HTRF技術(shù)原理和應(yīng)用介紹(總4頁(yè)

1、Cisbio-HTRF技術(shù)原理和應(yīng)用簡(jiǎn)介HTRF（均相時(shí)間分辨熒光，Homogeneous Time-Resolved Fluorescence ）是一種用來(lái)檢測(cè)純液相體系中待測(cè)物的技術(shù)。該技術(shù)基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET，F(xiàn)luorescence Resonance Energy Transfer）和時(shí)間分辨熒光（TRF, Time-Resolved Fluorescence)）兩大技術(shù)，開通的一款高通量藥物篩選利器。熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）利用兩種熒光基團(tuán)的能量轉(zhuǎn)移，這兩種熒光基團(tuán)分別稱為能量供體（Donor）和能量受體（Acceptor）。Donor被外來(lái)光源激發(fā)（例如氙燈或激光）

2、，如果它與Acceptor比較接近，可以將能量共振轉(zhuǎn)移到在Acceptor上，使其受到激發(fā)，發(fā)出特定波長(zhǎng)的發(fā)射光。將Donor和Acceptor分別與相互作用的兩個(gè)生物分子結(jié)合，生物分子的結(jié)合可以將Donor和Acceptor拉到足夠近的距離，產(chǎn)生能量轉(zhuǎn)移，由于Acceptor的發(fā)射光來(lái)自能量轉(zhuǎn)移，所以實(shí)驗(yàn)中不需要將未結(jié)合與已結(jié)合的分子分開，即不需要洗滌步驟。 時(shí)間分辨熒光（TRF）TRF利用稀土元素中鑭系元素的獨(dú)特性質(zhì)，它們與普通熒光的主要區(qū)別是熒光的持續(xù)時(shí)間不同。普通熒光的半衰期為納秒級(jí)。鑭系元素的半衰期為毫秒級(jí)，有6個(gè)數(shù)量級(jí)的差別。所以，在檢測(cè)室，TRF有一個(gè)時(shí)間延遲-50us，經(jīng)過(guò)這個(gè)

3、時(shí)間延遲，普通熒光的信號(hào)幾乎為零，所以，TRF的背景非常低，反映樣品實(shí)際情況。HTRF的能量受體（技術(shù)創(chuàng)新點(diǎn)）HTRF的能量供體是銪(Eu)和鈦(Tb)的穴狀化合物。在這個(gè)穴狀化合物里，Eu和Tb被永久地嵌合在一個(gè)籠子里，結(jié)構(gòu)非常穩(wěn)定，這個(gè)結(jié)構(gòu)由J.M.Lehns教授發(fā)明的，并由此在1987年獲得了諾貝爾獎(jiǎng)。HTRF的能量受體HTRF的能量受體也有二種，XL665和d2.它們的光學(xué)性質(zhì)相同，分子量不同，前者分子量為10KD，實(shí)際上就是別藻藍(lán)蛋白（APC）。我們將APC的亞基偶聯(lián)在一起，使其不能解離，提高了穩(wěn)定性，后者分子量為1KD，在某些實(shí)驗(yàn)中有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。HTRF的操作步驟HTRF操作步驟非

4、常簡(jiǎn)單，只需要將實(shí)驗(yàn)所需試劑加進(jìn)去，然后孵育，檢測(cè)即可。HTRF實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析HTRF采用了比值法來(lái)處理數(shù)據(jù)，可以去除溶液通透率、細(xì)胞大小、細(xì)胞數(shù)量不同引起的誤差。HTRF應(yīng)用范圍G蛋白偶聯(lián)受體研究激酶活性檢測(cè)生物標(biāo)志物檢測(cè)受體第二信使檢測(cè)受體配體結(jié)合胞內(nèi)信號(hào)分子檢測(cè)胞外激酶活性檢測(cè)胞內(nèi)激酶活性檢測(cè)基于抗體的夾心法和競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)抗體檢測(cè)生物/免疫過(guò)程分析免疫檢查點(diǎn)檢測(cè)抗體重鏈含量檢測(cè)抗體輕鏈含量測(cè)定GST含量測(cè)定 CD16結(jié)合檢測(cè)HIS含量測(cè)定 CD32結(jié)合檢測(cè)CHO宿主蛋白含量測(cè)定 CD64結(jié)合檢測(cè)PD1/PD-L1 CTLA4/B7-1LAG3/MHC II CD47 / SIRP alphaCTLA4/B7-2 Adenosin A2A相互作用分析蛋白修飾實(shí)驗(yàn)室服務(wù)蛋白-蛋白 / 蛋白-多肽蛋白-DNA / 蛋白-RNA蛋白甲基化 / 蛋白乙酰化蛋白泛素化 / 蛋白水解HTRF技術(shù)優(yōu)勢(shì)：1.操作簡(jiǎn)單，空板直接加樣，加完即可檢測(cè)，時(shí)間短（加樣和孵育2h）！2.適合珍貴樣本：整個(gè)實(shí)驗(yàn)體系只需20ul3.均相檢測(cè)：無(wú)需包被，免洗ELISA，省時(shí)省力4.體系穩(wěn)定：7天內(nèi)可隨時(shí)檢測(cè)，信號(hào)基本不變5.數(shù)據(jù)客觀真實(shí)：比值處理可有效去除背景熒光，假陽(yáng)性率和價(jià)陰