細(xì)胞培養(yǎng)注意事項(xiàng)

1、一、常用設(shè)備1. 準(zhǔn)備室的設(shè)備： 單蒸餾水蒸餾器、雙蒸餾水蒸餾器、酸缸、烤箱、高壓鍋、儲(chǔ)品柜（放置未消毒物品）、儲(chǔ)品柜（放置消毒過的物品）、包裝臺(tái)。配液室的設(shè)備：扭力天平和電子天平（稱量藥品）、PH 計(jì)（測量培養(yǎng)用液 PH值）、磁力攪拌器（配置溶液室攪拌溶液）。2. 培養(yǎng)室的設(shè)備：液氮罐、儲(chǔ)品柜（存放雜物）、日光燈和紫外燈、空氣凈化器系統(tǒng)、低溫冰箱（-80 C）、空調(diào)、二氧化碳缸瓶、邊臺(tái)（書寫實(shí)驗(yàn)記錄）。3. 必須放在無菌間的設(shè)備：離心機(jī)（收集細(xì)胞）、超凈工作臺(tái)、倒置顯微鏡、CO2 孵箱（孵育培養(yǎng)物）、水浴鍋、三氧消毒殺菌機(jī)、4 C冰箱（放置serum和培養(yǎng)用液）。二、無菌操作3 %o一）無菌

2、室的滅菌：1. 定期打掃無菌室：每周打掃一次，先用自來水拖地、擦桌子、超凈工作臺(tái)等，然后用 來蘇爾或新潔爾滅或 0.5 過氧乙酸擦拭。2. CO2 孵箱（培養(yǎng)箱）滅菌：先用 3 %新潔爾滅擦拭，然后用 75 酒精擦拭或者 0.5過氧乙酸，再用紫外燈照射。20-30 分鐘。3. 實(shí)驗(yàn)前滅菌：打開紫外燈、三氧殺菌機(jī)、空氣凈化器系統(tǒng)各4. 實(shí)驗(yàn)后滅菌：用 75 酒精（ 3%新潔爾滅）擦拭超凈臺(tái)、邊臺(tái)、倒置顯微鏡的載物臺(tái)。二）實(shí)驗(yàn)人員的無菌準(zhǔn)備：1. 肥皂洗手。2.穿好隔離衣、帶好隔離帽、口罩、放好拖鞋。3.用 75 酒精棉球擦凈雙手。三）無菌操作的演示：1.凡是帶入超凈工作臺(tái)內(nèi)的酒精、PBS、培養(yǎng)基

3、、胰蛋白酶的瓶子均要用75 %酒精擦拭瓶子的外表面。2.靠近酒精燈火焰操作。3.器皿使用前必須過火滅菌。4.繼續(xù)使用的器皿（如瓶蓋、滴管）要放在高處，使用時(shí)仍要過火。5.各種操作要靠近酒精燈，動(dòng)作要輕、準(zhǔn)確，不能亂碰。如吸管不能碰到廢液缸。6.吸取兩種以上的使用液時(shí)要注意更換吸管，防止交叉污染。三、器械的清洗和消毒一）玻璃器械洗消：新的玻璃器皿的洗消：1.自來水刷洗，除去灰塵。2.烘干、泡鹽酸： 烤箱中烘干， 然后再浸入 5稀鹽酸中 12 小時(shí)以除去臟物、 鉛、砷等物。3.刷洗、烘干： 12 小時(shí)后立即用自來水沖洗，再用洗滌劑刷洗，自來水沖干凈后用烤箱烘干。4.泡酸、清洗：用清潔液（重鉻酸鉀

4、120g ：濃硫酸 200ml ：蒸餾水 1000ml ）浸泡 12 小時(shí)，然后從酸缸內(nèi)撈出器皿用自來水沖洗 15 次，最后蒸餾水沖洗 3-5 次和用雙蒸水過 3 次。5.烘干、包裝：洗干凈后先烘干，然后用牛皮紙（油光紙）包裝。6.高壓消毒：包裝好的器皿裝入高壓鍋內(nèi)蓋好蓋子，打開開關(guān)和安全閥，當(dāng)蒸氣成直線上升時(shí)，關(guān)閉安全閥，當(dāng)指針指向 15 磅時(shí)，維持 20-30 分鐘。7.高壓消毒后烘干舊的玻璃器皿的洗消：1刷洗、烘干：使用過的玻璃器皿可直接泡入來蘇爾液或洗滌劑溶液中，泡過來蘇爾溶液洗滌劑）的器皿要用清水刷洗干凈，然后烘干。2. 泡酸、清洗：烘干后泡入清潔液（酸液），12 小時(shí)后從酸缸內(nèi)撈出

