生理學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告蛙心灌流.doc

1、生理學(xué)實(shí)驗(yàn)2009.12.09實(shí)驗(yàn)名稱(chēng)：蛙類(lèi)離體心臟灌流課程名稱(chēng)： 生理學(xué)實(shí)驗(yàn) 指導(dǎo)教師： 龍?zhí)斐?張碧魚(yú) 陳笑霞 實(shí) 驗(yàn) 人： 葉永鋒 08344031 學(xué) 院 ： 海洋學(xué)院 實(shí)驗(yàn)時(shí)間： 2009年12月09日 一、【目的要求】1、學(xué)習(xí)斯氏離體蛙心灌流法。2、了解心肌的生理特性。3、觀察Na+,K+,Ca2+及腎上腺素(Adr),乙酰膽堿(ACh)等對(duì)離體心臟活動(dòng)的影響。二、【原理】將離體蛙心（失去神經(jīng)支配的蛙心）保持在適宜的環(huán)境中，在一定的時(shí)間內(nèi)仍然能夠保持節(jié)律性收縮，心臟正常的節(jié)律性活動(dòng)需要一個(gè)適宜的理化環(huán)境，離體心臟也是如此，離體心臟脫離了機(jī)體的神經(jīng)支配和全身體液因素的直接影響，可以通

2、過(guò)改變灌流液的某些成分，觀察其對(duì)心臟活動(dòng)的作用。心肌細(xì)胞的自律性、興奮性、傳導(dǎo)性及收縮性，都與鈉、鉀及鈣等離子有關(guān)。血鉀濃度過(guò)高時(shí)（高于7.9mmol/L），心臟興奮性、自律性、傳導(dǎo)性及收縮性都下降，表現(xiàn)為收縮力減弱、心動(dòng)過(guò)緩和傳導(dǎo)阻滯，嚴(yán)重時(shí)心臟可停搏于舒張期。血鈣濃度升高時(shí)，心臟收縮力增強(qiáng)，過(guò)高可使心室停搏于收縮期。血鈣濃度降低，心肌收縮力減弱。血中鈉離子濃度的輕微變化，對(duì)心肌影響不明顯，只有發(fā)生明顯變化時(shí)，才會(huì)影響心肌的生理特性。腎上腺素可使心率加快、傳導(dǎo)加快及心肌收縮力增強(qiáng)，乙酰膽堿則與腎上腺素的作用相反。3、 【實(shí)驗(yàn)儀器】青蛙、 常用手術(shù)器械、蛙板(或蠟盤(pán))、蛙心夾、計(jì)算機(jī)采集系統(tǒng)、

3、張力傳感器、支架、雙凹夾、雙針形露絲刺激電極、滴管、培養(yǎng)皿(或小燒杯)、紗布、棉線、橡皮泥、任氏液。蛙心套管(斯氏套管或八木氏套管)、套管夾、065NaCl、5NaCI、2CaCl2、1KCl、1：5 000腎上腺素、1：10 000乙酰肌堿、300UmL肝素。4、 【方法與步驟】1、斯氏蛙心插管法（1）一只青蛙，雙毀髓后背位置于蠟盤(pán)中，按前面的方法暴露心臟。仔細(xì)識(shí)別心臟周?chē)拇笱?見(jiàn)右圖)。在左主動(dòng)脈下方穿一線，于動(dòng)脈圓錐處結(jié)扎(動(dòng)物個(gè)體小時(shí)，結(jié)扎位置可靠上些)。再?gòu)淖笥覂芍鲃?dòng)脈下方穿一線，并打一活結(jié)備用。左手提起主動(dòng)脈上的結(jié)扎線，右手用眼科剪在結(jié)扎線下方、沿向心方向?qū)?dòng)脈上壁剪一斜口。選

