泛素化蛋白檢測(cè)方法

1、泛素化蛋白檢測(cè)方法蛋白質(zhì)泛素化簡(jiǎn)介 蛋白質(zhì)泛素化修飾過(guò)程在人體免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)過(guò)程中起到了關(guān)鍵性的作用。 與 磷酸化修飾過(guò)程一樣， 泛素化修飾過(guò)程也是一種可逆的共價(jià)修飾過(guò)程， 它能夠調(diào) 節(jié)被修飾蛋白的穩(wěn)定性、功能活性狀態(tài)以及細(xì)胞內(nèi)定位等情況。泛素蛋白是一個(gè)由 76 個(gè)氨基酸殘基組成的非常保守的多肽， 它能在 E1、E2、 E3 酶等一系列酶促反應(yīng)催化下與細(xì)胞內(nèi)靶蛋白上的一個(gè)或多個(gè)賴(lài)氨酸殘基發(fā)生 共價(jià)連接。泛素蛋白本身也含有 7 個(gè)賴(lài)氨酸殘基， 因此它們之間也可以通過(guò)這些 位點(diǎn)互相連接，形成多泛素蛋白鏈（ polyubiquitin chain）。目前研究顯示，如果 多泛素蛋白鏈與被修飾蛋白上的第

2、48 位賴(lài)氨酸殘基相連，會(huì)介導(dǎo)靶蛋白進(jìn)入蛋 白酶體而被降解； 如果與被修飾蛋白上其它位點(diǎn)， 比如第 63 位賴(lài)氨酸殘基相連， 則靶蛋白可以發(fā)揮信號(hào)通路功能而不會(huì)被降解。與磷酸化修飾途徑一樣， 泛素化修飾途徑也是可逆的， 即可以通過(guò)去泛素化 酶（ DUB ）將泛素蛋白修飾物去除掉。靶蛋白經(jīng)泛素化途徑修飾之后，連接在 靶蛋白上的泛素蛋白單體或多聚體可以被各種泛素蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域（UBD ）所識(shí)別和結(jié)合。人類(lèi)蛋白質(zhì)組中含有兩種 E1 酶、50種 E2 酶、 600種 E3 酶、90 種 DUB 酶和 20 種 UBD ，這說(shuō)明泛素修飾途徑在細(xì)胞調(diào)控中起到了多么重要的 作用。 E3 酶是泛素修飾途徑中決

3、定底物特異性的關(guān)鍵酶，它可以分為兩大類(lèi)， 即含有 HECT 結(jié)構(gòu)域的 E3 酶和其它含有 RING 結(jié)構(gòu)域或 RING 樣結(jié)構(gòu)域（比如 U-box 或 PHD 結(jié)構(gòu)域）的 E3 酶。這兩種 E3 酶都在免疫調(diào)控過(guò)程中起到了關(guān)鍵 性的作用。蛋白質(zhì)泛素化的檢測(cè)方法 研究蛋白質(zhì)的泛素化首先需要明確的三個(gè)基本點(diǎn)：哪些蛋白發(fā)生了泛素化； 發(fā)生了泛素化的蛋白質(zhì)， 具體是哪個(gè)位點(diǎn)的賴(lài)氨酸殘基發(fā)生了泛素化； 進(jìn)行定量。明確了上述幾點(diǎn)后， 進(jìn)一步需要弄清楚的是， 我們感興趣的泛素化蛋白， 是 如何發(fā)生泛素化的， 影響這一泛素化過(guò)程的關(guān)鍵分子是什么？或者說(shuō)這一過(guò)程中 的 E3 酶是什么？然后需要研究的是，這一蛋白

4、質(zhì)發(fā)生泛素化之后可以產(chǎn)生那些分子效應(yīng)？對(duì) 下游的信號(hào)通路有什么影響？研究上述內(nèi)容的實(shí)驗(yàn)方法和實(shí)驗(yàn)流程：方法一： western blot and strip通過(guò) WB 檢測(cè)所有發(fā)生泛素化的蛋白條帶，拍照后，將膜 strip。然后與特 定蛋白的抗體和特定泛素化位點(diǎn)的抗體反應(yīng)，顯色拍照。通過(guò)陽(yáng)性條帶的 對(duì)比來(lái)初步判斷某一特定蛋白的特定位點(diǎn)發(fā)生了泛素化。 【具體實(shí)驗(yàn)流程附 后】方法二： western blot and immunoprecipitations 通過(guò)免疫共沉淀方法將某一特定蛋白以及與其結(jié)合的蛋白分離出來(lái)。分離 出來(lái)的蛋白再進(jìn)行 SDS電泳和 western blot分析?！揪唧w實(shí)驗(yàn)流

5、程附后】 。這 一方法可以明確具體哪個(gè)蛋白的哪個(gè)賴(lài)氨酸殘基發(fā)生了泛素化修飾。方法三： in vitro ubiquitination assay將要研究的目的基因轉(zhuǎn)染 293細(xì)胞，使其大量表達(dá)。 24h后提取并分離目的 蛋白。在體外反應(yīng) buffer 中將我們要研究的蛋白 A （被泛素化的那個(gè)蛋白） 與 UBE1，UbeH13-Uev 1 a heterodimer complex ， HA-ubiquitin 以及我們要 研究的蛋白 B（引起蛋白 A 泛素化的蛋白），共同進(jìn)行孵育。將孵育后的產(chǎn) 物進(jìn)行 IP和WB 分析?！揪唧w實(shí)驗(yàn)流程附后】 。這一方法可以明確引起哪個(gè) 蛋白是引起某蛋白發(fā)生泛

6、素化修飾的 E3 連接酶。方法四： in vitro ubiquitin-binding assay 將我們要研究的蛋白（被泛素化的蛋白）基因轉(zhuǎn)染 293 細(xì)胞，大量表達(dá)后 提純?；蛘咧苯犹崛?nèi)源性蛋白。 在體外與 K63- or K48-linked ubiquitin chain petides孵育，然后通過(guò) SDS 電泳并用泛素化抗體進(jìn)行檢測(cè)。這一方法可以 明確要研究的蛋白哪個(gè)賴(lài)氨酸殘基容易發(fā)生泛素化。方法一： WB strip 實(shí)驗(yàn)流程提取組織 /細(xì)胞的總蛋白使用總泛素化抗體檢測(cè)所有發(fā)生了泛素化的蛋白 （此時(shí)可以觀察到發(fā)生了泛素化的蛋白主要分布 在哪些分子量區(qū)間）Stripping t

7、he blot用特定蛋白的抗體 與膜反應(yīng)顯色用 Ub K63 抗體與 膜反應(yīng)顯色Merge如果總的泛素化蛋白的條帶，與特定蛋白的條帶，以 及 K63 位點(diǎn)泛素化條帶發(fā)生了重合，此時(shí)可以初步推 測(cè)，特定蛋白的第 63 位賴(lài)氨酸殘基發(fā)生了泛素化方法二： Western blot and immunoprecipitations提取組織 /細(xì)胞總蛋白用瓊脂糖珠或磁珠包被的特異蛋白抗體， 將與該蛋白結(jié)合的所有蛋白分離出來(lái)SDS 電泳用泛素化抗體進(jìn)行反應(yīng)Stripping the blot用特異抗體進(jìn)行反應(yīng)方法三： in vitro ubiquitination assay將要研究的蛋白基因轉(zhuǎn)染293 細(xì)胞使其大量表達(dá)提取蛋白，通過(guò)免疫共沉淀方法分離目的蛋白將可能發(fā)生相互作用的兩種蛋白與 UB