基因重組葡萄糖異構(gòu)酶工程產(chǎn)業(yè)化項(xiàng)目資金申請(qǐng)報(bào)告(已成功申請(qǐng)國家補(bǔ)助資金)

1、第一章 項(xiàng)目的意義和必要性 第一節(jié) 國內(nèi)外現(xiàn)狀和技術(shù)發(fā)展趨勢 一、國內(nèi)外現(xiàn)狀 葡萄糖異構(gòu)酶（glucose isomerase，簡稱 gi），能將 d-木糖、 d-葡萄糖、d-核糖等醛糖轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的酮糖，工業(yè)上主要用作果 葡糖漿生產(chǎn)的催化劑。1967 年，美國首次成功的進(jìn)行了葡萄糖異 構(gòu)酶的工業(yè)化應(yīng)用，至今國外的果葡糖漿生產(chǎn)業(yè)均已轉(zhuǎn)向葡萄糖 異構(gòu)酶技術(shù)。由于葡萄糖異構(gòu)酶結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，是目前世界上公認(rèn)的 研究酶的催化機(jī)制、建立完整的蛋白質(zhì)工程技術(shù)的最好模型之一， 具有巨大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和理論研究意義，國外投入了大量的人力、 物力對(duì)葡萄糖異構(gòu)酶的酶學(xué)性質(zhì)、固定化工藝、基因工程、晶體 學(xué)及其蛋白質(zhì)工程進(jìn)行了

2、系統(tǒng)的研究。如比利時(shí)的植物遺傳所、 荷蘭細(xì)菌遺傳公司（gist-brocades）、英國帝國理工學(xué)院生物工程 中心、美國加州 cetus 以及 amgen 公司、加拿大及日本的一些研 究機(jī)構(gòu)等。 國內(nèi)自六十年代起已開展了葡萄糖異構(gòu)酶應(yīng)用于果葡糖漿 生產(chǎn)的研究，山東省食品發(fā)酵工業(yè)研究設(shè)計(jì)院通過誘變篩選獲得 的 7 號(hào)淀粉酶鏈霉菌 m1033 菌株，是國內(nèi)在這方面最具應(yīng)用價(jià) 值的工業(yè)菌株之一。目前國內(nèi)外主要是通過誘變篩選等手段來獲 得生產(chǎn)用菌株，中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院是國內(nèi)唯一開展 葡萄糖異構(gòu)酶的蛋白質(zhì)工程的研究單位。自國家“八六三”項(xiàng)目 “葡萄糖異構(gòu)酶的蛋白質(zhì)工程”立項(xiàng)以來，項(xiàng)目組的研究人

3、員對(duì)葡 萄糖異構(gòu)酶的催化機(jī)理及其蛋白質(zhì)工程進(jìn)行了多年的研究和探 索。經(jīng)十五年科技攻關(guān)，目前已完成葡萄糖異構(gòu)酶的蛋白質(zhì)工程 改造，獲得性質(zhì)改良的基因重組葡萄糖異構(gòu)酶；并利用基因工程 方法構(gòu)建高表達(dá)量的基因重組鏈霉菌工業(yè)生產(chǎn)菌株，獲得了具有 完整自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的同源重組基因工程菌株 m1033wz，其技術(shù) 水平及工業(yè)應(yīng)用價(jià)值在國內(nèi)外處于領(lǐng)先水平。目前項(xiàng)目共獲得 3 項(xiàng)國家發(fā)明專利：“sm33gi 的突變酶 gig138p 及一種提高 gi 熱 穩(wěn)定性的突變方案”（專利號(hào) zl95112782.9）、 “一種葡萄糖異構(gòu)酶 的 247 位單突變體酶和 138，247 位雙突變體酶及其構(gòu)建方法” （專利號(hào)

4、 zl97119714.8）、 “表達(dá) m1033gi 的突變酶 gig138p 的基 因工程菌株 m1033wz 及其構(gòu)建方法”(專利號(hào)：zl02143031.4)， 其中“表達(dá) m1033gi 的突變酶 gig138p 的基因工程菌株 m1033wz 及其構(gòu)建方法”已獲得 pct 國際專利受理。 （見附件 4- 6、4-7、4-8、4-9、4-10、4-11） 葡萄糖異構(gòu)酶市場方面，目前我國還沒有自己的葡萄糖異構(gòu) 酶生產(chǎn)企業(yè)，國內(nèi)市場完全由丹麥諾維信公司所壟斷，其產(chǎn)品均 為進(jìn)口分裝，目前國內(nèi)市場銷售價(jià)約為 38 萬元/噸。 二、我國酶制劑產(chǎn)業(yè)現(xiàn)狀 1965 年，中國第一家酶制劑專業(yè)生產(chǎn)企業(yè)

5、在無錫市成立，標(biāo) 志著中國酶制劑工業(yè)的起步，40 年來，我國酶制劑產(chǎn)業(yè)從無到有， 至今已具有一定規(guī)模。目前我國酶制劑生產(chǎn)企業(yè)約 100 家，但均 為中小型企業(yè)，現(xiàn)有年生產(chǎn)能力約 40 多萬噸，已實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn) 的酶種有 20 多種，主要集中在糖化酶、淀粉酶、蛋白酶等三大類， 大部分企業(yè)生產(chǎn)水平僅達(dá)到 90 年代末國際水平。 我國酶制劑生產(chǎn)廠家主要產(chǎn)品大多停留在技術(shù)含量低、利潤 率低的產(chǎn)品上，如目前市場上 5 萬單位糖化酶工廠成本約 4400 元/噸，售價(jià)僅為 4600 元/噸，2000 單位中溫淀粉酶工廠成本約 7000 元/噸，售價(jià)僅為 8000 元/噸，10 萬單位蛋白酶工廠成本約 720

6、0 元/噸，售價(jià)僅為 8100 元/噸。同時(shí)許多工業(yè)生產(chǎn)急需的酶種 如葡萄糖異構(gòu)酶、普魯藍(lán)酶、真菌淀粉酶、乳酸酶、溶菌酶等又需 大量從國外進(jìn)口，這種情況既嚴(yán)重影響了我國酶制劑行業(yè)的健康 發(fā)展，又增加了下游生產(chǎn)行業(yè)的生產(chǎn)成本。 在當(dāng)前的市場情況下，安徽*生物技術(shù)有限公司緊抓機(jī) 遇，依托中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)的技術(shù)優(yōu)勢，生產(chǎn)科技含量高、技術(shù)壁 壘高的基因重組葡萄糖異構(gòu)酶，并將進(jìn)一步發(fā)展多種高技術(shù)含量 的酶種如普魯蘭酶、堿性蛋白酶、啤酒復(fù)合酶、真菌淀粉酶、乳酸 酶、溶菌酶等，并爭取以此帶動(dòng)國內(nèi)的酶制劑生產(chǎn)企業(yè)趕上國外 同行業(yè)水平。 1991-1998 年中國各類酶制劑的產(chǎn)量、總產(chǎn)量和銷售情況 單位：千噸/

7、百萬元 表 1-1 1991 年1992 年1993 年1994 年1995 年1996 年1997 年1998 年 -淀粉酶11.6513.9820.0024.8830.8935.0032.0038.00 糖化酶67.8274.2674.8093.44125.11160.00150.00138.00 蛋白酶12.8314.9915.0227.4340.0245.0038.0040.00 其它酶0.130.050.26-0.29-5.00 總產(chǎn)量92.33100.33110.10145.92196.31240.00220.00221.00 總銷售額190.18225.95250.13328.9

8、3416.73521.60478.01480.00 2001 年全國酶制劑行業(yè)重點(diǎn)生產(chǎn)企業(yè) 表 1-2 北京市房山酶制劑總廠無錫杰能科生物工程有限公司 黑龍江省肇東市酶制劑廠天津市利華酶制劑技術(shù)有限公司 江蘇江陰星達(dá)生物工程有限公司山東省沂水隆大生物工程有限責(zé)任公司 河北邢臺(tái)市翔宇生物工程有限公司江西豪德集團(tuán)生物工程實(shí)業(yè)有限公司 湖南津市市新型發(fā)酵有限責(zé)任公司廣東江門生物技術(shù)開發(fā)中心酶制劑廠 宜興杰成生物工程有限公司河南省三門峽發(fā)酵廠 蘇州宏達(dá)制酶有限公司張家港市金源生物化工有限公司 煙臺(tái)盛元鴻生物工程有限公司山東省安丘市酶制劑廠 湖南省津市鴻鷹祥生物工程有限公司鄭州市興達(dá)發(fā)酵廠 河北勝利酶制

