(最新整理)CCK8實(shí)驗(yàn)原理與步驟

1、(完整)cck8實(shí)驗(yàn)原理與步驟(完整)cck8實(shí)驗(yàn)原理與步驟 編輯整理：尊敬的讀者朋友們：這里是精品文檔編輯中心，本文檔內(nèi)容是由我和我的同事精心編輯整理后發(fā)布的，發(fā)布之前我們對(duì)文中內(nèi)容進(jìn)行仔細(xì)校對(duì)，但是難免會(huì)有疏漏的地方，但是任然希望（(完整)cck8實(shí)驗(yàn)原理與步驟）的內(nèi)容能夠給您的工作和學(xué)習(xí)帶來(lái)便利。同時(shí)也真誠(chéng)的希望收到您的建議和反饋，這將是我們進(jìn)步的源泉，前進(jìn)的動(dòng)力。本文可編輯可修改，如果覺(jué)得對(duì)您有幫助請(qǐng)收藏以便隨時(shí)查閱，最后祝您生活愉快 業(yè)績(jī)進(jìn)步，以下為(完整)cck8實(shí)驗(yàn)原理與步驟的全部?jī)?nèi)容。cck8實(shí)驗(yàn)1、在96孔板中配置100l的細(xì)胞懸液.將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng)24小時(shí)（37，5

2、co2）。2、向培養(yǎng)板加入10l不同濃度的待測(cè)物質(zhì)。3、將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱孵育一段適當(dāng)?shù)臅r(shí)間(例如：6、12、24或48小時(shí)）。4、向每孔加入10l cck8溶液（注意不要在孔中生成氣泡，它們會(huì)影響od值的讀數(shù))。5、將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1-4小時(shí)。6、用酶標(biāo)儀測(cè)定在450nm處的吸光度。7、若暫時(shí)不測(cè)定od值,可以向每孔中加入10l 0.1m的hcl溶液或者1% w/v sds溶液,并遮蓋培養(yǎng)板避光保存在室溫條件下.24小時(shí)內(nèi)測(cè)定,吸光度不會(huì)發(fā)生變化。ps：1 w/v sds溶液配制方法：組份濃度：10% （w/v)sds配制量：100ml配制方法：1。稱(chēng)量10g高純度的sds置于10020

3、0ml燒杯中，加入約80ml的去離子水，68加入溶解2。滴加濃鹽酸調(diào)節(jié)ph值至7.23。將溶液定容至100ml后，室溫保存。注意:如果待測(cè)物質(zhì)有氧化性或還原性的話(huà)，可在加cck8之前更換新鮮培養(yǎng)基(除去培養(yǎng)基，并用培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞兩次,然后加入新的培養(yǎng)基)，去掉藥物影響。當(dāng)然藥物影響比較小的情況下,可以不更換培養(yǎng)基，直接扣除培養(yǎng)基中加入藥物后的空白吸收即可?；盍τ?jì)算：細(xì)胞活力（）=a(加藥)-a（空白）/a（0加藥)a（空白） 100a（加藥）：具有細(xì)胞、cck8溶液和藥物溶液的孔的吸光度a（空白）：具有培養(yǎng)基和cck8溶液而沒(méi)有細(xì)胞的孔的吸光度a(0加藥):具有細(xì)胞、cck8溶液而沒(méi)有藥物溶液

4、的孔的吸光度*細(xì)胞活力:細(xì)胞增殖活力或細(xì)胞毒性活力cck8 可以用于細(xì)胞增殖和毒性分析.其基本原理為:該試劑中含有wst-8，它在電子載體(1-methoxy pms）的作用下被細(xì)胞線粒體中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚染料，生成的甲瓚物的數(shù)量與活細(xì)胞的數(shù)量成正比，因此可以用這一特性直接進(jìn)行細(xì)胞增殖和毒性分析.其使用方法在增殖和毒性試驗(yàn)中有所區(qū)別:細(xì)胞增殖試驗(yàn)：1。接種細(xì)胞懸液100微升于96孔板,預(yù)先置于37度，5%co2飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2。在每孔內(nèi)加入10微升的cck-8試劑。3。把培養(yǎng)板放培養(yǎng)箱內(nèi)1-4小時(shí)(根據(jù)細(xì)胞類(lèi)型其時(shí)間有所不同)4 在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值,參比

