western標(biāo)準(zhǔn)化操作流程(改)

1、western標(biāo)準(zhǔn)化操作流程(改)Western blot標(biāo)準(zhǔn)化操作流程一、蛋白樣品制備單層貼壁細(xì)胞總蛋白的提?。?、倒掉培養(yǎng)液，并將瓶倒扣在吸水紙上使吸水紙吸干培養(yǎng)液（或?qū)⑵恐绷⒎胖靡粫?huì)兒使殘余培養(yǎng)液流到瓶底然后再用移液器將其吸走）。2、加入適量預(yù)冷的PBS。平放輕輕搖動(dòng)1min洗滌細(xì)胞，然后棄去洗液。重復(fù)以上操作兩次，共洗細(xì)胞三次以洗去培養(yǎng)液。將PBS棄凈后把培養(yǎng)瓶置于冰上。3、按1ml裂解液加10 l PMSF（100mM）和10l Cocktail，搖勻置于冰上（PMSF要搖勻至無結(jié)晶時(shí)才可與裂解液混合）。4、每瓶細(xì)胞加400 l （6孔板根據(jù)細(xì)胞的密度加入100-200 ul）含PM

2、SF和的裂解液，于冰上裂解30min，為使細(xì)胞充分裂解培養(yǎng)瓶要經(jīng)常來回?fù)u動(dòng)。5、裂解完后，用干凈的刮棒將細(xì)胞刮于培養(yǎng)瓶的一側(cè)（動(dòng)作要快），然后用槍將細(xì)胞碎片和裂解液移至1.5ml離心管中（整個(gè)操作盡量在冰上進(jìn)行）。6、于4下14000rpm離心5min。（提前開離心機(jī)預(yù)冷）。7、將離心后的上清分裝轉(zhuǎn)移倒干凈的離心管中，并分裝至少兩份，放于-80保存。8、取部分上清，加入上樣buffer，煮沸10 min。緩慢恢復(fù)室溫后，稍離心，放于-20保存。組織中總蛋白的提取：1、將100mg組織塊置于勻漿器中球狀部位，用干凈的剪刀將組織塊盡量剪碎。2、加500 l RIPA裂解液裂（含PMSF和Cockt

3、ail）于勻漿器中，進(jìn)行勻漿此過程一直在冰上操作。要重復(fù)碾幾次使組織盡量碾碎。3、用移液器將裂解液移至1.5ml離心管中，冰上裂解30 min，然后在4下14000rpm離15min，取上清分裝于1.5ml離心管中并置于80保存。4、取部分上清，加入上樣buffer，煮沸10 min。緩慢恢復(fù)室溫后，稍離心，放于-20保存。二、凝膠的制備1、玻璃板對(duì)齊后放入夾中卡緊。然后垂直卡在架子上準(zhǔn)備灌膠（操作時(shí)要使兩玻璃對(duì)齊，以免漏膠）。2、配10分離膠母液，加入APS和TEMED后立即搖勻即可灌膠。灌膠時(shí)，可用10ml槍吸取5ml膠沿玻璃放出，待膠面升到綠帶中間線高度時(shí)即可。然后膠上加一層水（或異丙醇

4、），液封后的膠凝的更快（灌膠時(shí)開始可快一些，膠面快到所需高度時(shí)要放慢速度。操作時(shí)膠一定要沿玻璃板流下，這樣膠中才不會(huì)有氣泡。加水液封時(shí)要很慢，否則膠會(huì)被沖變型）。3、當(dāng)水和膠之間有一條折射線時(shí)，說明膠已凝了。再等3min使膠充分凝固就可倒去膠上層水并用吸水紙將水吸干。4、配5的濃縮膠母液，加入APS和TEMED后立即搖勻即可灌膠。將剩余空間灌滿濃縮膠然后將梳子插入濃縮膠中。灌膠時(shí)也要使膠沿玻璃板流下以免膠中有氣泡產(chǎn)生。插梳子時(shí)要使梳子保持水平。由于膠凝固時(shí)體積會(huì)收縮減小，從而使加樣孔的上樣體積減小，所以在濃縮膠凝固的過程中要經(jīng)常在兩邊補(bǔ)膠。待到濃縮膠凝固后，兩手分別捏住梳子的兩邊豎直向上輕輕將