4、擇大小適宜的蛙心套管，然后將盛有少量(套管內(nèi)23 cm高度)任氏液(內(nèi)加入一滴肝素溶液)的斯氏蛙心套管，山開(kāi)口處插入動(dòng)脈圓錐(見(jiàn)右圖)。當(dāng)套管尖端到達(dá)動(dòng)脈圓錐基部時(shí)，應(yīng)將套管稍稍后退，使尖端向動(dòng)脈圓錐的背部后下方及心尖方向推進(jìn)，經(jīng)主動(dòng)脈瓣插入心室腔內(nèi)(于心室收縮時(shí)插入，但不可插得過(guò)深，以免心室壁堵住套管下口)。此時(shí)可見(jiàn)套管中血液沖人套管，并使液面隨心臟搏動(dòng)而亡下移動(dòng)，表明操作成功(否則需退回并重新插入)。用滴管吸去套管中的血液，更換新鮮任氏液。穩(wěn)定住套管后，輕輕提起備用線，將左、右主動(dòng)脈連同插入的套管用雙結(jié)扎緊(不得漏液)，再將結(jié)線固定在套管的小玻璃鉤上，然后剪斷結(jié)扎線上方的血管。輕輕提起套管

5、和心臟，看清靜脈竇的位置，于靜脈竇下方剪斷有牽連的組織，僅保留靜脈竇與心臟的聯(lián)系，使心臟離體(切勿損傷靜脈竇)。用任氏液反復(fù)沖洗心室內(nèi)余血，使套管內(nèi)灌流液不再有殘留血液。保持套管內(nèi)液面高度一致(1.52 cm)，即可進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。（2）將插好離體心臟的套管固定在支架上，用蛙心夾夾住少許心尖部肌肉 (不可夾得過(guò)多，以免因夾破心室而漏液)。再將蛙心夾上的系線繞過(guò)一個(gè)滑輪與張力傳感器相連（如右圖）。注意：勿使灌流液滴到傳感器上。調(diào)節(jié)顯示器上心臟收縮曲線的幅度適中。2、 實(shí)驗(yàn)觀察(1)記錄正常心搏曲線(2)改用065NaCI溶液灌流，并作好加藥標(biāo)記，觀察心搏變化。待曲線 氏插管裝置出現(xiàn)明顯變化時(shí)，立即吸去

6、套管中的灌流液，同時(shí)做好沖洗標(biāo)記，并用新鮮任氏液清洗23次，待心搏恢復(fù)正常。注意：換液時(shí)切勿碰套管，以免影響描記曲線的基線，同時(shí)保持灌流液面一致(以下同)。觀察可得，NaCI溶液會(huì)阻遏心臟搏動(dòng)。(3)向套管內(nèi)加26滴5NaCI(較細(xì)的套管需少加)溶液，作好加藥記號(hào)，觀察心搏曲線的頻率及振幅變化。當(dāng)曲線出現(xiàn)明顯變化時(shí)，應(yīng)立即吸去套管中的灌流液，并做好沖洗標(biāo)記，迅速用新鮮任氏液清洗23次，待心搏恢復(fù)正常。(4)同法向套管內(nèi)加入13滴2CaCI：溶液，觀察并記錄心搏曲線的變化。當(dāng)出現(xiàn)明顯變化時(shí)，立即更換任氏液，待心搏恢復(fù)正常(如果恢復(fù)遲緩，可多次沖洗)。(5)向套管中加12滴1KCl溶液，記錄心搏曲

7、線的變化。當(dāng)心搏曲線變化時(shí)，同法更換灌流液，待心搏恢復(fù)正常。(6)同法記錄套管中加入l2滴的腎上腺素溶液(1：10 000)后心搏曲線的變化。(7)同法記錄套管中加入12滴乙酰膽堿溶液(1：10 000)后心搏曲線的變化。3、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析將記錄到的各段心搏曲線附在實(shí)驗(yàn)報(bào)告中，計(jì)算給藥前后曲線的頻率、振幅和基線變化。測(cè)量結(jié)果填入表中。5、 【實(shí)驗(yàn)結(jié)果】1、正常博擊曲線圖2、滴加0.65%NaCl溶液圖分析：滴加0.65%NaCl溶液后，心跳減弱，這是由于用0.65%NaCl溶液灌注蛙心時(shí)，由于灌注液中缺乏Ca2+，以致心肌細(xì)胞動(dòng)作電位2期內(nèi)流Ca2+減少，細(xì)胞質(zhì)Ca2+濃度減少，心肌的收縮活動(dòng)

