頭,2,表面結(jié)合,Solexa,的測序利用微注射系統(tǒng)將已經(jīng)加過接頭的待測片段隨機(jī),添加到芯片,Flow,cell,內(nèi)，每一個(gè),Flow,cell,又補(bǔ)分成,8,條,Lane,每

5、,條,Lane,的內(nèi)表面上能以共價(jià)鍵的形式隨機(jī)固定單鏈接頭序列和,帶接頭的單鏈待測,DNA,片段,3,橋型擴(kuò)增循環(huán)獲得多拷貝待測,DNA,片段,在,Flow,cell,內(nèi)加入未被標(biāo)記的,dNTP,和酶起始固相橋型擴(kuò)增。所,有單鏈橋型待測片段被擴(kuò)增成雙鏈橋片段，通過變性，釋放出,互補(bǔ)的單鏈，錨定到附近的固相表面。通過不斷循環(huán)，將會(huì)在,Flow,cell,的固相表面上獲得上百萬條成蔟分布的雙鏈待,測片段,4,測序,加入,DNA,聚合酶和被熒光標(biāo)記的,dNTP,和接頭引物進(jìn)行擴(kuò)增，在,每一個(gè)測序列簇延伸互補(bǔ)時(shí)，每加入一個(gè)被熒光標(biāo)記的,dNTP,就,能釋放出相應(yīng)的熒光，測序儀通過捕捉光信號(hào)，并通過計(jì)算

6、機(jī),軟件將光信號(hào)轉(zhuǎn)化為測序峰，從而獲得待測片段序列信息,SOLiD,測序技術(shù),原理：用連接法測序獲得基于“雙堿基編碼原理”的,SOLID,顏色編碼序列，隨后的數(shù)據(jù)分析比較原始顏色序,列與轉(zhuǎn)換成顏色編碼的,reference,序列，把,SOLID,顏色序,列定位到,refrence,上，同時(shí)矯正測序錯(cuò)誤，并可結(jié)合原,始顏色序列的質(zhì)量信息發(fā)現(xiàn)潛在,SNP,位點(diǎn),SOLID,基,因,組,文,庫,構(gòu),建,油包水,PCR,含,DNA,模板,P1,磁珠的固定,SOLID,雙堿基編碼原理及測序流程,第三代,第三代測序技術(shù)是指單分子測序技術(shù),DNA,測序時(shí)，不需要經(jīng)過,PCR,擴(kuò)增，實(shí)現(xiàn)了對(duì)每一條,DNA,分

7、子的單獨(dú)測序。第三代測序技術(shù),也叫從頭測序技術(shù)，即單分子實(shí)時(shí),DNA,測序,單分子熒光測序,納米孔測序,單分子熒光測序,脫氧核苷酸用熒光標(biāo)記，顯微鏡可以實(shí)時(shí)記錄熒光的強(qiáng)度變化,當(dāng)熒光標(biāo)記的脫氧核苷酸被摻入,DNA,鏈的時(shí)候，它的熒光就同,時(shí)能在,DNA,鏈上探測到,當(dāng)它與,DNA,鏈形成化學(xué)鍵的時(shí)候，它的熒光基團(tuán)就被,DNA,聚合,酶切除，熒光消失,這種熒光標(biāo)記的脫氧核苷酸不會(huì)影響,DNA,聚合酶的活性，并且,在熒光被切除之后，合成的,DNA,鏈和天然的,DNA,鏈完全一樣,SMRT,技術(shù)的測序速度很快，每秒約數(shù)個(gè),dNTP,但是，同時(shí)其測序錯(cuò)誤率比較高（這幾乎是目前單分子測序技,術(shù)的通?。?，