9、劑廠無錫市協(xié)達(dá)生物制品有限公司 連云港元升實(shí)業(yè)股份有限公司赤峰紅山生物工程有限公司 2000 年酶制劑行業(yè)收入最大的十家主要企業(yè) 表 1-3 公司名稱（成立年份） 主要產(chǎn)品 無錫杰能科生物工程有限公司(1993)酶制劑 宜興杰成生物工程公司(1992) 淀粉酶 河南省三門峽發(fā)酵廠(1980) 糖化酶 安丘市酶制劑廠(1990) 糖化酶 廣州酶制品廠(1985) 木瓜酶 江陰市星達(dá)生物工程有限公司(1995) 糖化酶 河北省邢臺(tái)市酶制劑廠(1953) 淀粉酶 吉林省吉發(fā)集團(tuán)農(nóng)業(yè)開發(fā)股份有限公司糊精廠(1987) 麥芽糊精 貴陽白云銀星化工廠(1999) 觸酶 煙臺(tái)盛元鴻生物工程有限公司(1999

10、) 酶制劑 三、技術(shù)發(fā)展趨勢 從天然菌株中分離純化得到的野生型葡萄糖異構(gòu)酶早已商 業(yè)化，并取得了良好的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益，但同時(shí)存在著一定的局 限性。主要表現(xiàn)在葡萄糖異構(gòu)酶在較高的反應(yīng)溫度下穩(wěn)定性不夠 理想，在異構(gòu)化反應(yīng)中，溫度越高(直至 105110)，熱力學(xué)平 衡越趨向于果糖方向。因此，通過蛋白質(zhì)工程改造葡萄糖異構(gòu)酶 的熱穩(wěn)定性，可以提高酶促反應(yīng)速度，延長酶壽命，降低生產(chǎn)用酶 量，增加反應(yīng)平衡過程中果糖的產(chǎn)量。 目前各國科學(xué)家都在運(yùn)用蛋白質(zhì)工程技術(shù)改造葡萄糖異構(gòu) 酶，以尋求具有優(yōu)越特性并適于工業(yè)化生產(chǎn)的葡萄糖異構(gòu)酶及高 表達(dá)菌株，使葡萄糖異構(gòu)酶制劑工業(yè)從傳統(tǒng)的依靠野生型菌株生 產(chǎn)發(fā)展到運(yùn)用基因

11、工程菌株生產(chǎn)的階段。而在這個(gè)領(lǐng)域，中國科 學(xué)技術(shù)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院走在了前沿。 國內(nèi)外在葡萄糖異構(gòu)酶的突變體構(gòu)建方面存在多種突變方 案，但真正通過蛋白質(zhì)工程方法獲得的有效突變，僅有比利時(shí)的 mrabet 與法國、荷蘭科學(xué)家合作構(gòu)建的 k253r，以及中國科學(xué)技 術(shù)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院所構(gòu)建的 gig138p 和 gig138p-g247d 等。 中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院所建立的葡萄糖異構(gòu)酶蛋白質(zhì) 工程研究系統(tǒng)在完整性和有效性上都達(dá)到國際先進(jìn)水平，在 7 號(hào) 淀粉酶鏈霉菌 m1033 菌株葡萄糖異構(gòu)酶晶體結(jié)構(gòu)模型的基礎(chǔ)上， 確立了突變體的分子設(shè)計(jì)，并發(fā)現(xiàn) pdb 所提供的橄欖色鏈霉菌 葡萄糖異構(gòu)酶

12、晶體結(jié)構(gòu)是錯(cuò)誤的模型。 第二節(jié) 對(duì)產(chǎn)業(yè)發(fā)展的作用與影響 葡萄糖異構(gòu)酶是生產(chǎn)果葡糖漿的催化劑。人們利用淀粉為 原料，經(jīng)液化、糖化、異構(gòu)化等作用，生產(chǎn)出的含葡萄糖和果糖的 混合糖漿，國內(nèi)稱果葡糖漿，國外稱高果糖漿，并分為 42 型、55 型和 90 型。其中 42 型果葡糖漿含糖 71、其中果糖占 42，葡 萄糖 52，低聚糖 6，甜度與蔗糖相當(dāng)。 果葡糖漿以其風(fēng)味醇厚、食用后不會(huì)引起血糖升高、抑制體 內(nèi)蛋白質(zhì)消耗等蔗糖不可比擬的優(yōu)勢，正在受到世人的青睞。尤 其是果葡糖漿在人體內(nèi)的代謝不需經(jīng)過胰島素途徑，故糖尿病人 可以攝入果葡糖漿，這一突出優(yōu)勢更使近年來果葡糖漿的消費(fèi)量 年年攀升。 2002 年

13、，美國果葡糖漿的消費(fèi)量為 1084 萬噸，而我國僅為 120 萬噸，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于發(fā)達(dá)國家的水平。目前發(fā)展果葡糖漿已引起 了國務(wù)院、輕工部的重視，計(jì)劃到 2010 年發(fā)展到 330 萬噸規(guī)模， 屆時(shí)對(duì)葡萄糖異構(gòu)酶的需求量將達(dá)到 800 噸/年。 果葡糖漿生產(chǎn)技術(shù)、尤其是酶制劑生產(chǎn)技術(shù)的落后是影響 其發(fā)展的主要障礙?；蛑亟M葡萄糖異構(gòu)酶工程產(chǎn)業(yè)化項(xiàng)目的實(shí) 施，對(duì)提高我國酶制劑產(chǎn)業(yè)化水平，推進(jìn)國內(nèi)食品行業(yè)的產(chǎn)品創(chuàng) 新，提升食品生產(chǎn)技術(shù)水平，拉動(dòng)農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)化發(fā)展，節(jié)約稀有的 土地資源，減少果葡糖漿生產(chǎn)的資源消耗，節(jié)省外匯資源等具有 廣泛而深遠(yuǎn)的意義。具體體現(xiàn)如下： 一、是進(jìn)行農(nóng)產(chǎn)品深加工、增加農(nóng)產(chǎn)品高附加值

14、、拉動(dòng)農(nóng)業(yè)產(chǎn) 業(yè)化發(fā)展的需要 長期以來由于產(chǎn)品深加工技術(shù)落后，我國的許多農(nóng)產(chǎn)品加 工一直處于產(chǎn)品加工鏈的初端，獲得的收益與高端加工相比有巨 大的懸殊。利用本項(xiàng)目產(chǎn)品可以進(jìn)行玉米等農(nóng)產(chǎn)品的深加工，生 產(chǎn)附加值相對(duì)較高、經(jīng)濟(jì)效益顯著、人民生活需要的果葡糖漿， 實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。 我國是淀粉生產(chǎn)的原材料大國，原料如玉米、薯干、馬鈴薯 等資源豐富，以玉米為例，年產(chǎn)量已達(dá) 1.2 億噸，居世界第二位， 玉米的增產(chǎn)為發(fā)展果葡糖漿提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。從市場看，進(jìn)入 2000 年以來，果葡糖漿發(fā)展形勢看好，產(chǎn)量攀升很快。果葡糖漿 行業(yè)的快速發(fā)展，可以解決農(nóng)民增產(chǎn)不增收的制約瓶頸。一方面， 由于玉米產(chǎn)區(qū)連年增產(chǎn)

15、，市場供大于求，糧價(jià)下跌，為保證農(nóng)民 收入國家給予大量經(jīng)濟(jì)補(bǔ)貼；另一方面，蔗糖生產(chǎn)企業(yè)處于嚴(yán)重 虧損的境地，生產(chǎn)成本比市場售價(jià)平均每噸高 2000 元左右，國 家為穩(wěn)定農(nóng)民收入、維持甘蔗的收購價(jià)，也給予蔗糖生產(chǎn)企業(yè)大 量補(bǔ)貼。這樣我國資源豐富的淀粉類農(nóng)產(chǎn)品深加工很不夠，農(nóng)民 的收入無法提高，而國家在玉米、蔗糖等農(nóng)產(chǎn)品上都要給予許多 補(bǔ)貼。為了從根本上改變這種局面，我國已開始大力發(fā)展葡萄糖 異構(gòu)酶進(jìn)行果葡糖漿的生產(chǎn)，以滿足食品、飲料加工企業(yè)的需要， 加大農(nóng)產(chǎn)品深加工力度的同時(shí)，有效的減輕國家財(cái)政負(fù)擔(dān)。 從美國的情況來看，2002 年深加工消耗玉米 4978.4 萬噸， 果葡糖漿消耗玉米 1955

