腫瘤分子診斷

1、腫瘤分子診斷服務(wù)介紹,2,標(biāo)準(zhǔn)化用藥,個體化用藥,標(biāo)準(zhǔn)化用藥,個體化用藥,標(biāo)準(zhǔn)療法1,標(biāo)準(zhǔn)療法2,標(biāo)準(zhǔn)療法3,腫瘤藥物與相關(guān)靶標(biāo),4,如何實現(xiàn)個體化用藥？,分子分型 藥物療效,體細(xì)胞基因突變檢測,mRNA表達(dá)檢測,循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTC)檢測,基因多態(tài)性檢測,體細(xì)胞基因突變檢測,EGFR, K-RAS, B-RAF，C-KIT,8,1、基因突變檢測技術(shù), qPCR-HRM（可用于血漿標(biāo)本檢測） Taqman-ARMS（與國際獲批的技術(shù)相當(dāng)） DNA測序（基因突變檢測的金標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)）,9,突變檢測技術(shù)之一 Taqman-ARMS,所有定量PCR儀均可使用。 主要用于各類組織，包括手術(shù)、穿刺或鏡檢組織

2、類。 2小時即可完成檢測 試劑盒商業(yè)化程度高，臨床認(rèn)可程度高 國內(nèi)已有試劑盒獲批SFDA,10,突變檢測技術(shù)之一 qPCR-HRM,qPCR-HRM技術(shù)是基于高效穩(wěn)健的PCR上的高分辨熔解曲線分析（High-Resolution Melting）技術(shù)，靈敏度可以達(dá)到1%-0.1%，既能檢測已知突變，也能檢測未知突變。 qPCR-HRM的突變檢測已獲國際多中心雙盲實驗驗證（Journal of Molecular Diagnostics, Vol. 11, No. 6, November 2009）。,實例圖：利用HRM技術(shù)對7個樣本分別進(jìn)行EGFR（左圖）、KRAS（右圖）突變檢測，紅色表示該

3、樣本發(fā)生突變，藍(lán)色表示未突變，藍(lán)色橫直線為陰性對照。左圖顯示2個樣本發(fā)生了EGFR突變；右圖顯示4個樣本發(fā)生了KRAS突變。,EGFR,KRAS,11,血漿EGFR突變檢測： 18號外顯子：無突變 19號外顯子：突變 20號外顯子：無突變 21號外顯子：無突變 附圖,主要特點： 實現(xiàn)血漿中來自腫瘤的微量DNA的突變檢測。 目前所做的臨床實驗中，血漿EGFR檢測結(jié)果與其手術(shù)標(biāo)本之間的整體符合率符合率達(dá)到91.25%。 是臨床上不能手術(shù)、也同時不愿穿刺患者的替代檢測方案；也可 獲得性耐藥進(jìn)行預(yù)先檢測。,qPCR-HRM用于血漿微量突變檢測,國際公認(rèn)的分子檢測金標(biāo)準(zhǔn) 有明確的物價收費 實驗流程較復(fù)雜

4、，需要大型儀器,突變檢測技術(shù)之一 DNA測序,突變檢測項目列舉,EGFR突變檢測,EGFR E19 / E21敏感突變 適合使用TKI藥物治療,耐藥位點檢測T790M,K-RAS突變檢測,BRAF,NCCN,2010年NCCN結(jié)直腸癌臨床實踐指南指出： K-ras基因為野生型而同時具有BRAF V600E突變的患者，靶向EGFR抗體治療無效。,BRAF-V600E檢測,腫瘤學(xué)臨床實踐指南（中國版） 2010第一版,指導(dǎo)腫瘤靶向治療的靶標(biāo),基因多態(tài)性檢測與藥物代謝毒性 (UGT1A1,CYP,DPD),3/31/2021,19,單核苷酸多態(tài)性（SNP）是最常見的基因變異,至少1%的人群,絕大多數(shù)