5、其拔出。5、用水沖洗一下濃縮膠，將其放入電泳槽中。或封好放入4冰箱。三、點(diǎn)樣及電泳加足夠的電泳液后開始準(zhǔn)備上樣。（電泳液至少要漫過內(nèi)測的小玻璃板。）用小移液槍貼壁吸取樣品，將樣品吸出不要吸進(jìn)氣泡。插至加樣孔中緩慢加入樣品。（加樣太快會(huì)使樣品沖出加樣孔，若有氣泡也可能會(huì)使樣品溢出。加入下一個(gè)樣品時(shí)，換掉小槍頭，以免交叉污染。）如果上樣量太少，則取出樣品后可用一定體積的1*Loading Buffer稀釋一下再點(diǎn)樣，可防止點(diǎn)樣的時(shí)候漏掉太多樣品，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成比較大的影響。電泳時(shí)間一般12 h，電流為：濃縮膠15mA/膠，分離膠20mA/膠（或用恒壓100V120V）。電泳至溴酚蘭剛跑出即可終止電

6、泳。四、轉(zhuǎn)膜1、要先將玻璃板撬掉才可剝膠，撬的時(shí)候動(dòng)作要輕，要在兩個(gè)邊上輕輕的反復(fù)撬。撬一會(huì)兒玻璃板便開始松動(dòng)，直到撬去玻板。（撬時(shí)一定要小心，玻板很易裂。）除去小玻璃板后，將濃縮膠輕輕刮去（濃縮膠影響操作），要避免把分離膠刮破。將剝出的膠浸于純水中5 min，重復(fù)三次后放在轉(zhuǎn)膜液中浸泡10min。2、轉(zhuǎn)一張膜需準(zhǔn)備8張大小一致的濾紙和1張7.38.6cm的PVDF膜。切濾紙和膜時(shí)一定要戴手套，因?yàn)槭稚系牡鞍讜?huì)污染膜。將切好的PVDF膜置于甲醇中浸5 min左右，移至轉(zhuǎn)膜液中浸10 min。3、在加有轉(zhuǎn)移液的盤里放入轉(zhuǎn)膜用的夾子、兩塊海綿墊、一支玻棒、濾紙和浸過的膜。4、將夾子打開使黑的一面保

7、持水平。在上面墊一張海綿墊，用玻棒來回?fù){幾遍以搟走里面的氣泡。（一手搟另一手要壓住墊子使其不能隨便移動(dòng)。）在墊子上墊3或4層濾紙（可將紙張先疊在一起在墊于墊子上），一手固定濾紙一手用玻棒搟去其中的氣泡。5、小心地將分離膠蓋于濾紙上，用手調(diào)整使其與濾紙對(duì)齊，輕輕用玻棒搟去氣泡。將膜蓋于膠上，要蓋滿整個(gè)膠（膜蓋下后不可再移動(dòng)）并除氣泡。在膜上蓋3或4張濾紙并除去氣泡。最后蓋上另一個(gè)海綿墊，搟幾下就可合起夾子。整個(gè)操作在轉(zhuǎn)移液中進(jìn)行，要不斷的搟去氣泡。膜兩邊的濾紙不能相互接觸，接觸后會(huì)發(fā)生短路。（轉(zhuǎn)移液含甲醇，操作時(shí)要戴手套，實(shí)驗(yàn)室要開門以使空氣流通。）6、將夾子放入轉(zhuǎn)移槽槽中，要使夾的黑面對(duì)槽的黑