16、.8 萬 t，占 39.28%，發(fā)酵酒精占深加工玉 米總量的 38%，這兩個(gè)產(chǎn)品就占深加工玉米總量的 77.28%，是 美國玉米深加工的主導(dǎo)產(chǎn)品，而果葡糖漿消耗的玉米量占第一位。 我國 2002 玉米深加工僅消耗 1000 萬噸，還不到玉米總產(chǎn)量的 10%，其中果葡糖漿消耗玉米 108 萬噸，占玉米深加工消耗的 10%。 本項(xiàng)目產(chǎn)品基因重組葡萄糖異構(gòu)酶是生產(chǎn)果葡糖漿所必需 的酶制劑，項(xiàng)目的建設(shè)是進(jìn)行農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)化，實(shí)現(xiàn)我國全面建設(shè)小 康社會(huì)的需要。 二、節(jié)約稀有的土地資源 用淀粉生產(chǎn)果葡糖漿可以節(jié)省經(jīng)濟(jì)作物甘蔗用地，改種經(jīng) 濟(jì)效益更好的農(nóng)作物，利于土地資源的有效利用。生產(chǎn) 1 噸果葡 糖漿用玉米

17、1.7 噸或山芋干 1.9 噸，分別需耕地 4 畝或 2 畝；而以 甘蔗生產(chǎn) 1 噸蔗糖需耕地 10 畝。若年產(chǎn) 200 萬噸果葡糖漿，以 玉米計(jì)可節(jié)約耕地 1200 萬畝，以山芋干計(jì)可節(jié)約 1600 萬畝，這 對(duì)耕地面積日趨減少的我國來說，其意義更不可忽視。 三、提高果葡糖漿生產(chǎn)廠家的能源和資源利用率，促進(jìn)其環(huán)保 效益 本項(xiàng)目產(chǎn)品投入使用后，由于提高了酶促反應(yīng)溫度，使反 應(yīng)速度加快，增加反應(yīng)平衡過程中果糖的產(chǎn)量，同時(shí)減少了副產(chǎn) 物的生成，可以簡化果葡糖漿生產(chǎn)的后處理工藝，減少工業(yè)生產(chǎn) 過程中廢物的產(chǎn)生和排放，提高能源和資源利用率。另外葡萄糖 異構(gòu)酶可以重復(fù)使用，由于酶壽命的延長，降低了葡萄糖

18、異構(gòu)酶 的使用量，從而可以節(jié)約國家資源，提高果葡糖漿生產(chǎn)的環(huán)保效 益。 四、為國家節(jié)省外匯資源 目前我國已建成投產(chǎn)的果葡糖漿生產(chǎn)規(guī)模超過 100 萬噸， 年消耗葡萄糖異構(gòu)酶約 300 噸。目前國內(nèi)市場上銷售的同類產(chǎn)品 全部由丹麥諾維信公司所壟斷，其銷售價(jià)約為 38 萬元/噸，即每 年需占用國家 1 億元外匯資源。本項(xiàng)目建成投產(chǎn)后，完全可以滿 足國內(nèi)市場需求量，每年可為國家節(jié)省 1 億元外匯資源。 五、是促進(jìn)我國食品工業(yè)發(fā)展的需要 糖是我國食品工業(yè)的重要原料，在糖類中，果葡糖漿具有蔗 糖不可比擬的優(yōu)勢：味甜、成本低、風(fēng)味醇厚、食用后不會(huì)引起血 糖升高、抑制體內(nèi)蛋白質(zhì)消耗等優(yōu)點(diǎn)。 目前“果葡糖漿熱

19、”已在全世界掀起。近幾年，世界上風(fēng)行 的運(yùn)動(dòng)飲料多以果葡糖漿為主要配方，許多國家正以果葡糖漿取 代蔗糖。在我國，2002 年果葡糖漿的實(shí)際產(chǎn)銷量僅為 120 萬噸， 遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于發(fā)達(dá)國家（美國 2002 年果葡糖漿產(chǎn)量為 1084 萬噸）的 水平。除了消費(fèi)意識(shí)落后、消費(fèi)習(xí)慣、價(jià)格高、固定資產(chǎn)投資大、 產(chǎn)業(yè)的生產(chǎn)慣性等原因外，果葡糖漿生產(chǎn)技術(shù)、尤其是酶制劑生 產(chǎn)技術(shù)的落后是影響我國果葡糖漿產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要障礙。 優(yōu)勢明顯、風(fēng)味獨(dú)特的果葡糖漿將大力推進(jìn)我國食品行業(yè) 的產(chǎn)品創(chuàng)新，引領(lǐng)人民的生活質(zhì)量向更高的水平發(fā)展。趕超世界 果葡糖漿生產(chǎn)和應(yīng)用水平是食品工業(yè)生產(chǎn)的重要任務(wù)之一，也是 提升我國食品生產(chǎn)技術(shù)水平

20、和發(fā)展工業(yè)經(jīng)濟(jì)的重要舉措之一。 六、是提高群眾收入和保持社會(huì)繁榮穩(wěn)定的需要 本項(xiàng)目建成后可直接為社會(huì)提供 150 個(gè)就業(yè)機(jī)會(huì)，工人進(jìn) 廠月工資及附加達(dá)到 1000 元以上，可大幅度提高當(dāng)?shù)厝罕娛杖?水平，帶動(dòng)當(dāng)?shù)厝罕娭赂唬七M(jìn)區(qū)域經(jīng)濟(jì)的協(xié)調(diào)發(fā)展，有利于維 護(hù)地區(qū)穩(wěn)定、社會(huì)進(jìn)步和經(jīng)濟(jì)繁榮。 第三節(jié) 產(chǎn)業(yè)關(guān)聯(lián)度分析 安徽*生物技術(shù)有限公司“基因重組葡萄糖異構(gòu)酶工程 產(chǎn)業(yè)化項(xiàng)目”實(shí)施的影響面大，與相關(guān)產(chǎn)業(yè)關(guān)系緊密，不可分割。 項(xiàng)目建成后不但自身的經(jīng)濟(jì)效益顯著，并且會(huì)帶動(dòng)相關(guān)行業(yè)迅速 發(fā)展，獲得較好的社會(huì)效益，促進(jìn)經(jīng)濟(jì)發(fā)展。按產(chǎn)業(yè)關(guān)聯(lián)度的基 準(zhǔn)定義內(nèi)容，即前向關(guān)聯(lián)、后向關(guān)聯(lián)和旁側(cè)關(guān)聯(lián)分別分析如下： 一

21、、牽動(dòng)上游相關(guān)行業(yè)發(fā)展（前向關(guān)聯(lián)）： “基因重組葡萄糖異構(gòu)酶工程產(chǎn)業(yè)化項(xiàng)目”形成規(guī)模后，涉 及到所需的原輔材料及包裝材料（如各類農(nóng)副產(chǎn)品、包裝材料及 其他相關(guān)輔料等）全部在國內(nèi)采購，所需數(shù)量相當(dāng)可觀，牽動(dòng)相 關(guān)原輔材料及包裝材料產(chǎn)業(yè)的發(fā)展壯大，并給這些行業(yè)增加經(jīng)濟(jì) 效益，為國民經(jīng)濟(jì)增加了新的增長點(diǎn)； 二、帶動(dòng)下游產(chǎn)業(yè)發(fā)展（后向關(guān)聯(lián)）： 生產(chǎn)本項(xiàng)目產(chǎn)品的發(fā)酵過程中產(chǎn)生的谷物糟渣可作為上佳 的畜禽養(yǎng)殖飼料，對(duì)推動(dòng)當(dāng)?shù)匦笄蒺B(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展和提高農(nóng)民經(jīng)濟(jì) 收入具有很大的促進(jìn)作用； 三、旁側(cè)關(guān)聯(lián)： 生產(chǎn)基因重組葡萄糖異構(gòu)酶的原料主要是各類農(nóng)副產(chǎn)品， 其下游相關(guān)聯(lián)產(chǎn)品果葡糖漿的生產(chǎn)更需要消耗大量的農(nóng)副產(chǎn)品。

22、農(nóng)副產(chǎn)品的特點(diǎn)是量大、笨重，需要較多的運(yùn)力，因此該項(xiàng)目的 建設(shè)能夠帶動(dòng)運(yùn)輸業(yè)及其他服務(wù)業(yè)的發(fā)展。 圖 1-1：產(chǎn)業(yè)關(guān)聯(lián)分析圖 第四節(jié) 市場分析 葡萄糖異構(gòu)酶主要用于果葡糖漿的生產(chǎn)，依照目前的技術(shù) 水平，1 公斤葡萄糖異構(gòu)酶可生產(chǎn)約 4 噸果葡糖漿。由于目前國 內(nèi)對(duì)葡萄糖異構(gòu)酶市場沒有完備準(zhǔn)確的調(diào)研報(bào)告可以參考，因此 我們以果葡糖漿的市場情況來分析葡萄糖異構(gòu)酶的市場情況。 一、我國果葡糖漿發(fā)展情況 雖然我國果葡糖漿研究工作起步較早，早在上世紀(jì) 60 中期 幾乎與日本和美國等發(fā)達(dá)國家同步開始，但由于條件不成熟，只 有 1976 年安徽蚌埠果糖廠年產(chǎn) 1600 噸果葡糖漿的生產(chǎn)線效果 較好。該廠生產(chǎn)

