《PCR技術(shù)簡(jiǎn)介》PPT課件.ppt

1、PCR技術(shù)簡(jiǎn)介,主要內(nèi)容,PCR RT-PCR（reverse transcriptional-PCR） 瓊脂糖凝膠電泳,PCR的概念,PCR（polymerase chain reaction）即聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)，它是以待擴(kuò)增的兩條DNA鏈為模板，在一對(duì)人工合成的寡核苷酸引物的介導(dǎo)下，利用耐熱DNA聚合酶的酶促作用，通過(guò)變性-復(fù)性-延伸的循環(huán)操作，快速特異地?cái)U(kuò)增出特定的DNA片斷,DNA的復(fù)制 核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想 1985年Mullis等人發(fā)明了聚合酶鏈反應(yīng)（PCR） 耐熱DNA聚合酶的應(yīng)用使得PCR能高效率的進(jìn)行，隨后誕生了第一臺(tái)PCR自動(dòng)化熱循環(huán)儀 1989年美國(guó)Science雜志列PC

2、R為十余項(xiàng)重大科學(xué)發(fā)明之首,比喻1989年為PCR爆炸年 1993年，Mullis等因此項(xiàng)技術(shù)獲諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng),PCR技術(shù)簡(jiǎn)史,PCR的原理,PCR反應(yīng)時(shí)，一般采用變性-復(fù)性-延伸三步循環(huán)。 1變性：通常采用加熱變性，即將模板DNA或延伸后的雙鏈DNA加熱到940C，使雙螺旋DNA解開(kāi)成為單鏈,2復(fù)性（退火）：通過(guò)降低反應(yīng)溫度至45-700C，使兩種引物能與兩條解開(kāi)的DNA互補(bǔ)鏈的3端粘合,PCR的原理,PCR的主要用途,目的基因的克隆 基因的體外突變 生成大量DNA以進(jìn)行序列測(cè)定 特異基因表達(dá)量分析,PCR反應(yīng)體系,20ul；25ul；50ul,PCR實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備試劑,Taq酶 0.5-2.5 U

3、/50 l（通常2.5 U/50 l ） 酶量增加使反應(yīng)特異性下降;酶量過(guò)少影響反應(yīng)產(chǎn)量 從生物公司購(gòu)買：生工；華美；Takara;Promega; 與buffer,mg2+成套出售,Mg2+ Mg2+是DNA聚合酶的激活劑 1.5mmol/L-2.5mmol/L反應(yīng)體系（通常4 l/50 l ） Mg2+濃度過(guò)低會(huì)使Taq酶活性喪失、PCR產(chǎn)量下降； Mg2+過(guò)高影響反應(yīng)特異性,PCR實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備試劑,PCR實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備試劑,Buffer 提供合適的PH值 有10buffer和2buffer 有的buffer中含有mg2+，有的buffer中不含有mg2,PCR實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備試劑,dNTP dATP，dT

4、TP， dGTP ，dCTP 可以購(gòu)買dNTP混合液，也可以購(gòu)買dATP，dTTP， dGTP ，dCTP等體積混合 四種dNTP濃度應(yīng)相等 每種200umol/L（通常4 l/50 l ） 濃度過(guò)高易產(chǎn)生錯(cuò)誤堿基的摻入，濃度過(guò)低則降低反應(yīng)產(chǎn)量,PCR實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備試劑,模板（DNA或cDNA） 單、雙鏈DNA均可 不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制劑、DNA結(jié)合蛋白類 一般50ng DNA模板/50L 模板濃度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)的非特異性增加 提取細(xì)胞或組織中的基因組DNA,PCR實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備試劑,ddH2O 滅菌的去離子水或雙蒸水,PCR實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備試劑,引物 0.1-0.5 mol/L（通常10pm

5、ol的引物2ul/50ul） 濃度過(guò)高易導(dǎo)致模板與引物錯(cuò)配，反應(yīng)特異性下降 利用軟件（Omiga、Primer primier）設(shè)計(jì)引物后，由生物公司（生工、賽百盛）合成，收到合成完畢的引物后根據(jù)說(shuō)明對(duì)引物進(jìn)行稀釋，一般稀釋成10pmol使用 引物設(shè)計(jì)中需關(guān)注的有上下游引物之間的長(zhǎng)度，即將來(lái)PCR產(chǎn)物的大?。灰约吧舷掠我锏腡m值，即將來(lái)PCR中的退火溫度,PCR實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備-試劑,引物設(shè)計(jì)原則： 1.長(zhǎng)度以1530個(gè)堿基為宜 2.正向反向兩條引物鏈之間的距離適中，一般使擴(kuò)增出的片斷在300-1100bp之間。如果使用RT-PCR檢測(cè)RNA病毒，引物間距離以500bp最佳。片斷過(guò)短影響結(jié)果判定，過(guò)

6、長(zhǎng)則不易擴(kuò)增 3.引物堿基組成應(yīng)隨機(jī)分布，G+C含量在45-55為宜。過(guò)高或過(guò)低都不利于引發(fā)反應(yīng)。上下游引物的GC含量不能相差太大 4.引物自身不形成二級(jí)結(jié)構(gòu)，引物間沒(méi)有互補(bǔ)序列（4個(gè)堿基以上），引物間3端的互補(bǔ)、二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)也可能導(dǎo)致PCR反應(yīng)失敗 5.引物序列具有特異性 6.引物3端堿基與模板DNA一定要配對(duì)，并且3末端堿基最好選T、 C或者G，不選A。因?yàn)锳在錯(cuò)誤引發(fā)位點(diǎn)的引發(fā)效率相對(duì)比較高,PCR實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備-儀器、耗材,PCR儀 移液器 吸頭 200ul PCR管 EP管架 槍頭盒 PCR板 冰盒,重復(fù)13步 2530輪,目的DNA片段 擴(kuò)增100萬(wàn)倍以上,DNA雙螺旋,DNA單鏈