5、器皿立即用自來水沖3 次。洗（避免蛋白質(zhì)干涸后粘附于玻璃上難以清洗），再用蒸餾水沖洗3. 烘干、包裝：洗干凈的器皿烘干后取出用牛皮紙（油光紙）等包裝，以便于消毒儲(chǔ)存及防止灰塵和再次被污染。4. 高壓消毒：包裝好的器皿裝入高壓鍋內(nèi)，蓋好蓋子，打開開關(guān)和安全閥，隨著溫度的上升安全閥冒出蒸氣，當(dāng)蒸氣成直線冒出 3-5 分鐘后，關(guān)閉安全閥，氣壓表指數(shù)隨之上升，當(dāng) 指針指向 15 磅時(shí)，調(diào)節(jié)電開關(guān)維持 20-30 分鐘即可。 （玻璃培養(yǎng)瓶消毒前可將膠帽輕輕蓋 上）5. 烘干備用：因?yàn)楦邏合竞笃髅髸?huì)被蒸氣打濕，所以要放入烤箱內(nèi)烘干備用。二）金屬器械洗消： 金屬器皿不能泡酸， 洗消時(shí)可先用洗滌劑刷洗， 后

6、用自來水沖干凈， 然后用 75 酒精擦拭， 再用自來水，然后用蒸餾水沖洗，再烘干或空氣中晾干。放入鋁制盒內(nèi)包裝好在高壓鍋內(nèi)15 磅高壓（ 30 分鐘）消毒，再烘干備用。三）橡膠和塑料： 橡膠和制品通常處理方法是： 先用洗滌劑洗刷干凈， 再分別用自來水和蒸餾水沖干凈， 再用 烤箱烘干，然后根據(jù)不同品質(zhì)進(jìn)行如下的處理程序：1. 針式濾器帽不能泡酸液，用 NaOH 泡 6-12 小時(shí)，或者煮沸 20 分鐘，在包裝之前要裝好濾膜兩張，安裝濾膜時(shí)注意光面朝上（凹向上 ），然后將螺旋稍微擰松一些，放入鋁盒中在高壓鍋內(nèi) 15 磅 30 分鐘消毒，再烘干備用。 注意在超凈臺(tái)內(nèi)取出使用時(shí)應(yīng)該立即將螺旋旋緊。2.

7、 膠塞烘干后用 2氫氧化鈉溶液煮沸 30 分鐘 （用過的膠塞只要用沸水處理 30 分鐘） ，自 來水洗凈，烘干。然后再泡入鹽酸液 30 分鐘，再用自來水，蒸餾水，三蒸水洗凈，烘干。最后裝入鋁盒內(nèi)高壓消毒，烘干備用。3. 膠帽，離心管帽烘干后只能在 2 氫氧化鈉溶液中浸泡 6-12 小時(shí)（切記時(shí)間不能過長） 自來水洗凈， 烘干。然后再泡入鹽酸液 30 分鐘，再用自來水， 蒸餾水，三蒸水洗凈， 烘干。最后裝入鋁盒內(nèi)高壓消毒，烘干備用。4. 膠頭可用 75 酒精浸泡 5 分鐘，然后紫外照射后使用即可。5. 塑料培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)板，凍存管：70 酒精浸泡消毒。6. 其他消毒方法：有的物品既不能干燥消毒，又

