藥典三部2015版-通則-3302外源病毒因子檢查法

1、3302 外源病毒因子檢查法病毒類制品在毒種選育和生產(chǎn)過程中，經(jīng)常使用動物或細胞基質(zhì)培養(yǎng)，因此，有可能造成外源因子的污染。為了保證制品質(zhì)量，需要對毒種和對照細胞進行外源病毒因子的檢測。對病毒主種子批或工作種子批，應(yīng)抽取足夠檢測試驗需要量的供試品進行外源病毒因子檢測。根據(jù)病毒的特性，有些檢測需要在試驗前中和病毒。病毒中和時盡可能不稀釋，但當(dāng)中和抗體不能有效中和病毒而需要進行稀釋病毒時，應(yīng)選擇可被中和的最大病毒量，但至少不得超過生產(chǎn)接種時毒種的稀釋倍數(shù)。進行病毒中和時，應(yīng)采用非人源和非猴源（特殊情況除外）的特異性抗體中和本病毒，為降低樣品中外源病毒被中和的可能性，最好采用單克隆抗體，中和過程不應(yīng)干

2、擾外源病毒的檢測。制備抗血清（或單克隆抗體）所用的免疫原應(yīng)采用與生產(chǎn)疫苗（或制品）不同種而且無外源因子污染的細胞（或動物）制備。如果病毒曾在禽類組織或細胞中繁殖過，則抗體不能用禽類來制備。若用雞胚，應(yīng)來自SPF雞群。病毒種子批外源因子檢查 動物試驗法 小鼠試驗法 取1520g小鼠至少10只，取病毒種子批或經(jīng)抗血清中和后的病毒懸液，每只腦內(nèi)接種0.03ml，同時腹腔接種0.5ml，至少觀察21天。解剖每只在試驗24小時后死亡或有患病體征的小鼠，直接肉眼觀察其病理改變，并將有病變的相應(yīng)的組織制成懸液通過腦內(nèi)和腹腔接種另外至少5只小鼠，并觀察21天。接種24小時內(nèi)小鼠死亡超過20%，試驗無效。在觀察

3、期內(nèi)最初接種的乳鼠以及每個盲傳組的小鼠至少有80%健存，且小鼠未出現(xiàn)與待測毒種無關(guān)的可傳播性因子或其他病毒感染，為符合要求。 乳鼠試驗法 取出生24小時內(nèi)的乳鼠至少10只，取病毒種子批或經(jīng)抗血清中和后的病毒懸液，腦內(nèi)接種0.01ml，同時腹腔接種至少0.1ml。每天觀察至少14天。解剖每只在試驗24小時后死亡或有患病體征的乳鼠，直接肉眼觀察其病理改變，并取有病變的相應(yīng)的組織和腦、脾制備成懸液通過腦內(nèi)和腹腔接種另外至少5只乳鼠，并每天觀察至接種后14天。接種24小時內(nèi)乳鼠死亡超過20%，試驗無效。在觀察期內(nèi)最初接種的乳鼠以及每個盲傳組的乳鼠至少有80%健存，且乳鼠未出現(xiàn)與待測毒種無關(guān)的可傳播性因

4、子或其他病毒感染，為符合要求。 細胞培養(yǎng)法 非血吸附病毒檢查 取病毒種子批或用抗血清中和后的病毒懸液，分別接種于人源、猴源和與生產(chǎn)用細胞同種細胞。除另有規(guī)定外，每種細胞至少接種10ml病毒懸液或10ml病毒懸液用抗血清中和后接種。用人二倍體細胞或猴源細胞生產(chǎn)的，還應(yīng)接種另外一株人二倍體細胞或猴源細胞。每種細胞至少接種6瓶，每瓶病毒懸液接種量不少于每瓶培養(yǎng)液總量的25%。于361培養(yǎng)，觀察14天。每種細胞均設(shè)置未接種病毒的陰性對照瓶及陽性病毒對照瓶。必要時可更換細胞培養(yǎng)液或傳代1次，但傳代時間距觀察期末不得少于7天。陰、陽性對照應(yīng)成立，接種待測病毒樣本的每種細胞培養(yǎng)物未見細胞病變判為陰性，符合要

5、求。 血吸附病毒檢查 于接種后第68天和第14天，分別取上述接種病毒的每種細胞培養(yǎng)物2瓶進行血吸附病毒檢查。用0.2%0.5%雞和豚鼠紅細胞混合懸液覆蓋于細胞表面，一瓶于28放置30分鐘，另一瓶于2025放置30分鐘，吸棄多余紅細胞后觀察紅細胞吸附情況。陰、陽性對照應(yīng)成立，接種待測病毒樣本的細胞應(yīng)均為陰性。 雞胚檢查法在禽類組織或細胞中繁殖過的病毒種子需用雞胚檢查禽類病毒的污染。除另有規(guī)定外，取10ml病毒種子批或10ml病毒懸液用抗血清中和后接種，選用911日和57日齡兩組SPF雞胚，每組至少10枚，分別于尿囊腔和卵黃囊接種，每胚0.5ml。置于35孵育7天后，觀察雞胚存活，并取尿囊液用0.

6、2%0.5%雞和豚鼠紅細胞混合懸液做血細胞凝集試驗。接種的每組雞胚至少80%存活7天，且尿囊液血凝試驗為陰性，為符合要求。生產(chǎn)用對照細胞外源病毒因子檢查 非血吸附病毒檢查 細胞直接觀察 每批生產(chǎn)用細胞應(yīng)留取5%或不少于500ml細胞懸液不接種病毒，作為對照細胞加入與疫苗生產(chǎn)相同的細胞維持液，置與疫苗生產(chǎn)相同的條件下培養(yǎng)至少14天或至病毒收獲時（取時間較長者），在顯微鏡下觀察是否有細胞病變出現(xiàn)，無細胞病變出現(xiàn)者為陰性，符合要求。在觀察期末至少有80%的對照細胞培養(yǎng)物存活，試驗才有效。 細胞培養(yǎng)試驗 上述試驗觀察期末，收取上清液混合后，取適量接種于猴源和人源的細胞培養(yǎng)物，如果疫苗病毒在非猴源或非人源其他細胞系上生產(chǎn)，還應(yīng)接種于同種不同批細胞。每種細胞至少接種5ml上清混合液，且接種量應(yīng)不少于每瓶細胞培養(yǎng)液總量的25%。置與生產(chǎn)相同的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)至少14天。無細