8、也隨之減弱。3、 滴加5%NaCl溶液分析：由于細(xì)胞外液中鈉濃度差梯度的變化一般對(duì)心肌活動(dòng)影響不明顯。因此上圖的心率變化與圖2滴加0.65%NaCl溶液里變化并不是很大，兩個(gè)不同濃度的相同溶液作用機(jī)理是一樣的，在此一不作過(guò)多相同分析。但如果實(shí)驗(yàn)中滴加溶液順序不一樣，若先滴加5%NaCl.再滴加0.65%NaCl溶液，所得的心搏變化就不如圖3那樣明顯了，收縮力僅出現(xiàn)很微弱的變化。4、 滴加2%CaCl溶液分析：細(xì)胞外Ca2在細(xì)胞膜上對(duì)Na內(nèi)流有競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用，稱(chēng)為膜屏障作用。Ca2 0增高時(shí)，Na內(nèi)流受抑制，細(xì)胞0期除極速度與幅度減小，使興奮性及傳導(dǎo)性均降低。Ca2 0增高使Ca2內(nèi)流增多，因此

9、慢反應(yīng)細(xì)胞0期去極化加快加強(qiáng)，傳導(dǎo)性增高，而快反應(yīng)細(xì)胞平臺(tái)期縮短，有效不應(yīng)期縮短，復(fù)極加速。Ca2內(nèi)流增多，使心肌收縮能力增強(qiáng)。Ca2 0降低時(shí)，所引起的變化與高鈣時(shí)相反。因此加入CaCl2后，心率減少、振幅減少，基線上移。5、 滴加1%KCl溶液分析：滴加1后的心搏曲線發(fā)現(xiàn)，曲線的頻率逐漸減小，愈來(lái)愈疏，幅度逐漸下降，最后停止在基線處，即心臟停博于舒張狀態(tài)。因?yàn)楫?dāng)細(xì)胞K+濃度增高時(shí)，K+與Ca2+有競(jìng)爭(zhēng)性拮抗作用，K+抑制細(xì)胞膜對(duì)Ca2+的轉(zhuǎn)運(yùn)，使進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)Ca2+減少，心肌的興奮收縮偶聯(lián)過(guò)程減弱，心肌收縮力降低。所以心搏曲線振幅減小。6、 滴加1：10000腎上腺素溶液分析：滴加腎上腺素后

10、，蛙心收縮增強(qiáng)，心臟舒張完全，描記的心搏曲線幅度明顯增大。其作用機(jī)理是，腎上腺素可與心肌細(xì)胞膜上的B受體結(jié)合，提高心肌細(xì)胞和肌漿網(wǎng)膜Ca2+通透性，導(dǎo)致肌漿中Ca2+濃度增高，使心肌收縮增強(qiáng)。另外，腎上腺素還有降低肌鈣蛋白與Ca2+親和力，促使肌鈣蛋白對(duì)Ca2+的釋放速率增加，提高肌漿網(wǎng)膜攝取Ca2+的速度，刺激Na+與Ca2+交換，使復(fù)極期向細(xì)胞外排出Ca2+的作用加速，這樣，將使心肌舒張速度增快，整個(gè)舒張過(guò)程明顯增強(qiáng)。7、 滴加1：10000乙酰膽堿溶液分析：上圖可示，蛙心收縮減弱，心率減慢，最后出現(xiàn)蛙心停止舒張階段。其機(jī)理為：乙酰膽堿與心肌細(xì)胞膜M受體結(jié)合，一方面提高心肌細(xì)胞膜K+通道的

11、通透性，促使K+外流，將引起：1）竇房強(qiáng)細(xì)胞復(fù)極時(shí)K+外流增多，最大復(fù)極電位絕對(duì)值增大；Ik衰減過(guò)程減弱，自動(dòng)除極速度減慢。這兩方面因素導(dǎo)致竇房自律性降低，心率減慢。2）復(fù)極過(guò)程中K+外流增加，動(dòng)作電位2、3期縮短，Ca2+進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)減少，使心肌收縮減弱；另一方面乙酰膽堿可直接抑制Ca2+通道，減少Ca2+內(nèi)流，進(jìn)而使心肌收縮減弱。表一：各測(cè)量結(jié)果比較表 1改變灌流成分對(duì)蛙離體心臟活動(dòng)的影響實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目心率/（次/min）振幅/g基線變化（上移或下移）其他0.65對(duì)照521.47給藥511.47心收縮力減弱恢復(fù)521.85對(duì)照521.8給藥512.82上移心收縮力減弱恢復(fù)622.62對(duì)照491.6