8、達(dá)到,15,但好在它的出錯(cuò)是隨機(jī)的，并不會(huì)像第二代測序技術(shù)那樣存在,測序錯(cuò)誤的偏向，因而可以通過多次測序來進(jìn)行有效的糾錯(cuò),代價(jià)是重復(fù)測序，也就是成本會(huì)增加,新型納米孔測序法,nanopore,sequencing,是采用電泳技術(shù)，借,助電泳驅(qū)動(dòng)單個(gè)分子逐一通過納米孔,來實(shí)現(xiàn)測序的,該技術(shù)的關(guān)鍵之一是，設(shè)計(jì)了一種特殊的納米孔（只能容納單,分子通過），孔內(nèi)共價(jià)結(jié)合有分子接頭,當(dāng),DNA,堿基通過納米孔時(shí)，它們使電荷發(fā)生變化，從而短暫地,影響流過納米孔的電流強(qiáng)度（每種堿基所影響的電流變化幅度,是不同的,通過電信號(hào)的差異就能檢測出通過的堿基類別，從而實(shí)現(xiàn)測序,納米孔測序,三代測序比較,人類進(jìn)行基因組測

9、序有什么意義呢,1.HGP,人類進(jìn)行基因組計(jì)劃）對(duì)人類疾病基因研究的貢獻(xiàn),人類疾病相關(guān)的基因是人類基因組中結(jié)構(gòu)和功能完整性至關(guān)重要的信息,對(duì)于單基因病，采用“定位克隆”和“定位候選克隆”的全新思路，導(dǎo),致了亨廷頓舞蹈病、遺傳性結(jié)腸癌和乳腺癌等一大批單基因遺傳病致病,基因的發(fā)現(xiàn)，為這些疾病的基因診斷和基因治療奠定了基礎(chǔ),對(duì)于心血管疾病、腫瘤、糖尿病、神經(jīng)精神類疾?。ɡ夏晷园V呆、精神,分裂癥）、自身免疫性疾病等多基因疾病是目前疾病基因研究的重點(diǎn),2,HGP,對(duì)醫(yī)學(xué)的貢獻(xiàn),基因診斷、基因治療和基于基因組知識(shí)的治療、基于基因組信息的疾病,預(yù)防、疾病易感基因的識(shí)別、風(fēng)險(xiǎn)人群生活方式、環(huán)境因子的干預(yù),3,

10、HGP,對(duì)生物技術(shù)的貢獻(xiàn),1,基因工程藥物：分泌蛋白（多肽激素，生長因子，趨化因子，凝,血和抗凝血因子等）及其受體,2,診斷和研究試劑產(chǎn)業(yè)：基因和抗體試劑盒、診斷和研究用生物芯,片、疾病和篩藥模型,3,對(duì)細(xì)胞、胚胎、組織工程的推動(dòng)：胚胎和成年期干細(xì)胞、克隆技,術(shù)、器官再造,4,HGP,對(duì)制藥工業(yè)的貢獻(xiàn),篩選藥物的靶點(diǎn)：與組合化學(xué)和天然化合物分離技術(shù)結(jié)合，建立高通,量的受體、酶結(jié)合試驗(yàn)以知識(shí)為基礎(chǔ)的藥物設(shè)計(jì)：基因蛋白產(chǎn)物的高級(jí),結(jié)構(gòu)分析、預(yù)測、模擬藥物作用“口袋,個(gè)體化的藥物治療：藥物基因組學(xué),5,HGP,對(duì)社會(huì)經(jīng)濟(jì)的重要影響,生物產(chǎn)業(yè)與信息產(chǎn)業(yè)是一個(gè)國家的兩大經(jīng)濟(jì)支柱；發(fā)現(xiàn)新功能基因的,社會(huì)和經(jīng)濟(jì)效益；轉(zhuǎn)基因食品；轉(zhuǎn)基因藥物（如減肥藥，增高藥,6,HGP,對(duì)生物進(jìn)化研究的影響,生物的進(jìn)化史，都刻寫在各基因組的“天書”上；草履蟲是人的親,戚,13,億年；人是由,300,