23、的飲料“黃山可樂”也由于用果葡糖漿替代蔗糖 做甜味劑，在市場上占有一席之地。1981 年該廠又引進(jìn)美國道爾 公司年產(chǎn)萬噸果葡糖漿的生產(chǎn)線，到 1984 年建成投產(chǎn)。國內(nèi)還 有一些小規(guī)模生產(chǎn)廠，如北京通縣燕京果糖廠，北京房山果糖廠、 河北南和縣果糖廠等，主要是供應(yīng)周圍地區(qū)食品生產(chǎn)廠家使用， 由于發(fā)展緩慢，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足當(dāng)前國內(nèi)市場日益增加的需求。 近年來，隨著科技的進(jìn)步，人們對(duì)果葡糖漿的優(yōu)越性的認(rèn)識(shí) 正在提高，特別是糖尿病作為一種常見疾病正嚴(yán)重危害廣大群眾 的身體健康，食用果葡糖漿不會(huì)增加胰島素負(fù)擔(dān)這一優(yōu)點(diǎn)正逐漸 被大眾接受，果葡糖漿的應(yīng)用范圍也更加廣闊，市場容量連年增 大。為適應(yīng)這種需要，僅 2

24、000 年以來，國內(nèi)就建成山東保齡寶生 物技術(shù)公司、河北邢臺(tái)平安糖業(yè)公司等多家十萬噸級(jí)果葡糖漿生 產(chǎn)線。這些生產(chǎn)廠的新建和投產(chǎn)，為推動(dòng)我國食品和飲料生產(chǎn)甜 味劑的發(fā)展，與國際食品生產(chǎn)同步奠定了基礎(chǔ)，為我國果葡糖漿 生產(chǎn)趕超國際水平邁出了堅(jiān)實(shí)的一步。 二、果葡糖漿生產(chǎn)和消費(fèi)的發(fā)展特點(diǎn) 1、發(fā)展迅猛。自從 1975 年以來，世界果葡糖漿的產(chǎn)量猛 增了十八倍，從 1975 年的 70 萬噸，到 2000 年已增加到 1334 萬 噸，25 年間的年遞增率達(dá) 12.5。 2、美國果葡糖漿產(chǎn)量占世界總產(chǎn)量的 70左右。1980 年 美國的年產(chǎn)量約 250 萬噸，2002 年達(dá) 1084 萬噸，凈增 83

25、4 萬噸。 3、美國果葡糖漿的消費(fèi)量最多，占世界消費(fèi)總量的 64。亞洲除日本和韓國以外，其他國家和地區(qū)的消費(fèi)較少。在 果葡糖漿的消費(fèi)中又以果糖濃度 55的第二代果葡糖漿最高， 與第一代的 42 型之間的消費(fèi)比約為 3:2。 4、我國果葡糖漿科研生產(chǎn)和消費(fèi)的情況可以概括為幾句 話：起步早、發(fā)展緩慢、產(chǎn)量相對(duì)小。2002 年實(shí)際產(chǎn)量近 120 萬噸，與世界先進(jìn)國家比，差距甚大，需加快發(fā)展的步伐。 世界范圍內(nèi)果葡糖漿迅猛發(fā)展的事實(shí)與我國發(fā)展緩慢、產(chǎn) 量小之間的差距，揭示了我國果葡糖漿巨大的發(fā)展空間。 三、制約我國果葡糖漿發(fā)展的原因 1、傳統(tǒng)生產(chǎn)企業(yè)生產(chǎn)成本高造成果葡糖漿銷售價(jià)格高， 價(jià)格因素是我國果

26、葡糖漿生產(chǎn)和應(yīng)用不能迅速發(fā)展的重要原因 之一。由于受原料價(jià)格較高、技術(shù)與管理水平落后、項(xiàng)目投入資 金量大等多種因素的制約，果葡糖漿價(jià)格一直居高不下，長期徘 徊在每噸 4000 多元，產(chǎn)品缺乏市場競爭力，嚴(yán)重制約了果葡糖 漿工業(yè)的發(fā)展。 果葡糖漿與蔗糖成本比較 單位：元/噸 表 14 果葡糖漿價(jià)格蔗糖價(jià)格蔗糖成本 美國3700國內(nèi)壟斷，高于果葡糖漿價(jià)格5550 日本27272200 左右1680 中國42002200 左右4000 2、對(duì)于食品廠而言，用果葡糖漿代替蔗糖還存在一些技 術(shù)改造上的困難，如現(xiàn)有工藝配方需適當(dāng)改變；原材料庫存設(shè)備 和運(yùn)輸工具也要投資改造；還有技術(shù)人員和操作工人尚需熟悉和

27、 摸索新材料的特性及利用方法等。 我國加入 wto 以來，隨著國際市場的競爭加劇，國內(nèi)玉米 價(jià)格持續(xù)走低。其原因一是美國低價(jià)優(yōu)質(zhì)玉米大量涌入我國， 2002 年為 585 萬噸，關(guān)稅只有 1%；二是玉米出口由于取消每噸 44 美元的國家標(biāo)貼，出口受阻；三是庫存暴滿，供大于求，這些 對(duì)果葡糖漿行業(yè)的發(fā)展是非常有利的。 近年來果葡糖漿技術(shù)水平提高，企業(yè)生產(chǎn)規(guī)模擴(kuò)大，基建投 資大幅下降，加上原料玉米價(jià)格的下降，使果葡糖漿與蔗糖的比 價(jià)有了優(yōu)勢。玉米價(jià) 1000 元/噸左右，淀粉成本約 1500 元/噸，果 葡糖漿生產(chǎn)成本僅為 3000 元/噸，當(dāng)前正是果葡糖漿、葡萄糖異 構(gòu)酶等行業(yè)發(fā)展的有利時(shí)機(jī)。

28、四、葡萄糖異構(gòu)酶的國內(nèi)外情況 目前國內(nèi)近二十家酶制劑企業(yè)產(chǎn)品中均無固相化葡萄糖異 構(gòu)酶，國內(nèi)所使用的葡萄糖異構(gòu)酶全部為丹麥諾維信公司進(jìn)口產(chǎn) 品。根據(jù)中國輕工協(xié)會(huì)酶制劑分會(huì)提供資料，我國 2000-2003 年 上半年果葡糖漿產(chǎn)量平均以 10%增長，預(yù)計(jì)到 2005 年果葡糖漿 產(chǎn)量為 160 萬噸，葡萄糖異構(gòu)酶需求量將達(dá)到 400 噸。 近年果葡糖漿、葡萄糖異構(gòu)酶銷售量、需求量及未來年度預(yù)測 單位：萬噸 表 15 2000 年2001 年2002 年2003 年 2005 年 預(yù)計(jì) 2010 年 計(jì)劃 果葡糖漿90100120130160330 葡萄糖異構(gòu)酶220250300320400800

29、 丹麥諾維信公司在中國投資成立的諾維信（中國）投資有限 公司是中國生物技術(shù)領(lǐng)域較大的外商投資公司。諾維信（中國）投 資有限公司目前在中國擁有諾維信(中國)生物技術(shù)有限公司和諾 維信(沈陽)生物加工有限公司兩家全資生產(chǎn)子公司及一家合資公 司。該公司的酶制劑產(chǎn)品廣泛應(yīng)用于淀粉、果蔬汁、啤酒、酒精、 功能食品等行業(yè)，其產(chǎn)品在中國工業(yè)酶制劑市場占有較大的份額。 丹麥諾維信公司酶制劑產(chǎn)品售價(jià)昂貴，一定程度上侵害了中國發(fā) 酵生產(chǎn)企業(yè)的利益，其葡萄糖異構(gòu)酶目前壟斷國內(nèi)及亞洲周邊市 場，其銷售價(jià)約為 38 萬元/噸。 安徽*生物技術(shù)有限公司“基因重組葡萄糖異構(gòu)酶”產(chǎn)品 的市場優(yōu)勢主要體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面： 1、