8、不能蒸氣消毒，可用塑料培養(yǎng)皿打開蓋子， 放在超凈臺(tái)臺(tái)面上， 直接暴露在紫外線下消毒。 也可用氧化乙烯消毒 塑料制品，消毒后需要用 23 周時(shí)間洗除殘留的氧化乙烯。用 20000 100000rad 的 r射線消毒塑料制品效果最好。為了防止清洗器材已消毒與末消毒發(fā)生混淆，可在紙包裝后， 用密寫墨水作好標(biāo)記。 其法即用沾水筆或毛筆沾以密寫墨水， 在包裝紙上作一記號， 平時(shí)這 種墨水不帶痕跡，一經(jīng)高溫，即出現(xiàn)字跡，從而可以判定它們是否消毒。密寫墨水的配制： 氯化鉆 （CoC12?6H2o）2g ，30 鹽酸 10m1 ，蒸餾水 88m1 。注意事項(xiàng)：以防高B.從酸缸內(nèi)撈取器皿時(shí)防止酸液濺到地面，會(huì)腐

9、蝕地面。c.器皿浸入酸液中要完全，不能留有1. 嚴(yán)格執(zhí)行高壓鍋的操作規(guī)程：高壓消毒時(shí)，先檢查鍋內(nèi)是否有蒸餾水，以防高壓時(shí)燒干，水不能過多因?yàn)槠鋵⑹箍諝饬鲿呈茏瑁?會(huì)降低高壓消毒效果。 檢查安全閥是否通暢， 壓時(shí)爆炸。2. 安裝濾膜時(shí)注意光面朝上：注意濾膜光滑一面是正面，要朝上，否則起不到過濾的作用。3. 注意人體的防護(hù)和器皿的完全浸泡：A.泡酸時(shí)要戴耐酸手套，防止酸液濺起傷害人體。氣泡，以防止泡酸不徹底。四、細(xì)胞培養(yǎng)用液的配制與消毒 器材與試劑： 干粉型培養(yǎng)基、 胰蛋白酶， 青霉素、 鏈霉素 . 純凈水系統(tǒng)、 電子天平、 PH 計(jì)、 磁力攪拌器。具體步驟：一）水的制備： 細(xì)胞培養(yǎng)用水必須非常純

10、凈， 不含有離子和其他的雜質(zhì)。 需要用新鮮的雙蒸水、 三蒸水或純 凈水（二） PBS的制備與消毒（也可用于其它 BSS,如：Hanks , D-Hanks 液的配制）:1. 溶解定容：將藥品( Nacl 8.0g ， Kcl 0.2g ， Na2HPO4?H2O1.56g ， KH2PO40.2g )倒 入盛有雙蒸水的燒杯中，玻璃棒攪動(dòng)，充分溶解，然后把溶液倒入容量瓶中準(zhǔn)確定容至1000ml ，搖勻即成新配制的 PBS 溶液。2. 移入溶液瓶內(nèi)待消毒：將 PBS 倒入溶液瓶（大的吊針瓶）內(nèi)，蓋上膠帽，并插上針頭放 入高壓鍋內(nèi) 8 磅消毒 20 分鐘。注意高壓消毒后要用滅菌蒸餾水補(bǔ)充蒸發(fā)掉的水份

11、。三）胰蛋白酶溶液的配制與消毒：胰蛋白酶的作用是使細(xì)胞間的蛋白質(zhì)水解從而使細(xì)胞離散。不同的組織或者細(xì)胞對胰酶的作用反應(yīng)不一樣。胰酶分散細(xì)胞的活性還與其濃度、溫度和作用時(shí)間有關(guān)，在pH 為 8.0 、溫度為37C時(shí)，胰酶溶液的作用能力最強(qiáng)。使用胰酶時(shí)，應(yīng)把握好濃度、溫度和時(shí)間，以免消化過度造成細(xì)胞損傷。因 Ca2+ 、 Mg2+ 和血清、蛋白質(zhì)可降低胰酶的活性，所以配制胰酶溶液時(shí)應(yīng)選用不含 Ca2+、Mg2+的BSS，如：D-Hanks液。終止消化時(shí)，可用含有血清培養(yǎng)液或者胰酶抑制劑終止胰酶對細(xì)胞的作用。1.稱取胰蛋白酶：按胰蛋白酶液濃度為 0.25 ，用電子天平準(zhǔn)確稱取粉劑溶入小燒杯中的雙蒸水

