包涵體的形成以及處理方法

1、包涵體的形成以及處理方法1 包涵體形成的原因(1)表達量過高，研究發(fā)現(xiàn)在低表達時很少形成包涵體，表達量越高越容易形成包涵體L2。原因可能是合成速度太快，以至于沒有足夠的時間進行折疊，二硫鍵不能正確配對，過多蛋白間的非特異性結合，蛋白質無法達到足夠的溶解度等。(2)重組蛋白是大腸桿菌的異源蛋白，真核糖蛋白無法糖基化使中問體溶解度下降，導致不溶解包涵體形成 。(3)重組蛋白分泌序列的存在阻礙折疊，導致錯誤折疊分子的產(chǎn)生。(4)重組蛋白的氨基酸組成，一般來說含硫氨基酸越多越容易形成包涵體。(5)包涵體形成動力學研究表明，包涵體是由部分變性的中閫體聚合而成。因此，任何影響中間體穩(wěn)定的因素，如pH值(p

2、H接近蛋白的等電點時容易形成包涵體)離子強度和溫度都可以引起蛋白聚合反應。(6)在細菌分泌的某個階段，蛋白質分子間的離子鍵、疏水鍵或共價鍵等化學作用導致了包涵體的形成。(7)有報道認為，豐富的培養(yǎng)基有利于活性蛋白質的表達，當培養(yǎng)條件不佳時，容易形成包涵體? 。包涵體的處理包涵體的形成具有有利的一面，也有不利的一面。有利的一面是包涵體的形成去除了幾乎全部的細胞內可溶性蛋白質。同時，因包涵體形成避免了蛋白水解酶對表達產(chǎn)物的降解而大大提高產(chǎn)率，通常其表達量可占菌體總蛋白的10 30 ，甚至高達50。不利的一面是溶解包涵體進行復性折疊的過程中需要加變性劑和去垢劑，而引起蛋白質的不可逆修飾以及性質改變，

3、這些試劑價格昂貴，且復性的操作過程不好控制；另一方面復性過程常伴有蛋白質水解和沉淀，有些還形成異構體【s 5。因此復性是蛋白質工程中最關鍵、最復雜的問題。包涵體的處理一般有如下幾個步聚。破碎細菌細胞提取包涵體時，首先要裂解細菌，為了防止在裂解細菌的過程中目的蛋白質變性，常常采取一些保護措施：合適的緩沖體系，如磷酸鹽緩沖液、Tris緩沖液、檸檬酸緩沖液；加入保護劑，如還原劑DTT(2一巰基蘇糖醇)、2一巰基乙醇；加防止水解酶作用的試劑，如酶的抑制劑、EDTA(乙二胺四乙酸)。破菌的方法很多，主要包括以下幾種：(1)滲透破碎法：這種方法是在低滲條件使細胞溶脹而破碎。(2)冷熱交替法：把待碎樣品投人

4、90 左右水中維持數(shù)分鐘后取出投入冰浴內，可使大部分細胞破碎。可用于提取蛋白質和核酸。(3)反復凍融法：把待碎樣品冷卻到一2O ，凍固后取出，緩慢解凍，如此反復操作，細胞內液結冰膨脹而使細胞脹破導致部分細胞及胞內的顆粒破碎，但也可使生物活性物質失活。這種方法雖簡單方便，但對溫度變化敏感的蛋白質卻不宜采用。(4)超聲波法：使用超聲波儀使細胞膜上所受張力不均而使細胞破碎。根據(jù)不同待碎樣品采用不同頻率，不同時間；另外，超聲波處理時溶液溫度升高會使不耐熱的物質失活，因此使用時為防止溫度升高，除間歇開機外，還需人工降溫。避免溶液內存在氣泡，這樣會使蛋白質變性【6】。(5)溶菌酶處理法：多用于破壞大腸桿菌

5、等微生物的細胞壁。在每毫升含2億個細胞的懸液中加100 g至1 mg溶菌酶，37 保溫10 min，或者室溫作用30 min，細胞就破壞了。洗滌包涵體洗滌包涵體前先8 000 rrain，412離心15 rain，可使大多數(shù)包涵體沉淀，與可溶性蛋白分離。為了除去包涵體上粘附的雜質，如膜蛋白或核酸，利用洗滌液洗滌包涵體沉淀，常用去污劑Triton x一100或脫氧膽酸鈉和低濃度變性劑(如2 molL尿素或鹽酸胍等)洗滌以除去脂類，但過高濃度的尿素或鹽酸胍會使包涵體溶解【 。溶解包涵體包涵體一般只溶于強的變性劑如尿素、鹽酸胍，它是通過離子間的相互作用，打斷包涵體蛋白質分子內和分子間的各種化學鍵，使

6、多肽伸展，SDS、正十六烷基三甲基銨氯化物等去垢劑，可以破壞蛋白內的疏水鍵，溶解一些包涵體蛋白質【8。另外，對于含有半胱氨酸的蛋白質，分離的包涵體中通常含有一些鏈間形成的二硫鍵和鏈內的非活性二硫鍵。還需加入還原劑，如琉基乙醇、二硫基蘇糖醇(DTT)，常用濃度210 mM。另外，尿素和鹽酸胍屬中強度變性劑，易經(jīng)透析和超濾除去。它們對包涵體氫鍵有較強的可逆性變性作用，所需濃度尿素68 M ，鹽酸胍57 M。一般來講，鹽酸胍溶解力強于尿素，它能使尿素不能溶解的包涵體溶解，但缺點是容易使SDSPAGE電泳條帶變形【9。尿素的溶解度為7O 90 ，其分解的異氰酸鹽能導致多肽鏈的自由氨基甲?；貏e是在堿

7、性pH值下長期保溫時，但用尿素溶解具有不電離，呈中性，成本低，蛋白質復性后除去尿素不會造成大量蛋白質沉淀，以及溶解的包涵體可選用多種色譜法純化等優(yōu)點，故目前已被廣泛采用。復性包涵體蛋白由于包涵體中的重組蛋白缺乏生物學活性，加上劇烈的處理條件，使蛋白的高級結構破壞，因此重組蛋白的復性特別必要。通過緩慢去除變性劑使目標蛋白從變性的完全伸展狀態(tài)恢復到正常的折疊結構，同時去除還原劑使二硫鍵正常形成1 。一般在尿素濃度4 M 左右時復性開始，到2 M左右時結束。對于鹽酸胍而言，從4 M 開始，到15 M 時復性過程結束 。包涵體蛋白的復性是一個非常復雜的過程，除與控制蛋白質復性的過程相關外，還在很大程度上與蛋白質本身的性質有關，有些蛋白非常容易復性，在較寬松的條件下復性效率可以達到95以上，而有一些蛋白至今沒有發(fā)現(xiàn)能夠對其進行復性的方法，很多蛋白的復性效率只有百分之幾，一般說來，蛋白質的復性效率在2O左右【l 2。復性中常采用的方法有以下幾種：(1)稀釋復性法，直接加入水或緩沖液，放置過夜，缺點是體積增加較大，變性劑稀釋速度太快，不易控制【13)。(2)透析復性法，好處是不增加體積，通過逐漸降低外透液濃度來控制變性劑去除速度，有人稱易形成沉淀，且不適合大規(guī)模操作，無法應用到生產(chǎn)規(guī)?！? 。(3)超濾復性，在生產(chǎn)中較