7、與引物復(fù)性,DNA變性 形成2條單鏈,子鏈延伸 DNA加倍,PCR反應(yīng)程序,PCR反應(yīng)程序,變性溫度:94C or 95C ,不變； 延伸溫度：72C，不變； 退火溫度：50C左右，可變，Tm值-5,延伸時(shí)間：30-60s，與PCR產(chǎn)物的大小有關(guān)，參考酶的延伸效率（通常1000bp/min,PCR反應(yīng)程序,1) 94變性3min， (2) 94變性30sec， (3) 52 退火30sec， (4) 72 延伸1min。 (5) goto(2)repeat29, （6）72 延伸10min。 （7）hold at 4,PCR操作過(guò)程,混勻，瞬時(shí)離心3-5sec,PCR操作過(guò)程,PCR操作過(guò)程,

8、RT-PCR（reverse transcriptional-PCR,RT-PCR原理,RT-PCR主要用途,檢測(cè)特異基因的表達(dá)量 特異基因的組織定位 構(gòu)建cDNA文庫(kù) 鑒定已轉(zhuǎn)錄序列是否發(fā)生突變,RT-PCR反應(yīng)體系,一步法RT-PCR,RT-PCR反應(yīng)體系,兩步法RT-PCR,cDNA PCR擴(kuò)增,cDNA第一鏈合成反應(yīng),RT-PCR的準(zhǔn)備-試劑,提取細(xì)胞或組織中RNA 購(gòu)買RT-PCR試劑盒（一步法或兩步法,RT-PCR的準(zhǔn)備-耗材、儀器,超凈臺(tái) PCR儀 移液器 吸頭 200ul PCR管 EP管架 槍頭盒 PCR板 冰盒,RT-PCR過(guò)程中cDNA第一鏈合成反應(yīng)所用的槍頭、槍頭盒、P

9、CR管等塑料制品均提前用氯仿進(jìn)行處理，高壓滅菌后使用。玻璃制品在180干烤6-8小時(shí)。加樣過(guò)程在超凈臺(tái)內(nèi)進(jìn)行，需戴手套與口罩。 cDNA PCR擴(kuò)增的準(zhǔn)備工作同普通PCR反應(yīng),RT-PCR反應(yīng)程序,1) 4230min， (2) 943min， (3) 94變性3min， (4) 94變性30sec， (5) 52 退火30sec， (6) 72 延伸1min。 (7) goto(4)repeat29, （8）72 延伸10min。 （9）hold at 4,RT-PCR操作過(guò)程,cDNA第一鏈合成反應(yīng)所用槍頭、槍頭盒、PCR管等塑料制品均提前用氯仿進(jìn)行處理，高壓滅菌后使用。玻璃制品在180干

10、烤6-8小時(shí)。在超凈臺(tái)內(nèi)按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行加樣，加樣過(guò)程需戴手套與口罩。 cDNA PCR擴(kuò)增的準(zhǔn)備工作同普通PCR反應(yīng)。 在PCR儀上設(shè)定程序進(jìn)行反應(yīng),瓊脂糖凝膠電泳的原理,瓊脂糖凝膠電泳是分離鑒定核酸片段的有效方法，瓊脂糖溶化再凝固后能形成帶有一定孔隙的固體基質(zhì)的特性，利用電荷效應(yīng)，在電場(chǎng)的作用下及中性pH的緩沖條件下，帶負(fù)電的核酸分子向正極遷移。利用分子篩效應(yīng)可以分離不同片斷大小和不同構(gòu)象的DNA、RNA分子,瓊脂糖凝膠電泳的主要用途,分離不同片斷大小和不同構(gòu)象的DNA、RNA分子。 鑒定DNA片段，如PCR產(chǎn)物的鑒定。 純化DNA分子,瓊脂糖凝膠電泳的準(zhǔn)備-試劑,瓊脂糖 電泳緩沖液：T

11、ris，冰乙酸，EDTA（TAE） 6X載樣緩沖液（Load buffer）：溴酚藍(lán)，蔗糖 染色液：goldview DNA或RNA樣品 DNA分子量marker,瓊脂糖凝膠電泳的準(zhǔn)備-儀器、耗材,電泳儀 電泳槽 微波爐 三角瓶 移液器 電子天平 槍頭 凝膠成像系統(tǒng),瓊脂糖凝膠電泳的操作過(guò)程,1g 瓊脂糖加入100ml 1TAE電泳緩沖液中，搖勻。在微波爐中加熱至瓊脂糖完全溶解。（冷卻到60，加入5l的goldview，并搖勻。） 裝好制膠板，插入適當(dāng)梳子，將溶解的瓊脂糖（約50）倒入，室溫冷卻凝固。 充分凝固后，小心垂直向上拔出梳子，將凝膠置入電泳槽中，加1TAE電泳緩沖液至液面覆蓋凝膠1-2mm,瓊脂糖凝膠電泳的操作過(guò)程,用移液器吸取PCR產(chǎn)物10