12、（若用雙蒸水需要調(diào) PH 到 7.2 左右）或 PBS（D-hanks ）液中。 攪拌混勻， 置于 4C內(nèi)過夜。2.用注射濾器抽濾消毒：配好的胰酶溶液要在超凈臺(tái)內(nèi)用注射濾器（0.22 微米微孔濾膜）抽濾除菌。然后分裝成小瓶于 -20 C保存以備使用。四）青、鏈霉素溶液的配制于消毒1 .所用純凈水（雙蒸水）需要15 磅高壓 20 分鐘滅菌。2.具體操作均在超凈臺(tái)內(nèi)完成。青霉素是 80 萬單位/瓶，用注射器加 4ml 滅菌雙蒸水。鏈霉素是 100 萬單位/瓶，加 5ml 滅菌雙蒸水，即每毫升各為 20萬單位。3.使用時(shí)溶入培養(yǎng)液中，使青鏈霉素的濃度最終為100 單位 /ml。1單位=1微克?五）

13、RPMI1640 的制備與消毒：的雙蒸水中，并用雙蒸水沖1. 溶解、調(diào) PH 值、定容：先將培養(yǎng)基粉劑加入培養(yǎng)液體積 2/30.5ml ，使青鏈霉素的洗包裝袋 2-3 次 （沖洗液一并加入培養(yǎng)基中 ），充分?jǐn)嚢柚练蹌┤咳芙猓?并按照包裝說明添 加一定的藥品。 然后用注射器向培養(yǎng)基中加入配制好的青鏈霉素液各濃度最終各為100單位/ml。然后用一個(gè)當(dāng)量的鹽酸和NaOH調(diào)PH到7.2左右。最后定容至 1000ml ，搖勻。2. 安裝蔡式濾器： 安裝時(shí)先裝好支架， 按規(guī)定放好濾膜， 用螺絲將不銹鋼濾器和支架連接好。然后卸下支架腿分別用布包好待消毒。3. 抽濾：配制好的培養(yǎng)液通常用濾器過濾除菌。通常用

14、蔡式濾器在超凈工作臺(tái)內(nèi)過濾。4. 分裝：將過濾好的培養(yǎng)液分裝入小瓶內(nèi)置于4 C冰箱內(nèi)待用。5.使用前要向100ml培養(yǎng)液中加入1ml谷氨酰胺溶液（4 C時(shí)兩周有效）。六）血清的滅活：細(xì)胞培養(yǎng)常用的是小牛血清，新買來的血清要在56 C水浴中滅火30分鐘后，再經(jīng)過抽濾方可加入培養(yǎng)基中使用。七）HEPES 溶液：HEPES 的化學(xué)全稱位羥乙基呱嗪乙硫磺酸（N -a-hydroxythylpiperazine-N-ethanesulfanicacid ）。對細(xì)胞無毒性作用。它是一種氫離子緩沖劑，能較長時(shí)間控制恒定的 pH 范圍。使用終濃度為 10-50mmol/L般培養(yǎng)液內(nèi)含20mmol/LHEPES

15、 即可達(dá)到緩沖能力。1mol/LHEPE 緩沖液配制方法如下：準(zhǔn)確稱取HEPTS238.3g ，加入新鮮三蒸水定容至1L。過濾除菌，分裝后 4C保存。注意：因?yàn)楝F(xiàn)在市售 HEPES為約10g包裝的小瓶，所以可根據(jù)實(shí)際情況靈活配制，但是要保證培養(yǎng)液內(nèi) HEPES 的終濃度仍然為20mmol/L 。如：稱取4.766 克 HEPES 溶于 20ml 三蒸水中，過濾除菌后可完全（ 20ml ）加入 1L 培養(yǎng)液中，或者每 100ml 培養(yǎng)液中加入 2ml 即可。八）谷氨酰胺：合成培養(yǎng)基中都含有較大量的谷氨酰胺， 其作用非常重要， 細(xì)胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白質(zhì)，谷氨酰胺缺乏要導(dǎo)致細(xì)胞生長不良甚至死