30、基因重組葡萄糖異構(gòu)酶的熱穩(wěn)定性高于目前市場上的同 類產(chǎn)品，降低了果葡糖漿生產(chǎn)廠家的生產(chǎn)成本； 2、擁有中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)及國家“八六三”項(xiàng)目的雙重品牌 優(yōu)勢； 3、產(chǎn)品具備高科技含量，擁有完整的自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)； 4、利用阜陽廉價(jià)的原材料及勞動(dòng)力，產(chǎn)品具備價(jià)格優(yōu)勢。 五、市場預(yù)測 果葡糖漿的諸多優(yōu)點(diǎn)使其應(yīng)用前景十分廣闊，尤其是飲料、 糕點(diǎn)等食品工業(yè)的理想用糖。 國際市場方面，果葡糖漿在西方國家已被廣泛使用，可口可 樂、百事可樂等跨國飲料公司在國外大都使用果葡糖漿替代蔗糖 作為甜味劑。目前，美國果葡糖漿的消費(fèi)量已超過蔗糖的消費(fèi)量， 2002 年果葡糖漿消耗量為 1084 萬噸，而同年蔗糖消耗量僅為 6

31、90 萬噸；在西歐發(fā)達(dá)國家，果葡糖漿使用量已超過蔗糖使用量 的 50%；在亞洲，日本、臺(tái)灣和韓國果葡糖漿的生產(chǎn)和消費(fèi)也在 以較快的速度增加。 據(jù)美國 miles 公司統(tǒng)計(jì)，全世界果葡糖漿產(chǎn)量和葡萄糖異構(gòu) 酶的銷售額逐年上升，2002 年葡萄糖異構(gòu)酶的銷售量約為 3000 噸，銷售額達(dá)到 1 億 5 千萬美元。 我國食糖不足，每年要花數(shù)億美元進(jìn)口。盡管這樣，人均食 糖僅 8 公斤，不及發(fā)達(dá)國家的 1/8，僅為世界人均食糖 1/4 左右 （見表 1-3）。在糖類中，果葡糖漿具有蔗糖不可比擬的優(yōu)勢：味甜、 成本低、風(fēng)味醇厚、食用后不會(huì)引起血糖升高、抑制體內(nèi)蛋白質(zhì) 消耗、低熱量、易吸收、好消化等優(yōu)點(diǎn)。

32、目前我國制糖業(yè)的落后嚴(yán) 重影響著食品工業(yè)的發(fā)展，趕超世界果葡糖漿生產(chǎn)和應(yīng)用水平是 食品工業(yè)生產(chǎn)的重要任務(wù)之一，也是提升我國食品生產(chǎn)技術(shù)水平 和發(fā)展工業(yè)經(jīng)濟(jì)的重要舉措之一。因此發(fā)展果葡糖漿生產(chǎn)已引起 了國務(wù)院及輕工部的重視，計(jì)劃到 2010 年我國將要達(dá)到年產(chǎn)果 葡糖漿 330 萬噸規(guī)模，這將為葡萄糖異構(gòu)酶的市場提供廣闊的發(fā) 展前景。 2002 韓、日、美、中淀粉糖消費(fèi)情況 表 16 淀粉糖果葡糖漿蔗糖 國家 產(chǎn)量 萬噸 人均消耗 kg/人 產(chǎn)量 萬噸 人均消耗 kg/人 人均消耗 kg/人 韓國9019481018 日本22618110924 美國14185110843920 中國1601.4

33、1201.16.5 果葡糖漿廣泛應(yīng)用于飲料、糕點(diǎn)、罐頭、乳品等食品行業(yè)， 其中飲料行業(yè)占有相當(dāng)大的比例，如美國達(dá)到 70%。我國飲料工 業(yè)起步較晚，但近年來發(fā)展十分迅速，銷售額達(dá) 400 多億，全國 飲料總產(chǎn)量保持持續(xù)增長，1980 年不足 30 萬噸，1990 年猛增到 330 萬噸，到 2000 年為 1491 萬噸，20 年增長 50 多倍，平均年增 長速度為 21.8%，進(jìn)入 2001 年達(dá)到 1669 萬噸，比 2000 增長 11.94%，繼續(xù)保持兩位數(shù)的增長速度，是食品工業(yè)發(fā)展最快的行 業(yè)之一。 依照國際慣例，稱之為果汁型飲料的飲品，其果糖含量必須 在 11.7%以上，目前國內(nèi)以

34、“農(nóng)夫果園”、 “健力寶”為代表的大型飲 料生產(chǎn)企業(yè)，均開始在飲料中添加果葡糖漿。 近幾年國內(nèi)飲料實(shí)際產(chǎn)量及預(yù)測 表 17 80 年90 年2000 年2001 年2002 年2003 年 2005 年 預(yù)計(jì) 軟飲料產(chǎn)量 3033014911669242527883688 其中:含糖飲料 1000121513971847 由以上數(shù)據(jù)及分析可以看出，由于國內(nèi)果葡糖漿市場的迅猛 成長，帶動(dòng)葡萄糖異構(gòu)酶的銷量年年攀升，目前國內(nèi)葡萄糖異構(gòu) 酶的年消耗量約在 300 噸左右，并以每年 10%的速度遞增，預(yù)計(jì) 到本項(xiàng)目建成投產(chǎn)時(shí)，市場年需求量將超過 400 噸。 六、市場開發(fā)情況 目前安徽*生物技術(shù)有限公

35、司已與蚌埠明星果糖有限責(zé) 任公司（原蚌埠果糖廠）、安徽豐原集團(tuán)有限公司等企業(yè)進(jìn)行了良 好的溝通及合作，并初步達(dá)成基因重組葡萄糖異構(gòu)酶的購買及使 用意向（附件 4-5）。 同時(shí)，世界上最大的果葡糖漿生產(chǎn)廠家美國嘉吉（gargill）公 司也對(duì)*公司的基因重組葡萄糖異構(gòu)酶產(chǎn)品產(chǎn)生濃厚的興趣，近 期正與*公司接洽，希望成為其合作伙伴及該產(chǎn)品在美國的銷售 總代理。 七、結(jié)論 由以上分析可見，基因重組葡萄糖異構(gòu)酶項(xiàng)目具有十分廣闊 的市場前景。本項(xiàng)目建成投產(chǎn)后，可年產(chǎn)葡萄糖異構(gòu)酶 300 噸， 基本可滿足國內(nèi)市場的需求量，待產(chǎn)品市場逐步打開后，完全有 能力覆蓋亞洲周邊市場并出口歐美市場。 第二章 項(xiàng)目的技

36、術(shù)基礎(chǔ) 固定化葡萄糖異構(gòu)酶是生產(chǎn)果葡糖漿的生物催化劑。葡萄 糖異構(gòu)酶（gi）又稱木糖異構(gòu)酶（xyi）（ec 5.3.1.5），能將 d-木糖、 d-葡萄糖、d-核糖等醛糖轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的酮糖。因葡萄糖異構(gòu)酶結(jié) 構(gòu)穩(wěn)定，是國際上公認(rèn)的研究酶的催化機(jī)制及建立蛋白質(zhì)工程技 術(shù)的最好模型之一。工業(yè)上，葡萄糖異構(gòu)酶是大規(guī)模從淀粉制備 果葡糖漿的關(guān)鍵酶。隨著我國食品工業(yè)的迅速發(fā)展，果葡糖漿在 國內(nèi)的市場增長迅猛，對(duì)葡萄糖異構(gòu)酶的需求也在不斷增加。由 于其重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和理論研究意義，美國、日本、英國、法國、 比利時(shí)、荷蘭等發(fā)達(dá)國家對(duì)該酶的性質(zhì)、固定化工藝、基因工程、 晶體學(xué)以及蛋白質(zhì)工程等進(jìn)行了廣泛深入的研究

37、。 本項(xiàng)目主要技術(shù)原理為：利用基因工程技術(shù)改造已獲得的 7 號(hào)淀粉酶鏈霉菌 m1033 的葡萄糖異構(gòu)酶結(jié)構(gòu)基因，通過基因 突變的方法改變葡萄糖異構(gòu)酶的熱穩(wěn)定性，采取基因敲除和基因 置換的方法對(duì) 7 號(hào)淀粉酶鏈霉菌 m1033 的染色體進(jìn)行改造引入 優(yōu)勢突變位點(diǎn)，獲得性能改良、穩(wěn)定遺傳的適于工業(yè)化生產(chǎn)的基 因工程菌株，從而應(yīng)用于葡萄糖異構(gòu)酶的大規(guī)模生產(chǎn)。 國內(nèi)自六十年代起已開展了葡萄糖異構(gòu)酶應(yīng)用于果葡糖漿 生產(chǎn)的研究，山東省食品發(fā)酵工業(yè)研究設(shè)計(jì)院通過誘變篩選獲得 的 7 號(hào)淀粉酶鏈霉菌 m1033 菌株，是國內(nèi)在這方面最具應(yīng)用價(jià) 值的工業(yè)菌之一。目前國內(nèi)外主要是通過誘變篩選等手段來獲得 生產(chǎn)用菌