5、波長(zhǎng)為600nm或以上波長(zhǎng)。毒性分析試驗(yàn)：1。接種100微升細(xì)胞懸液(5000個(gè)/孔）于96孔板2。預(yù)先放置37度5%co2飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時(shí)3.加入10微升不同濃度的毒性物質(zhì)到孔內(nèi)培養(yǎng)基4.在培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48小時(shí).5。在每孔內(nèi)加入10微升cck-8試劑,在培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)1-4小時(shí)；6在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值，參比波長(zhǎng)為600nm或以上。以上步驟摘自cck8的說(shuō)明書(shū),由于涉及到某些原因，我省去了上面的一些推銷(xiāo)用語(yǔ))（內(nèi)有標(biāo)價(jià)，1245元/1000孔)寫(xiě)在前面：一直都像個(gè)新手，從未老道過(guò)。所有新手的迷茫與無(wú)奈我最能體會(huì)?？吹綀@子里有一些同學(xué)在問(wèn)有關(guān)cck8試驗(yàn)的事情,當(dāng)初我也和他們一樣

6、，像個(gè)被蜘蛛絲纏住頭的迷茫蒼蠅一頭扎進(jìn)園子里，期待能找到些解決謎團(tuán)的只言片語(yǔ)。希望我寫(xiě)的這些非專(zhuān)業(yè)文字能夠幫助那些在實(shí)驗(yàn)室里沒(méi)有前行者指點(diǎn)迷津的筒子們。當(dāng)然仁者見(jiàn)仁智者見(jiàn)智，我寫(xiě)的只是個(gè)人實(shí)驗(yàn)心得，僅供參考.歡迎大家拍磚共同進(jìn)步。實(shí)驗(yàn)是簡(jiǎn)單的,道路是曲折的，時(shí)間就是用來(lái)浪費(fèi)的，科研就是自?shī)首詷?lè)使勁折騰.我沒(méi)有做過(guò)mtt實(shí)驗(yàn)，但其實(shí)原理及目的都是一樣的(反應(yīng)機(jī)理不一樣）.都說(shuō)cck8簡(jiǎn)單點(diǎn)而且數(shù)據(jù)更穩(wěn)定，所以就用了這個(gè)試劑盒。cck8的說(shuō)明書(shū)大家一定要認(rèn)真閱讀，里面很多細(xì)節(jié)的問(wèn)題都有提到。而且說(shuō)明書(shū)里提供的一些關(guān)于各種細(xì)胞的種板數(shù)都很有參考價(jià)值，因?yàn)槟鞘欠磸?fù)驗(yàn)證過(guò)的最佳數(shù)值。但無(wú)論如何，做這個(gè)試

7、驗(yàn)一定要摸條件.你就算再懶，這個(gè)懶不得,否則你都只是在做無(wú)用功.以下言論全部以細(xì)胞毒性試驗(yàn)為前提，如果你做的是促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)的藥物的藥效實(shí)驗(yàn)?zāi)蔷土懋?dāng)別論了。摸條件包括1、種板數(shù)；2、種板后細(xì)胞的貼壁生長(zhǎng)時(shí)間；3、加藥后的孵育時(shí)間;4、cck8試劑加入量；5、cck8試劑加入后細(xì)胞孵育時(shí)間?？雌饋?lái)很多，其實(shí)這就是一個(gè)實(shí)驗(yàn)。而且都是種的空白板，也就是不加藥物,只加細(xì)胞和cck8.1、種板數(shù)：這個(gè)要查文獻(xiàn)，看你所用細(xì)胞別人有無(wú)做過(guò),把范圍大致找出。記住還要參考說(shuō)明書(shū),這個(gè)很重要。然后稀釋一系列濃度種板.首先你要觀察多長(zhǎng)時(shí)間細(xì)胞可貼壁完全，一般貼壁生長(zhǎng)24小時(shí)。然后還有在你的實(shí)驗(yàn)時(shí)間內(nèi)，不同細(xì)胞數(shù)下孔內(nèi)

8、生長(zhǎng)情況。比如我擬定考察4天的時(shí)間，那么在4天內(nèi),細(xì)胞是剛好鋪滿(mǎn)還是堆積生長(zhǎng)？因?yàn)槊繅K板都會(huì)設(shè)置對(duì)照孔，也就是含有細(xì)胞的培養(yǎng)基+cck8，這個(gè)數(shù)值是板上的最大數(shù)值,cck8試驗(yàn)最佳od值在1.0附近,所以這個(gè)最大數(shù)值最好能控制在1。0左右。我的實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)是不要讓細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)，一旦長(zhǎng)滿(mǎn)了很難去判斷是否堆積生長(zhǎng)了，對(duì)藥物能否順利進(jìn)入細(xì)胞有影響此為其一，其二生長(zhǎng)不均勻易導(dǎo)致孔間od值數(shù)據(jù)偏差大，而且od值也很大.2、貼壁生長(zhǎng)的時(shí)間我一般就直接讓它貼壁長(zhǎng)24h了，這個(gè)時(shí)間細(xì)胞已經(jīng)貼壁完全，而且這樣設(shè)置時(shí)間對(duì)自己安排實(shí)驗(yàn)時(shí)間也方便。沒(méi)人愿意大半夜爬起來(lái)做實(shí)驗(yàn)吧.3、加藥后的孵育時(shí)間，我的實(shí)驗(yàn)摸了3個(gè)時(shí)間，24