5、人群,共有序列,G to C,SNP 位點,變異的序列,最常見的基因多態(tài)性 SNP,3/31/2021,20,為什么 SNPs 重要?,個體 1,個體 2,= SNP variations in DNA,SNP標(biāo)志基因 A,基因 B,基因 A,SNP 可能使基因 B 產(chǎn)生變異的蛋白質(zhì)分子,3/31/2021,21,個體的SNP 譜,SNP 譜A,SNP 譜B,SNP 譜C,SNP 譜F,SNP 譜E,SNP 譜D,3/31/2021,22,SNP 譜有助于確定藥物的療效和副作用,乳腺癌病人,個體的SNP 譜可以分成不同的類型,SNP 譜 A,對藥物有期望的反應(yīng),對藥物沒有期望的反應(yīng),SNP 譜

6、 A 的人對藥物 有期望的反應(yīng),SNP 譜E,SNP 譜 B,SNP 譜 C,SNP 譜D,藥物代謝與SNP檢測,化療藥物在體內(nèi)經(jīng)過吸收、代謝、分布和清除，通過其活性物質(zhì)對治療靶點的直接攻擊而發(fā)揮作用，整個過程需要多種蛋白質(zhì)/酶的共同參與和協(xié)同作用。 SNP 主要是指在基因組水平上變異頻率大于1%的單核苷酸變異所引起的DNA序列多態(tài)性，多態(tài)性會導(dǎo)致不同個體體內(nèi)各種蛋白，酶活性的差異，因此導(dǎo)致藥物使用情況的不同。,膽紅素尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶基因（UGT1A1）,UGT1A1*27(C686A)或UGT1A1*28(TA)7TAA: 野生型：6個TA UGT1A1*6(G211A)：,使UG

7、T1A1的轉(zhuǎn)錄活性下降了三分之二。 導(dǎo)致對伊立替康的毒性增加。,FDA提示：UGT1A1的多態(tài)性-伊立替康的毒性增加(6TA),此型的酶活性是野生型的49 。,25,CYP19A1 多態(tài)性影響芳香化酶抑制劑療效,CYP19A1是芳香化酶的編碼基因，臨床研究已證實有著很大的影響作用。在接受芳香化酶抑制劑治療的乳腺癌患者中，攜帶CYP19A1基因rs4646（GT）突變患者的治療效果較無此突變的患者顯著2-4（下圖）。 CYP19A1 rs4646（GT）SNP是乳腺癌患者接受芳香化酶抑制劑治療療效的有效預(yù)測指標(biāo)。,如圖一項對乳腺癌患者的臨床研究顯示：CYP19A1基因rs4646突變的患者使用芳

8、香化酶抑制劑藥物療效明顯優(yōu)于野生型患者（p0.0001）1。,參考文獻(xiàn)1. Ian ES et al. N Engl J Med. 2003;384:2431-42.2. Ramon C et al. Clin Cancer Res. 2008;14:811-6. 3. Lunardi G et al. J Clin Oncol. 2009; 27: 555. 4. Fasching PA et al. Breast Cancer Res Tr. 2008;112:89-98.,基因表達(dá)檢測（mRNA表達(dá)） (ERCC1BRCA1TUBB3TS),基因表達(dá)檢測指標(biāo)（靶向藥物）,28,HER2基

9、因表達(dá)檢測,采用RT-PCR方法替代FISH或免疫組化方法，臨床準(zhǔn)確率達(dá)97%以上。 主要特點： 客觀，不用人為觀察。 時間短，整個檢測60分鐘左右完成。 高通量，一次可以檢測6人份。,PDGFR 低表達(dá)患者的無進(jìn)展生存期和總生存期明顯長于高表達(dá)患者,化療藥物與檢測靶標(biāo),ERCC1表達(dá)與鉑類藥物療效相關(guān)的臨床數(shù)據(jù),ERCC1陰性患者，能從鉑類輔助化療中獲益.,BRCA1/2表達(dá)與鉑類藥物療效相關(guān)的臨床數(shù)據(jù),BRCA1過度表達(dá) 鉑類耐藥的預(yù)測因子 抗微管類藥物的敏感因子,34,低TS mRNA水平的腫瘤患者接受氟類化療的效果較好，中位生存期較長。 TS低表達(dá)的患者對培美曲賽的療效好。,TS高表達(dá)