16、亡。 在配制各種培養(yǎng)液中都應(yīng)該補(bǔ)加一定量的谷氨酰胺。由于谷氨酰胺在溶液中很不穩(wěn)定，4 C下放置1周可分解50 %，故應(yīng)單獨(dú)配制，置于-20 C冰箱中保存，用前加入培養(yǎng)液。加有谷氨酰胺的培養(yǎng)液在4C冰箱中儲(chǔ)存2周以上時(shí)，應(yīng)重新加入原來的谷氨酰胺。一般培養(yǎng)液中谷氨酰胺的含量為1 4mmol/L 。可以配制 200mmol/L 谷氨酰胺液貯存，用時(shí)加入培養(yǎng)液。配制方法為，谷氨酰胺2.922g溶于三蒸水加至 100ml 即配成 200mmol/L 的溶液，充分?jǐn)嚢枞芙夂?，過濾除菌，分裝小瓶，-20 C保存，使用時(shí)可向 100ml培養(yǎng)液中加入1ml谷氨酰胺溶液。九）肝素溶液的配制：含有肝素的培養(yǎng)液可以使

17、內(nèi)皮細(xì)胞純度提高，肝素加入全培養(yǎng)液中最終濃度為50ug/ml 。因?yàn)楝F(xiàn)在市售的多為肝素鈉，包裝為約為 0.56 克/瓶，配制時(shí)，可將其溶于100ml 三蒸水中，定容，過夜，然后過濾除菌，分裝小瓶，保存溫度為C。使用時(shí)，向100ml 培養(yǎng)液中加入 1ml （精確可加入 0.9ml ）即可。（十）1型膠原酶:0.1 %1型膠原酶溶液同胰蛋白酶一樣配制和消毒滅菌。注意：因?yàn)镮型膠原酶分子顆粒比胰酶大，不容易過濾，因此可以用蔡式濾器過濾除菌。分裝入10ml小瓶-20 C保存。十一）明膠溶液：因?yàn)槊髂z難于過濾， 所以配制 0.1 %明膠溶液必須用無菌的PBS 配制。 所以制備過程中必須要注意無菌操作。首

18、要的問題是如何無菌準(zhǔn)確稱量0.1 克配成 100ml 溶液）即解決無菌分裝藥品的問題。其次要注意即使是 0.1 的溶液，明膠也難溶，因此要充分搖勻，過夜放 置，然后無菌分裝入 50ml小瓶中，4C保存。十二）其他培養(yǎng)用液的配制：20ug/ml 內(nèi)皮生長因子注意事項(xiàng)：1. 配制溶液時(shí)必須用新鮮的蒸餾水。2. 安裝蔡式濾器時(shí)通常使用孔徑 0.45 微米和 0.22 微米濾膜各一張，放置位置為 0.45 的位 于 0.22 微米的濾膜上方，并且要特別注意濾膜光面朝上。3. 配制 RPMI1640 培養(yǎng)基時(shí)因?yàn)檫€要加入小牛血清，而小牛血清略偏酸性，為了保證培養(yǎng) 液 PH 值最終為 7.2 ，可在配制時(shí)

19、調(diào) PH 至 7.4 。五、細(xì)胞傳代培養(yǎng)（消化法） 具體操作：一）傳代前準(zhǔn)備：1. 預(yù)熱培養(yǎng)用液：把已經(jīng)配制好的裝有培養(yǎng)液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入 37 C水浴鍋內(nèi)預(yù)熱。2. 用 75 酒精擦拭經(jīng)過紫外線照射的超凈工作臺(tái)和雙手。3. 正確擺放使用的器械：保證足夠的操作空間，不僅便于操作而且可減少污染。8 分鐘再次消毒。？4. 點(diǎn)燃酒精燈：注意火焰不能太小。5. 準(zhǔn)備好將要使用的消毒后的空培養(yǎng)瓶，放入微波爐內(nèi)高火，6. 取出預(yù)熱好的培養(yǎng)用液： 取出已經(jīng)預(yù)熱好的培養(yǎng)用液， 用酒精棉球擦拭好后方能放入超凈 臺(tái)內(nèi)。7.從培養(yǎng)箱內(nèi)取出細(xì)胞：注意取出細(xì)胞時(shí)要旋緊瓶蓋，用酒精棉球擦拭顯微鏡的臺(tái)面，再在