9、h，48h,72h.然后根據(jù)數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性（rsd）、od值的范圍（1.0左右)這些來(lái)選擇最好的時(shí)間。太長(zhǎng)了就沒(méi)有必要了,細(xì)胞呆在孔里幾天不換液結(jié)果可想而知了.4、cck8試劑加入量，說(shuō)明書(shū)中明確寫(xiě)出建議加入量為培養(yǎng)基體積的10。這里有一個(gè)問(wèn)題：假設(shè)我要孔內(nèi)是200微升的體系，即細(xì)胞懸液+藥液+cck8=200微升呢，還是細(xì)胞懸液+藥液=200微升，cck8不算在體系內(nèi)呢。關(guān)于這一點(diǎn)文獻(xiàn)報(bào)道不一致。本人最終采用的是后者。5、cck8試劑加入后孵育時(shí)間，隨著時(shí)間的增加，od值就會(huì)增大。總之原則就是把od值控制在1。0左右。這里我考察了0。5h、1。0h、2。0h。再說(shuō)一下關(guān)于種板設(shè)置問(wèn)題。眾所周知

10、周?chē)蝗滓驗(yàn)檫吘壭?yīng)都是不用來(lái)做實(shí)驗(yàn)的.一般每組樣品我會(huì)設(shè)置6個(gè)復(fù)孔,得到的od值去掉最大值與最小值，其余取平均值。我用的是排槍?zhuān)瑫?huì)省很多力氣，但是也會(huì)增大組內(nèi)誤差。這個(gè)只有通過(guò)校正移液槍和選用最適槍頭了。做這個(gè)實(shí)驗(yàn)我想大家遇到的最大問(wèn)題應(yīng)該是數(shù)據(jù)不穩(wěn)定,組內(nèi)數(shù)據(jù)偏差大.講了很多怎樣摸條件，其實(shí)就一個(gè)原則，把od值控制在1。0左右。數(shù)據(jù)不穩(wěn)定也只能通過(guò)增大樣品數(shù),借助數(shù)據(jù)處理來(lái)彌補(bǔ)。還有實(shí)驗(yàn)操作一定要仔細(xì)小心，盡量平行操作。能力有限，表達(dá)不清的大家湊合著看看吧.有疑問(wèn)的歡迎大家留言討論，我們的目標(biāo)是共同進(jìn)步,哈哈.補(bǔ)充：謝謝大家的熱烈討論.突然想起用酶標(biāo)儀檢測(cè)的時(shí)候還有一些細(xì)節(jié)問(wèn)題，園子里也

11、有前輩提過(guò).比如孔里不能有氣泡，如果有氣泡，就用吸耳球吹掉，氣泡會(huì)很影響檢測(cè)結(jié)果.樣品板要擦拭干凈,當(dāng)然了，蓋子一定要記得拿掉啊補(bǔ)充說(shuō)明：這幾天有同學(xué)提出了一個(gè)問(wèn)題，這個(gè)問(wèn)題非常好也非常關(guān)鍵：將od值控制在1.0這個(gè)說(shuō)法是否有依據(jù)？這里我還是想提醒大家一定要認(rèn)真閱讀試劑盒的說(shuō)明書(shū),試想一個(gè)試劑盒的上市并且作為技術(shù)手段得到認(rèn)可需要經(jīng)過(guò)多少試驗(yàn)反復(fù)驗(yàn)證。我購(gòu)買(mǎi)的是同仁化學(xué)研究所的cck8試劑盒，說(shuō)明書(shū)的p7q23：od值在什么范圍比較合適？答：一般情況下od值在0。12。0都可以,在1。0附近比較好。再說(shuō)到自己的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，酶標(biāo)儀的原理其實(shí)和紫外分光光度計(jì)是一樣的，所以u(píng)v上很多減小誤差的注意事項(xiàng)在酶標(biāo)儀上同樣受用.這就能夠