10、影響氟類和培美曲塞藥效,Shirota Y et al. J Clin Oncol. 2001;19:4298-304,化療藥物與檢測靶標(biāo),小 結(jié),NSCLC個體化用藥系統(tǒng)方案,遺傳性非息肉性結(jié)直腸癌（HNPCC)是由DNA錯配修復(fù)基因（MMR)發(fā)生基因突變導(dǎo)致的一種單基因的顯性遺傳疾病，又稱lynch綜合癥，發(fā)生基因異常的個體其患發(fā)結(jié)直腸癌的風(fēng)險約為60%。,HNPCC實驗室檢測流程,39,1 背景介紹之HNPCC與MMR MSI,目前已發(fā)現(xiàn)的導(dǎo)致人類HNPCC發(fā)生的MMR有MSH2、MLH1、MSH6、PMS1、PMS2，其中MSH2和MLH1基因的功能最重要，其突變占已發(fā)現(xiàn)突變的90%左

11、右。,40,1 背景介紹之HNPCC與MMR MSI,研究顯示， 約有86%-95%的HNPCC具有MSI特征， 而散發(fā)型大腸癌中只有16%。 MSI所產(chǎn)生的遺傳不穩(wěn)定性將加速惡性腫瘤的發(fā)生。 1997年美國NCI (national cancer institution)將MSI確定為檢測和篩選HNPCC的重要方法之一，并推薦將BAT26、BAT25、D2S123、D5S346和D17S250 5個位點作為檢測HNPCC的位點。,實驗室檢測流程,HNPCC檢測項目,標(biāo)本要求,腫瘤在變,We can look at tumors for changes at the DNA, RNA and

12、protein levels. It certainly gives us a way of looking at what is happening inside a tumor, and thats very exciting. Dr. Gordon Mills Chair Systems Biology MD Anderson Cancer Center Houston, Tx As reported in “The Cancer Test” TIME (June 14, 2007),循環(huán)腫瘤細(xì)胞,1869年 Aust Med J，Ashworth最早在轉(zhuǎn)移性癌癥患者血液中觀察到。 20

13、05年 N Engl J Med，Cristofanilli證實治療前CTC數(shù)目是轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者無進(jìn)展生存期和總生存期的獨立預(yù)測因子。,循環(huán)腫瘤細(xì)胞指從實體瘤中脫離出來并進(jìn)入外周血液循環(huán)的腫瘤細(xì)胞。,獲取CTC需要解決的技術(shù)問題,從紅細(xì)胞和白細(xì)胞中富集惡性腫瘤細(xì)胞 將惡性腫瘤細(xì)胞與紅細(xì)胞、白細(xì)胞、正常上皮細(xì)胞、造血干細(xì)胞等區(qū)分開來,每10mL血液中可能僅含有幾個到幾十個循環(huán)腫瘤細(xì)胞，而10mL血液中含有的白細(xì)胞約有1億個，紅細(xì)胞有500億個。,三種技術(shù),過濾法,ISET: Isolation by Size of Epithelial Tumor cells 8m孔徑過濾膜，漏檢體積較小的腫

14、瘤細(xì)胞 敏感性低,梯度密度法,腫瘤細(xì)胞和單核細(xì)胞密度小于1.077g/ml CTC純度低，混入較多白細(xì)胞 腫瘤細(xì)胞會遷移至血漿層，而聚集后容易下沉 聚蔗糖-泛影葡胺(Ficoll-Hypaque)對細(xì)胞有毒性,免疫磁珠法,腫瘤細(xì)胞表面抗原EpCAM與包繞著磁珠的特異性單抗相結(jié)合 CellSearch細(xì)胞保存方法長達(dá)96小時 實驗室室間差異小 EpCAM的假陽性和假陰性,CellSearch 是全球第一也是唯一經(jīng)FDA批準(zhǔn)可用于臨床的循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTC）產(chǎn)品,1983 磁流體,如何鑒別出CTC?,CTC,Anti-EpCAM磁珠,Anti-CK-PE,Nucleus DAPI,CK,EpCAM,在CellSearch檢測中，CTC 被設(shè)定為： EpCam CK-8,