20、鏡下觀察細(xì)胞。8.打開瓶口：將各瓶口一一打開，同時(shí)要在酒精燈上燒口消毒。二）胰蛋白酶消化；1. 加入消化液： 小心吸出舊培養(yǎng)液， 用 PBS 清洗（沖洗） ，加入適量消化液 （胰蛋白酶液）注意消化液的量以蓋住細(xì)胞最好，最佳消化溫度是37 C。2. 顯微鏡下觀察細(xì)胞：倒置顯微鏡下觀察消化細(xì)胞，若胞質(zhì)回縮，細(xì)胞之間不再連接成片，表明此時(shí)細(xì)胞消化適度。3. 吸棄消化液加入培養(yǎng)液：棄去胰蛋白酶液，注意更換吸管，加入新鮮的培養(yǎng)液。三）吹打分散細(xì)胞：1. 吹打制懸：用滴管將已經(jīng)消化細(xì)胞吹打成細(xì)胞懸液。2. 吸細(xì)胞懸液入離心管：將細(xì)胞懸液吸入 10ml 離心管中。3.平衡離心：平衡后將離心管放入臺(tái)式離心機(jī)中

21、，以1000 轉(zhuǎn)/ 分鐘離心 6-8 分鐘。4. 棄上清液，加入新培養(yǎng)液：棄去上清液，加入 2ml 培養(yǎng)液，用滴管輕輕吹打細(xì)胞制成細(xì) 胞懸液。四）分裝稀釋細(xì)胞：1. 分裝：將細(xì)胞懸液吸出分裝至2-3 個(gè)培養(yǎng)瓶中，加入適量培養(yǎng)基旋緊瓶蓋。2. 顯微鏡下觀察細(xì)胞：倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞量，必要是計(jì)數(shù)。注意密度過小會(huì)影響傳代細(xì)胞的生長，傳代細(xì)胞的密度應(yīng)該不低于5 xi05/ml。最后要做好標(biāo)記。五）繼續(xù)培養(yǎng)： 用酒精棉球擦拭培養(yǎng)瓶，適當(dāng)旋松瓶蓋，放入 CO2 培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。傳代細(xì)胞 2 小時(shí)后 開始貼附在瓶壁上。 當(dāng)生長細(xì)胞鋪展面積占培養(yǎng)瓶底面積 25 時(shí)為一個(gè)， 占 50 為， 占 75 時(shí)為。

22、傳代細(xì)胞培養(yǎng)注意事項(xiàng)：1. 嚴(yán)格的無菌操作2. 適度消化： 消化的時(shí)間受消化液的種類、 配制時(shí)間、加入培養(yǎng)瓶中的量等諸多因素的影響，消化過程中應(yīng)該注意培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)的變化，一旦胞質(zhì)回縮， 連接變松散， 或有成片浮起的跡象就要立即終止消化。附：EDTA（ 0.02 %乙二胺四乙酸二鈉）消化液配方：EDTA 0.20g , NaCI 8.00g , KCI0.20g ,KH2PO40.02g ，葡萄糖 2.00g ， 0.5酚紅 4ml ，加入蒸餾水定容至 1000ml 。10 磅 20min高壓滅菌，使用時(shí)調(diào)節(jié) PH 值到 7.4 。注意 EDTA 不能被血清中和，使用后培養(yǎng)瓶要徹底清 洗，否則再

23、培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞容易脫壁。六、細(xì)胞的復(fù)蘇細(xì)胞復(fù)蘇的原則快速融化：必須將凍存在-196 C液氮中的細(xì)胞快速融化至37 C,使細(xì)胞外凍存時(shí)的冰晶迅速融化，避免冰晶緩慢融化時(shí)進(jìn)入細(xì)胞形成再結(jié)晶，對細(xì)胞造成損害。具體操作一）實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備：1.將水浴鍋預(yù)熱至37 C2. 用 75 %酒精擦拭紫外線照射30min 的超凈工作臺(tái)臺(tái)面。3 .在超凈工作臺(tái)中按次序擺放好消過毒的離心管、吸管、培養(yǎng)瓶等等。二）取出凍存管：1. 根據(jù)細(xì)胞凍存記錄按標(biāo)簽找到所需細(xì)胞的編號。2 .從液氮罐中取出細(xì)胞盒，取出所需的細(xì)胞，同時(shí)核對管外的編號。三）迅速解凍：并要不斷的搖動(dòng)， 使管中的液體迅速1. 迅速將凍存管投入到已經(jīng)預(yù)熱的水浴鍋中迅