12、5給藥492.16上移收縮力沒(méi)有明顯增大，但基線上移明顯恢復(fù)501.94上移1對(duì)照522.27給藥591.91稍上移心收縮力減弱恢復(fù)582.05110000腎上腺素對(duì)照511.83給藥512.64心收縮力增強(qiáng)恢復(fù)552.67110000乙酰膽堿對(duì)照461.06給藥01.06心收縮力減弱恢復(fù)520.77上移6、 【注意事項(xiàng)】1. 制備蛙心標(biāo)本時(shí)，勿傷及靜脈竇。 2 .上述各實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目，一旦出現(xiàn)作用應(yīng)立即用正常任氏液換洗，以免心肌受損，而且必須待心搏恢復(fù)正常后方能進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。 3. 復(fù)習(xí)心肌生物電的產(chǎn)生機(jī)制及各種離子對(duì)心臟活動(dòng)的影響。4. 盡量選用健壯、體大的雄性蟾蜍，手術(shù)過(guò)程中注意保護(hù)心臟，避

13、免損傷。5. 實(shí)驗(yàn)中及時(shí)用任氏液沖洗心臟，待曲線恢復(fù)平穩(wěn)后再進(jìn)行下一步操作。6. 每次更換任氏液都必須保持灌流液液面高度恒定，以免因灌流量變化而影響結(jié)果。7. 嚴(yán)格控制每次藥品加入量，先加一滴，效果不明顯再加一滴。8. 滴加藥品和換取正常任氏液，須及時(shí)標(biāo)記，以便觀察分析。 9. 吸滴瓶中的任氏液和吸蛙心套管內(nèi)溶液的吸管應(yīng)區(qū)分專(zhuān)用，不可混淆使用，以免影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果?！舅伎碱}】1. 離體蛙心制備好后，有時(shí)候館內(nèi)的液面上下移動(dòng)很不明顯，是何原因？如何處理？答：離體蛙心制備好后，蛙心插管內(nèi)的液體應(yīng)隨蛙心室的收縮和舒張活動(dòng)而上下移動(dòng)。其實(shí)質(zhì)是：在心室收縮時(shí)，心室容積減少，室內(nèi)壓升高，將心室內(nèi)的液體壓入插管

14、內(nèi)，管內(nèi)液面上升；在心室舒張的時(shí)候，心室容積增大，心室內(nèi)壓減少，將插管內(nèi)液體吸入心室，管內(nèi)液面下降。但是有時(shí)候蛙心插管內(nèi)液面波動(dòng)不明顯，其主要原因是： 插管內(nèi)尖端出現(xiàn)血凝塊。插管內(nèi)液體不能順暢的進(jìn)出心室腔內(nèi)。解決方法為用長(zhǎng)吸管將血凝塊吸出，在吸出血凝塊后，應(yīng)立即用新鮮任氏液換洗插管內(nèi)液體幾次，直至蛙心顏色變淡，插管內(nèi)無(wú)血液和小血塊為止。 插管尖端不在心室腔內(nèi)，而是在心房或者脈間結(jié)締組織等地方。解決方法為將插管重新插入心室，確定無(wú)誤后，再結(jié)扎固定。 插管進(jìn)入心室腔內(nèi)過(guò)深，以致尖端抵住了心室壁。解決方法為將插管稍稍外提，使插管口正好處于心室腔內(nèi)，且開(kāi)口正對(duì)著液體噴射的軸流方向。 蛙心由于長(zhǎng)期心肌失