38、株，中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院是國內(nèi)唯一開展葡 萄糖異構(gòu)酶的蛋白質(zhì)工程的研究單位，并對(duì)葡萄糖異構(gòu)酶的催化 機(jī)理及其蛋白質(zhì)工程進(jìn)行了多年的研究和探索。經(jīng)十余年科技攻 關(guān)目前已完成葡萄糖異構(gòu)酶的蛋白質(zhì)工程改造，獲得性質(zhì)改良的 基因重組葡萄糖異構(gòu)酶；并利用基因工程方法構(gòu)建表達(dá)量極高的 基因重組鏈霉菌工業(yè)生產(chǎn)菌株，獲得了具有完整自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的 同源重組基因工程菌 m1033wz。所建立的葡萄糖異構(gòu)酶蛋白質(zhì) 工程研究系統(tǒng)在完整性和有效性上都達(dá)到國際先進(jìn)水平，在國內(nèi) 處于領(lǐng)先水平。 在該課題的研究過程中，項(xiàng)目組在國內(nèi)外知名刊物發(fā)表學(xué) 術(shù)論文十余篇（附件 4-15，4-16），并獲得安徽省高等學(xué)?？茖W(xué)技

39、術(shù)進(jìn)步獎(jiǎng)及安徽省優(yōu)秀論文獎(jiǎng)（附件 4-17）。 第一節(jié) 成果來源及知識(shí)產(chǎn)權(quán)情況 中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院獨(dú)立承擔(dān)國家“八六三”項(xiàng) 目“葡萄糖異構(gòu)酶的蛋白質(zhì)工程”（附件 4-14），歷經(jīng)十余年聯(lián)合科 技攻關(guān)目，前已完成葡萄糖異構(gòu)酶的蛋白質(zhì)工程改造，獲得性質(zhì) 改良的基因重組葡萄糖異構(gòu)酶；并利用基因工程方法構(gòu)建高表達(dá) 量的基因重組鏈霉菌工業(yè)生產(chǎn)菌株，獲得了具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的 同源重組基因工程菌 m1033wz。中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)根據(jù)學(xué)校知 識(shí)產(chǎn)權(quán)管理規(guī)定，經(jīng)慎重研究，決定將基因重組葡萄糖異構(gòu)酶技 術(shù)所有權(quán)作價(jià) 175 萬元人民幣作為學(xué)校投資投入中國科學(xué)技術(shù) 大學(xué)科技實(shí)業(yè)總公司。 （見附件 4-11

40、） 2003 年 2 月 28 日，中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)科技實(shí)業(yè)總公司以合 資成立安徽*生物技術(shù)有限公司補(bǔ)充協(xié)議的形式，將基因重 組葡萄糖異構(gòu)酶技術(shù)以 177 萬元人民幣的價(jià)格向合資公司轉(zhuǎn)讓， 其中 50 萬元按國家及學(xué)校有關(guān)政策獎(jiǎng)勵(lì)給相關(guān)技術(shù)團(tuán)隊(duì)成員。 轉(zhuǎn)讓后，基因重組葡萄糖異構(gòu)酶技術(shù)的所有權(quán)歸安徽*生物 技術(shù)有限公司所有。 （見附件 4-12、附件 4-13） 第二節(jié) 已完成研究開發(fā)工作及鑒定、中試情況 一、背景資料 葡萄糖異構(gòu)酶（glucose isomerase，簡稱 gi）結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，是國 際上公認(rèn)的研究酶的催化機(jī)制及建立蛋白質(zhì)工程技術(shù)的最好模 型之一。利用基因工程和蛋白質(zhì)工程的方法改造野

41、生型葡萄糖異 構(gòu)酶不僅具有理論研究意義而且具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，在異構(gòu)化 反應(yīng)中，溫度提高，熱力學(xué)平衡趨向于果糖方面，因此提高野生 型葡萄糖異構(gòu)酶的熱穩(wěn)定性可以增加反應(yīng)平衡過程中果糖的產(chǎn) 量，從而降低投入酶量，簡化工藝流程，提高經(jīng)濟(jì)效益。 基因的同源重組技術(shù)（homologous recombination），又稱基因 打靶（gene targeting），指外源 dna 與受體細(xì)胞染色體 dna 上的 同源序列之間發(fā)生重組并整合在預(yù)定位點(diǎn)上，從而改變細(xì)胞遺傳 特性的方法。根據(jù)重組后靶基因的特征可以分為兩種類型：1、由 于外源序列的引入或部分取代，靶基因原有結(jié)構(gòu)被破壞，此即為 基因破壞或剔除（g

42、ene disruption or knockout）；2、靶基因的全部 序列為新的基因所取代，即基因置換（gene replacement）。這一新 興技術(shù)已被證明為目前能精確的修飾基因組的最有效方法，從理 論上講它將使人類能按設(shè)計(jì)對(duì)極其復(fù)雜的細(xì)胞基因組結(jié)構(gòu)進(jìn)行 定點(diǎn)、定量的改變，從而定向的改變細(xì)胞的遺傳結(jié)構(gòu)和特征。 本項(xiàng)目在國內(nèi)首次將基因重組技術(shù)應(yīng)用于葡萄糖異構(gòu)酶的 研究和生產(chǎn)，其技術(shù)特性及所建立的葡萄糖異構(gòu)酶蛋白質(zhì)工程研 究系統(tǒng)均達(dá)到國際先進(jìn)水平，所獲得的基因重組葡萄糖異構(gòu)酶適 用于果葡糖漿的大規(guī)模生產(chǎn)，將從根本上改變我國葡萄糖異構(gòu)酶 生產(chǎn)的落后狀態(tài)。 二、成果的專利情況 目前項(xiàng)目共獲得

43、 3 項(xiàng)國家發(fā)明專利：“sm33gi 的突變酶 gig138p 及一種提高 gi 熱穩(wěn)定性的突變方案”（專利號(hào) zl95112782.9）、 “一種葡萄糖異構(gòu)酶的 247 位單突變體酶和 138，247 位雙突變體酶及其構(gòu)建方法”（專利號(hào) zl97119714.8）、 “表達(dá) m1033gi 的突變酶 gig138p 的基因工程菌株 m1033wz 及其構(gòu)建方法”(專利號(hào)：zl02143031.4)，其中“表達(dá) m1033gi 的 突變酶 gig138p 的基因工程菌株 m1033wz 及其構(gòu)建方法”已 獲得 pct 國際專利受理。 （見附件 4-6、4-7、4-8、4-9、4-10、4-11

44、） 三、成果鑒定及中試情況 該項(xiàng)技術(shù)在 2003 年 3 月安徽省科技廳組織召開專項(xiàng)科學(xué)技 術(shù)成果鑒定會(huì)上通過專家評(píng)審，認(rèn)為“該課題采用的技術(shù)方法先 進(jìn)，技術(shù)路線正確，研究成果達(dá)到國內(nèi)領(lǐng)先水平。建議盡快實(shí)現(xiàn) 產(chǎn)業(yè)化。 ”，同時(shí)獲得安徽省科技廳頒發(fā)的科學(xué)技術(shù)成果鑒定證書 （2003 年第 030 號(hào)）以及高新技術(shù)成果認(rèn)定證書（2003-001 號(hào)）。 （見附件 4-2、4-3） 2002 年 10 月 28 日至 12 月 28 日，中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)生命 科學(xué)學(xué)院委托蚌埠明星果糖有限責(zé)任公司（原蚌埠果糖廠）進(jìn)行 固定化葡萄糖異構(gòu)酶大柱轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。經(jīng)實(shí)驗(yàn)，在 68轉(zhuǎn)化溫度 及 ph 值 7.5 條件

45、下，單柱一次投入成品固定化葡萄糖異構(gòu)酶 93 公斤（含水 15.7%），經(jīng)過 60 天轉(zhuǎn)化共計(jì)生產(chǎn)出成品果葡糖漿 408.3 噸，平均轉(zhuǎn)化能力為 4.39 噸成品果葡糖漿/公斤酶，轉(zhuǎn)化率 為 52%。產(chǎn)品的各項(xiàng)性能指標(biāo)在國內(nèi)屬先進(jìn)水平，可以用于果葡 糖漿的大規(guī)模生產(chǎn)。 （見附件 4-4） 四、產(chǎn)品技術(shù)指標(biāo)及與國內(nèi)外同類產(chǎn)品比較 1、產(chǎn)品技術(shù)、質(zhì)量指標(biāo) 本項(xiàng)目產(chǎn)品將在滿足中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑 -固定化葡萄糖異構(gòu)酶制劑（gb 8274-87）的基礎(chǔ)上，全面提高 葡萄糖異構(gòu)酶各項(xiàng)性能指標(biāo)，并逐步形成企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。 產(chǎn)品的主要性能指標(biāo) 序號(hào)項(xiàng) 目理化指標(biāo) 1酶活力（60 目）6000 單位 2