24、速解凍， 融化。2. 約 1-2min 后凍存管內(nèi)液體完全溶解，取出用酒精棉球擦拭凍存管的外壁，再拿入超凈臺(tái) 內(nèi)。四）平衡離心： 用架盤天平平衡后，放入離心機(jī)中 3000r/min 離心 3min五）制備細(xì)胞懸液：1.吸棄上清液。2. 向離心管內(nèi)加入 10ml 培養(yǎng)液，吹打制成細(xì)胞懸液。六）細(xì)胞計(jì)數(shù)： 細(xì)胞濃度以5 xi05/ml為宜。37 C和5 % CO2的培養(yǎng)箱七）培養(yǎng)細(xì)胞 將復(fù)合細(xì)胞計(jì)數(shù)要求的細(xì)胞懸液分裝入培養(yǎng)瓶內(nèi)，將培養(yǎng)瓶放入 內(nèi) 2-4 小時(shí)（或者 24-48 小時(shí)）后換液繼續(xù)培養(yǎng)培養(yǎng)，換液的時(shí)間由細(xì)胞情況而定。初學(xué)者易犯錯(cuò)誤：1水浴鍋未預(yù)熱或者未預(yù)熱到37 C。2.水浴鍋內(nèi)凍存管

25、太多，導(dǎo)致傳熱不佳，使融化時(shí)間延長。3. 離心前忘記平衡，導(dǎo)致離心機(jī)損壞和細(xì)胞丟失。4. 一次復(fù)蘇細(xì)胞過多，忘記更換吸頭和吸管，導(dǎo)致細(xì)胞交叉污染。七、細(xì)胞計(jì)數(shù) 實(shí)驗(yàn)原理： 當(dāng)待測細(xì)胞懸液中細(xì)胞均勻分布時(shí)， 通過測定一定體積懸液中的細(xì)胞的數(shù)目， 即 可換算出每毫升細(xì)胞懸液中細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)目。具體操作：一）準(zhǔn)備工作： 取一瓶傳代的細(xì)胞，按照傳代細(xì)胞培養(yǎng)（消化法）中的傳代方法繁殖細(xì)胞，待長成單層 后以被使用。二）細(xì)胞懸液制備：細(xì)胞懸液的制備方法是用0.25 %的胰蛋白酶液消化、PBS液洗滌后，加入培養(yǎng)液（或Hanks 液或 PBS 等平衡鹽溶液），吹打制成待測細(xì)胞懸液。三）細(xì)胞計(jì)數(shù)：1.蓋好蓋玻片：取

26、一套血球計(jì)數(shù)板，將特制的蓋玻片蓋在血球計(jì)數(shù)槽上。2 .制備計(jì)數(shù)用的細(xì)胞懸液： 用吸管吸 5滴細(xì)胞懸液到一離心管中， 加入 5滴臺(tái)盼藍(lán)染液（0.4）或苯胺黑，活細(xì)胞不會(huì)被染色，加入染液后就可以在顯微鏡下區(qū)別活細(xì)胞和死細(xì)胞。3 .將細(xì)胞懸液滴入計(jì)數(shù)板： 將待測細(xì)胞懸液吹均勻， 然后吸取少量懸液沿蓋片邊緣緩緩滴入， 要保證蓋片下充滿懸液，注意蓋片下不要有氣泡，也不能讓懸液流入旁邊槽中。16 個(gè)中鉻）中沒有被染液染4. 統(tǒng)計(jì)四個(gè)大格的細(xì)胞數(shù)：將血球計(jì)數(shù)板放于顯微鏡的低倍鏡下觀察，并移動(dòng)計(jì)數(shù)板，當(dāng)看到鏡中出現(xiàn)計(jì)數(shù)方格后，數(shù)出四角的四個(gè)大鉻（每個(gè)大格含有 上色的細(xì)胞數(shù)目。5. 計(jì)算原細(xì)胞懸液的細(xì)胞數(shù) :按照下面公式計(jì)算細(xì)胞密度：（細(xì)胞懸液的細(xì)胞數(shù)）