15、血，導(dǎo)致活力下降。解決方法為向插管內(nèi)滴加少許腎上腺素或者對(duì)其進(jìn)行外加力使其起搏，使其活動(dòng)增強(qiáng)。 房室傳導(dǎo)阻滯。在插管的操作中，由于操作失誤，對(duì)心臟造成的損害過(guò)大，最后導(dǎo)致房室傳導(dǎo)阻滯。由于這種傷害是不可逆轉(zhuǎn)的，所以必須改換蛙心重做實(shí)驗(yàn)。2. 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，為什么必須保持蛙心插管內(nèi)液面高度的恒定？液面過(guò)高或過(guò)低會(huì)產(chǎn)生怎樣的影響？答：在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，蛙心插管內(nèi)液面高度發(fā)生變化，心臟收縮曲線會(huì)相應(yīng)發(fā)生變化。心肌縮短幅度和速度受到前負(fù)荷和后負(fù)荷的影響。插管液面高度所產(chǎn)生的壓力，在心室舒張期末期相當(dāng)于心肌的前負(fù)荷，心室開(kāi)始收縮的時(shí)候，此液體所產(chǎn)生的壓力又成為心肌收縮時(shí)的后負(fù)荷。故高度的改變，進(jìn)而引起的前后負(fù)

16、荷的改變將改變心肌收縮的幅度和頻率。當(dāng)液面過(guò)高時(shí)。心縮曲線幅度將降低。因?yàn)檫^(guò)高的液面，將使心室前負(fù)荷超過(guò)了最適前負(fù)荷，將導(dǎo)致粗細(xì)肌絲過(guò)于疏遠(yuǎn)，而導(dǎo)致收縮的潛力減少，心肌收縮不再增加或下降。而類(lèi)似的，過(guò)高的后負(fù)荷，也使心肌收縮的幅度和速度大大下降。而當(dāng)液面過(guò)低時(shí)，心室收縮的幅度也會(huì)減少。因?yàn)榍柏?fù)荷過(guò)小，將導(dǎo)致粗細(xì)肌絲過(guò)于接近，而導(dǎo)致收縮的潛力減少，實(shí)際上，此時(shí)由于前負(fù)荷的減少導(dǎo)致心室收縮的效力的減少比前負(fù)荷增加而導(dǎo)致的還有明顯。類(lèi)似的，后負(fù)荷相應(yīng)的減少也會(huì)導(dǎo)致心室收縮的減弱。所以，在實(shí)驗(yàn)中保持最適的液面高度。是取得較好實(shí)驗(yàn)結(jié)果的前提。3 各種離子成分改變蛙心收縮的原理是什么？答：由于心肌細(xì)胞生物

17、電活動(dòng)和收縮過(guò)程與離子密切相關(guān)，因此，細(xì)胞外液中離子濃度升高或降低均會(huì)影響到心肌的電生理特性和收縮性。（1） 鉀離子的影響 K與靜息電位的形成有關(guān)。細(xì)胞外液K濃度K0變化對(duì)心肌生理特性的影響較為復(fù)雜。高鉀：K0輕度或中度增高時(shí)，膜內(nèi)、外K濃度差減小，靜息電位絕對(duì)值減小，與閾電位差距縮短，因此，興奮性增高。 K0顯著升高時(shí)，由于靜息電位絕對(duì)值減小過(guò)多（膜內(nèi)達(dá)-55mV左右），Na通道失活，因而興奮性降低甚至消失。另外，還使0期去極化速度和幅度減小，傳導(dǎo)性降低，導(dǎo)致興奮傳導(dǎo)減慢，甚至傳導(dǎo)阻滯。此外， K0增高還可提高膜對(duì)K的通透性，加速K外流，動(dòng)作電位平臺(tái)期縮短，因此，不應(yīng)期縮短。此外由于平臺(tái)期縮短，減少了Ca2的內(nèi)流，加上細(xì)胞外K與Ca2在膜上有競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用，導(dǎo)致心肌收縮功能減弱；（2） 鈣離子的影響 細(xì)胞外Ca2在細(xì)胞膜上對(duì)Na內(nèi)流有競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用，稱(chēng)為膜屏障作用。Ca2 0增高時(shí)，Na內(nèi)流受抑制，細(xì)胞0期除極速度與幅度減小，使興奮性及傳導(dǎo)性均降低。Ca2 0增高使Ca2內(nèi)流增多，因此慢反應(yīng)細(xì)胞0期去極化加快加強(qiáng)，傳導(dǎo)性增高，而快反應(yīng)細(xì)胞平臺(tái)期縮短，有效不應(yīng)期縮短，復(fù)極加速。Ca2內(nèi)流增多，使心肌收縮能力增強(qiáng)。Ca2 0降