46、形狀不規(guī)則桿狀，直徑 1.2mm 3色澤棕色 4含水12-18% 5比重0.45kg/l 6膨脹率2.5 倍 7轉(zhuǎn)化能力4.2-4.5 噸成品糖漿/公斤成品酶 8保存性0-5下保藏 3 個(gè)月，酶活損失 10%左右 9最適 ph7.5 10熱穩(wěn)定性最適反應(yīng)溫度 68 11金屬離子影響 cu2+、fe2+、ca2+對(duì)酶活力發(fā)揮不力； mg2+、co2+可促進(jìn)轉(zhuǎn)化 2、與國內(nèi)、外同類產(chǎn)品技術(shù)指標(biāo)比較 本項(xiàng)目產(chǎn)品系國內(nèi)首創(chuàng)，填補(bǔ)國內(nèi)空白，國內(nèi)目前無同類產(chǎn) 品。現(xiàn)將該成果技術(shù)參數(shù)與丹麥諾維信公司的同類產(chǎn)品 sweetzymeit 進(jìn)行比較如下： 序號(hào)指標(biāo)名稱單位 sweetzymeit 基因重組葡萄糖異

47、構(gòu)酶 1活力ugi35006000 2熱穩(wěn)定性55-60最適反應(yīng)溫度 68 3ph7.6-7.87.5 4轉(zhuǎn)化能力 噸成品糖漿 /公斤酶 54.2-4.5 第三節(jié) 成果的創(chuàng)新之處 本項(xiàng)目是國家“863”計(jì)劃項(xiàng)目“葡萄糖異構(gòu)酶的蛋白質(zhì)工程” 的重要成果之一，解決了提高葡萄糖異構(gòu)酶的熱穩(wěn)定性和酶活力 的難題，并為基因重組葡萄糖異構(gòu)酶的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)打下堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)， 擁有多項(xiàng)我國自主的知識(shí)產(chǎn)權(quán)，創(chuàng)新性強(qiáng)，技術(shù)水平高，難度大， 許多成果在國際上居于領(lǐng)先地位。根據(jù)查新報(bào)告（見附件 4-1）， 本項(xiàng)目的主要?jiǎng)?chuàng)新點(diǎn)和技術(shù)難點(diǎn)如下： 1、雙突變體酶 gi（g138p-g247d）的構(gòu)建技術(shù) 雙突變體酶的構(gòu)建，使困擾

48、葡萄糖異構(gòu)酶研究和生產(chǎn)領(lǐng)域多 年的野生型菌株所產(chǎn)的葡萄糖異構(gòu)酶熱穩(wěn)定性和酶活力難以充 分滿足需要的難題得以解決，為利用基因工程技術(shù)改造葡萄糖異 構(gòu)酶創(chuàng)造了條件。這一成就在國際上處于領(lǐng)先地位，并已申報(bào)國 家發(fā)明專利。 2、利用基因敲除和置換精確修飾鏈霉菌染色體技術(shù) 本項(xiàng)目利用同源重組技術(shù)，把帶有篩選基因的質(zhì)粒片斷的堿 變性形式作為同源重組單元引入野生型 m1033 染色體 dna 的 特定片段上，敲除了原有的 gi 基因。再通過雙抗性負(fù)篩選的方 法，引入目的基因，并隨染色體 dna 的復(fù)制而穩(wěn)定復(fù)制。 3、雙抗性負(fù)篩選（tsr + neo）方法的運(yùn)用 首先構(gòu)建帶有neo抗性的置換型同源重組質(zhì)粒，

49、通過neo抗性 的負(fù)篩選來解決鏈霉菌基因置換時(shí)篩選工作量大的問題。由于同 源片斷較小，同時(shí)又為了保證較高的轉(zhuǎn)化率，直接將同源重組質(zhì) 粒的堿變性形式作為同源重組單元轉(zhuǎn)化缺陷型m1033原生質(zhì)體， 獲得插入型同源重組的gi酶活恢復(fù)菌株，再以該菌株為出發(fā)菌 株，利用插入型同源重組質(zhì)粒在染色體上的不穩(wěn)定性，通過結(jié)合 tsr抗性的負(fù)篩選最終獲得基因置換菌株。 此新方法在鏈霉菌染色體研究領(lǐng)域中尚未見報(bào)導(dǎo)。 4、構(gòu)建具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的基因工程菌株 m1033wz 經(jīng)過十余年的努力構(gòu)建出的具有完整自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的基因 工程菌株 m1033wz，現(xiàn)已被中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)保 藏，是我國利用蛋白質(zhì)工程改造葡

50、萄糖異構(gòu)酶重要成果之一，標(biāo) 志著我國在這個(gè)領(lǐng)域的研究已經(jīng)跨入世界先進(jìn)行列。 “表達(dá) m1033gi 的突變酶 gig138p 的基因工程菌株 m1033wz 及其構(gòu) 建方法”已經(jīng)申請(qǐng)國家發(fā)明專利，并已獲得 pct 國際專利受理。 5、雙突變體的鏈霉菌基因工程菌株 m1033xt 的構(gòu)建 運(yùn)用同源重組單交換和雙抗性負(fù)篩選技術(shù)，構(gòu)建出具有雙突 變點(diǎn)的 gi（g138p-g247d）基因的 7 號(hào)鏈霉菌基因工程菌株 m1033xt，使 m1033xt 所產(chǎn)的葡萄糖異構(gòu)酶的各項(xiàng)主要性能均 優(yōu)于野生型 m1033 所產(chǎn)的葡萄糖異構(gòu)酶，為發(fā)展我國自己的基 因重組葡萄糖異構(gòu)酶產(chǎn)業(yè)，推動(dòng)我國果葡糖漿產(chǎn)業(yè)的發(fā)展

51、奠定了 基礎(chǔ)。該項(xiàng)成果正在申報(bào)國家發(fā)明專利。 6、建立了一套完整的蛋白質(zhì)工程技術(shù)，提高了我國蛋白質(zhì) 工程的研究水平 鏈霉菌中染色體的分子改造，利用單交換和雙交換模式獲 得兩組不同的 m1033gi 缺陷型菌株，再利用基因置換方法構(gòu)建 突變體基因工程菌株，將突變位點(diǎn)精確引入 m1033 染色體中， 是葡萄糖異構(gòu)酶領(lǐng)域國際上首次利用基因敲除和置換精確修飾 鏈霉菌染色體構(gòu)建基因工程菌株的范例，建立了一套完整的蛋 白質(zhì)工程技術(shù)，提高了我國蛋白質(zhì)工程的研究水平。 第三章 建設(shè)方案 第一節(jié) 項(xiàng)目的產(chǎn)能規(guī)模及建設(shè)的主要內(nèi)容 安徽*生物技術(shù)有限公司年產(chǎn) 300 噸基因重組葡萄糖 異構(gòu)酶項(xiàng)目選址為阜陽市經(jīng)濟(jì)技術(shù)

52、開發(fā)區(qū)，建設(shè)嚴(yán)格遵照工程優(yōu) 質(zhì)、布局合理、技術(shù)超前、生產(chǎn)環(huán)保的方針進(jìn)行。 具體建設(shè)內(nèi)容如下： 1、新征土地 11782.7 平方米； 2、建設(shè)新型標(biāo)準(zhǔn)廠房 3000 平方米（包括發(fā)酵車間、固定 化車間、分裝車間） ； 3、新建與生產(chǎn)相適應(yīng)的動(dòng)力配套設(shè)施（空壓站、變電所） ； 4、研發(fā)及品控中心樓 1500 平方米，一方面實(shí)施新產(chǎn)品的 開發(fā)和新技術(shù)的應(yīng)用研究，另一方面加強(qiáng)對(duì)原料、半成品及終 端產(chǎn)品進(jìn)行全質(zhì)量檢驗(yàn)和控制； 5、綜合辦公樓 1500 平方米（含經(jīng)營管理，廣告銷售部門， 企劃部門等） 。 第二節(jié) 采用的工藝技術(shù)路線與技術(shù)特點(diǎn) 一、工藝技術(shù)來源及先進(jìn)性 基因重組葡萄糖異構(gòu)酶的生產(chǎn)主要包括