8、面，夾的白面對(duì)槽的紅面。電轉(zhuǎn)移時(shí)會(huì)產(chǎn)熱，在槽的一邊放一塊冰來降溫。一般用200mA 1-2h（或用恒壓100V 1-2h）。7、轉(zhuǎn)完后將膜用1麗春紅染液染。然后用水沖洗掉沒染上的染液就可看到膜上的蛋白。8、將膜放入TBST中，10min*3次洗去麗春紅。五、免疫反應(yīng)（1）5%脫脂奶粉（TBS配制）溶液室溫封閉小時(shí)或過夜。（2）將一抗用5%脫脂奶粉（TBS配制）或一抗稀釋液稀釋至適當(dāng)濃度，室溫下孵育12h后，用TBST在室溫下脫色搖床上洗3次，每次10 min；再用TBS洗一次，10min。（3）用無菌的1TBST稀釋二抗，室溫下孵育30 min-1 h后，用TBST在室溫下脫色搖床上洗3次或更

9、多次，每次10min；再用TBS洗一次，10min，進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。六、化學(xué)發(fā)光，顯影，定影1、將A和B兩種試劑在離心管等體積混合；1min后，將膜吸干后，將膜蛋白面朝上，并加上適量混合液；等其發(fā)光較穩(wěn)定后（一般15 min）迅速將膜移至保鮮膜上，放入X-光片夾中。2、在暗室中，將1顯影液和定影液分別到入塑料盤中；在紅燈下取出X光片，用切紙刀剪裁適當(dāng)大?。ū饶さ拈L和寬均需大1cm）；打開X-光片夾，把X光片放在膜上，一旦放上，便不能移動(dòng)，關(guān)上X-光片夾，開始計(jì)時(shí)；根據(jù)信號(hào)的強(qiáng)弱適當(dāng)調(diào)整曝光時(shí)間，曝光完成后，打開X-光片夾，取出X-光片，迅速浸入顯影液中顯影，待出現(xiàn)明顯條帶后，即刻終止顯影。顯

10、影時(shí)間一般為1030秒（2025），溫度過低時(shí)（低于16）需適當(dāng)延長顯影時(shí)間；顯影結(jié)束后，馬上把X-光片放入水中浸洗一下，再浸入定影液中，定影時(shí)間一般為510min，以膠片透明為止，操作中可多壓幾張膠片，最后再篩選比較好看的膠片；用自來水沖去殘留的定影液后，室溫下晾干。應(yīng)注意的是：顯影和定影需移動(dòng)膠片時(shí)，盡量拿膠片一角，鑷子不要?jiǎng)潅z片，否則會(huì)對(duì)結(jié)果產(chǎn)生影響。取出膠片過程中手套要保持干燥，不能將膠片弄濕，否則對(duì)結(jié)果會(huì)產(chǎn)生影響。附：試劑配方：10*電泳緩沖液144g Glycine30g Tirs-Base10g SDS加800mL純水溶解后溶至1L室溫保存。使用時(shí)100mL10*緩沖液加900

11、ml純水稀釋至1*使用。10*轉(zhuǎn)膜緩沖液154g Glycine30g Tris-Base加800mL純水溶解后溶至1L室溫保存。使用時(shí)100mL 10*轉(zhuǎn)膜緩沖液加入200mL甲醇再用純水定容至1L使用。5*Loading Buffer1.25mL 1M Tris-HCL (PH6.8)0.5g SDS25mg BPB（溴酚藍(lán)）2.5mL 甘油加2mL去離子水溶解后定溶至5mL。使用時(shí)每1mL Loading Buffer加入50uL -巰基乙醇。Tis緩沖液配方（0.5M pH7.6）Tris-Base 60.57g加800mL純水溶解后，濃鹽酸調(diào)pH至7.6，定容至1L。1*TBS(TBST)先用少量純水溶解8.5gNaCl，后加入0.5M Tis緩沖液100mL，定容至1L，即為1*TBS。加入0.1%的Tween-20。RIPA裂解液50mM Tris-HCL PH7.4 2mL 1M Tris-HCL PH7.4150mM NaCL 1.2mL 5M NaC