53、菌種的擴(kuò)培、發(fā)酵、 絮凝、脫水、混合、成型、交聯(lián)、干燥、貯藏等過程，其工藝技術(shù)及 設(shè)備的先進(jìn)性主要體現(xiàn)如下： 1、因置換型鏈霉菌基因工程菌株 m1033wz 的構(gòu)建，實(shí)現(xiàn) 了基因重組葡萄糖異構(gòu)酶熱穩(wěn)定性的提高，從而在工藝上可提 高反應(yīng)溫度 10左右，進(jìn)而提高果葡糖漿的產(chǎn)量 15%。 2、適合工業(yè)化培養(yǎng)基篩選及中試規(guī)模發(fā)酵；摸索出基因 工程菌株 m1033wz 三級(jí)高密度發(fā)酵培養(yǎng)基配方，可以在較大程 度上降低生產(chǎn)技術(shù)。 3、固定化葡萄糖異構(gòu)酶的制備，采取自行研制的高分子 交聯(lián)劑和戊二醛結(jié)合，可提高固相化酶的通透性和固相化程度， 從而進(jìn)一步提高轉(zhuǎn)化能力。 4、目前選用的主體發(fā)酵及自動(dòng)化控制設(shè)備先進(jìn)

54、合理，與 三級(jí)高密度發(fā)酵工藝和固相化工藝緊密結(jié)合，可在最大程度上 提高產(chǎn)品質(zhì)量和生產(chǎn)效益。 二、生產(chǎn)工藝流程 1、工藝流程 生產(chǎn)過程將嚴(yán)格按照 iso9000 質(zhì)量管理體系并參照 gmp 生產(chǎn)管理體系進(jìn)行生產(chǎn)。其生產(chǎn)工藝流程示意圖如下： （1）菌種：基因工程菌株 m1033wz； （2）平皿分離：37培養(yǎng) 3 天，菌落隆起，周邊白色，中心鉛 灰； （3）茄子瓶培養(yǎng)：37培養(yǎng) 2 天，孢子長滿后置于冰箱保藏 備用； （4）3000 升種子罐培養(yǎng)：培養(yǎng)基加堿液調(diào)至 ph7.2-7.5，滅 菌冷卻后接入 25 個(gè)茄子瓶孢子懸浮液，通氣比 1:0.25-0.35，轉(zhuǎn) 速 250 轉(zhuǎn)/分鐘，罐壓 0.5

55、kg/cm2，37培養(yǎng) 20-22 小時(shí)，至種子萌 發(fā)正常，鏡檢無污染； （5）30000 升發(fā)酵罐培養(yǎng)：培養(yǎng)基加堿液調(diào)至 ph7.2-7.5，滅 菌冷卻后移進(jìn)種子液，通氣比 1:0.35-0.45，轉(zhuǎn)速 180 轉(zhuǎn)/分鐘，罐 壓 0.5kg/cm2，37培養(yǎng) 40-50 小時(shí)，至鏡檢菌絲無明顯斷裂或 自溶； （6）熱處理：先向發(fā)酵罐中加入 600g cocl26h2o，然后盤管 進(jìn)汽升溫至 70，保溫 10 分鐘后，速冷卻至水溫； （7）絮凝：用酸調(diào)發(fā)酵液的 ph 至 6.0，邊攪拌邊加入殼聚糖 溶液，至完全絮凝。在 ph6.0 時(shí)，殼聚糖中的氨基能與蛋白質(zhì)上 的羧基進(jìn)行縮和而牢固地結(jié)合在一

56、起迅速凝聚下來； （8）脫水：用板框壓濾機(jī)壓濾 3 小時(shí)后（含水約 85），再用 離心機(jī)甩干得含水 70左右的酶泥絮凝物； （9）混合：按酶泥絮凝物:明膠溶化液2:1 混合，拌勻后過 篩板，再加少量戊二醛溶液作前交聯(lián)； （10）成型交聯(lián)浸泡：目前采用間歇筒式擠壓成型設(shè)備，篩板 孔徑 1.2mm，成型后的固定化酶在成型液中浸泡 2 小時(shí)。并用稀 堿保持 ph7.0-7.5； （11）洗滌：用自來水浸泡洗滌 2 小時(shí)，每隔 20 分鐘換新水， 并用稀堿保持 ph7.0-7.5； （12）干燥：離心機(jī)將濕酶甩至含水約 60左右，置納倫篩 上于 45下熱風(fēng)干燥，并不斷翻動(dòng)，至含水 15左右，取出并測

57、酶活。 （13）分裝貯藏：待產(chǎn)品固定化酶涼透后，裝入 10 公斤塑料 袋中，封入紙箱。04條件下貯藏。 第三節(jié) 主要設(shè)備選型 本項(xiàng)目設(shè)備選型原則為選用國內(nèi)先進(jìn)生產(chǎn)設(shè)備，部分關(guān)鍵 生產(chǎn)設(shè)備和檢測設(shè)備選用進(jìn)口先進(jìn)設(shè)備。選用的設(shè)備具有較高的 自動(dòng)化水平，實(shí)現(xiàn)生產(chǎn)過程技術(shù)參數(shù)的程序化控制，減少人為因 素干擾。 主要設(shè)備包括菌種培養(yǎng)及化驗(yàn)部分、發(fā)酵系統(tǒng)、后提取系統(tǒng)、 動(dòng)力系統(tǒng)及其它配套設(shè)備。詳見下表。 主要設(shè)備表 一、菌種培養(yǎng)及化驗(yàn)部分 單位：萬元 序號(hào)名稱規(guī)格數(shù)量產(chǎn)地金額 1.1超凈工作臺(tái) 10000 級(jí) 4 臺(tái) 上海智城分析儀器 制造有限公司 4.0 1.2恒溫震蕩器200-300rp4 臺(tái) 上海精

58、密儀器儀表 有限公司 2.4 1.3滅菌鍋50l2 臺(tái) 上海智城分析儀器 制造有限公司 0.8 1.4低溫冰箱-861 臺(tái) 日本三洋科研醫(yī)療 設(shè)備(北京) 1.2 1.5恒溫培養(yǎng)箱60027102 臺(tái) 上海精密儀器儀表 有限公司 1.2 1.6分光光度計(jì)722 型1 臺(tái)上海精密儀器儀表0.6 有限公司 1.7旋光儀wzz1 臺(tái) 上海精密儀器儀表 有限公司 0.4 1.8恒溫干燥箱50025502 臺(tái) 上海精密儀器儀表 有限公司 1.0 1.9恒溫水浴鍋4 孔2 臺(tái) 上海精密儀器儀表 有限公司 0.6 1.10電子分析天平fa1004-0.1mg2 臺(tái) 上海精密儀器儀表 有限公司 0.8 1.1

59、1 ph 計(jì) phs-3c+2 臺(tái) 瑞士萬通 (metrohm) 0.6 1.12普通顯微鏡bk10002 臺(tái) 上海精密儀器儀表 有限公司 0.6 合計(jì)14.2 二、發(fā)酵系統(tǒng) 序號(hào)名稱規(guī)格數(shù)量產(chǎn)地金額 2.1配料罐5m32 臺(tái) 七 0 三研究所三 0 工廠 18.0 20m33 臺(tái) 七 0 三研究所三 0 工廠 52.0 2.2水解罐5m34 臺(tái) 七 0 三研究所三 0 工廠 32.0 20m34 臺(tái) 七 0 三研究所三 0 工廠 76.0 2.3種子罐系統(tǒng)5m35 臺(tái) 七 0 三研究所三 0 工廠 65.0 2.4發(fā)酵罐系統(tǒng)30m310 臺(tái) 七 0 三研究所三 0 工廠 850.0 罐體1c

60、r18ni12t2.4*7.7*12 攪拌1cr18ni1.2t100，三層槳葉， 一層消泡槳 高效冷卻管1cr18ni 6 組 50，列管排列 外冷卻夾套a3 鋼3 組30mm*1.2m 2.5管路閥門系統(tǒng)若干 七 0 三研究所三 0 工廠 200.0 2.6減速機(jī)sew15 臺(tái)德國 sew60.0 2.7 變頻儀總?cè)荩?00kva 15 臺(tái) 日本 明電舍集團(tuán) 75.0 2.8 ph 儀 ph:11420 套 瑞士萬通 (metrohm) 32.0 2.9 do 儀 20 套 瑞士萬通 (metrohm) 34.0 2.10溫度儀015015 套 上海精密儀器儀表 有限公司 1.8 2.11