兩種藥用植物內(nèi)生真菌次生代謝產(chǎn)物及其生物活性的研究

1、兩種藥用植物內(nèi)生真菌次生代謝產(chǎn)物及其生物活性的 研究 論文分類號(hào) 學(xué)校代碼： 10708 學(xué) 號(hào)： BS0908005 博士學(xué)位論文 Dissertation fo r Doctor s Degree 兩種藥用植物內(nèi)生真菌次生代謝產(chǎn)物 及其生物活性的研究 SECONDARY METABOLITES OF ENDOPHYTIC FUNGI FROM TWO MEDICINAL PLANTS AND THEIR BIOACTIVITIES 張弘弛 指導(dǎo)教師姓名：馬養(yǎng)民 學(xué)科名稱：應(yīng)用化學(xué) 論文提交日期: 論文答辯日期: 學(xué)位授予單位: 答辯委員會(huì)主席: 評(píng)閱人: 申請(qǐng)工學(xué)博士 學(xué)位論文 論文題目:

2、 兩種藥用植物內(nèi)生真菌次生代謝產(chǎn)物 及其生物活性的研究 學(xué)科門類：工學(xué) 一級(jí)學(xué)科：化學(xué)工程與技術(shù) 培養(yǎng)單位：化學(xué)與化工學(xué)院 博士生：張弘弛 導(dǎo) 師：馬養(yǎng)民 教授 2012 年 10 月 SECONDARY METABOLITES OF ENDOPHYTIC FUNGI FROM TWO MEDICINAL PLANTS AND THEIR BIOACTIVITIES A Dissertation Submitted to Shaanxi University of Science and Technology in Partial Fulfillment of the Requirement

3、for the Degree of Doctor of Engineering Science By Zhang Hongchi Dissertation Supervisor: Professor Ma Yangmin October, 2012 兩種藥用植物內(nèi)生真菌次生代謝產(chǎn)物及其生物活性的研究 摘要 植物內(nèi)生真菌是具有高度多樣性的微生物資源，代謝產(chǎn)物多種多樣， 目 前被認(rèn)為是抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抗氧化、殺蟲等天然活性物質(zhì)的重要資 源。為了尋找更多的生物活性物質(zhì)，本論文采用活性追蹤的方法，研究了 4 株來源于藥用植物的內(nèi)生真菌的活性代謝產(chǎn)物。 內(nèi)容包括： 藥用植物 （杜仲 和無花果） 內(nèi)

4、生真菌的分離的初步鑒定； 抗菌活性菌株的分級(jí)組合篩選； 活 性菌株的鑒定和發(fā)酵條件考察； 活性成分的追蹤分離； 單體化合物的結(jié)構(gòu)解 析；單體化合物生物活性的初步評(píng)價(jià)。概括如下 （1）以杜仲和無花果為研究對(duì)象， 共獲得了 119 株內(nèi)生真菌。 從杜 仲 根、莖、葉中分離得到 62 株內(nèi)生真菌，初步形態(tài)學(xué)鑒定，這些內(nèi)生真菌分 屬于 7 目，9 科，15 屬，其中曲霉屬 Aspergillus sp. ，鐮孢霉屬 Fusrium sp. ， 鏈格孢屬 Alternaria sp. 是杜仲內(nèi)生真菌的優(yōu)勢(shì)種群。從無花果根、莖、 葉中 分離得到 57 株內(nèi)生真菌，初步形態(tài)學(xué)鑒定，分屬于 7 目，10 科，

5、21 屬。 中鐮孢霉屬 Fusrium sp. ，青霉屬 Penicillium sp. ，曲霉屬 Aspergillus sp. 是無 花果內(nèi)生真菌的優(yōu)勢(shì)種屬。 不同部位分離內(nèi)生真菌的數(shù)量、 種類和分布不盡 相同，這就表明這兩種藥用植物的不同部位內(nèi)生真菌的數(shù)量、 分布和種群存 在差異。 （2 ）采用抗菌活性篩選為主、 代謝產(chǎn)物化學(xué)成分篩選為輔的二級(jí)組 合 篩選模式，得到如下結(jié)果：抗菌活性初篩確定活性菌株共有 20 株（杜仲內(nèi) 生真菌 11 株，無花果內(nèi)生真菌 9 株），篩選率為 16.8 %；抗菌活性復(fù)篩篩 選到 12 株高抗菌活性的內(nèi)生真菌，篩選率為 10.1 %；結(jié)合化學(xué)成分復(fù)篩最 這

6、4 株具有高抗菌活 后確定了 ER12 、EL09 、FR02 、FL10 性，并且代謝產(chǎn) 物種類豐富的內(nèi)生真菌作為本論文的研究對(duì)象。 （3 ）根據(jù)菌株的形態(tài)、培養(yǎng)特征、 18S rDNA 以及 ITS 序列分析結(jié) 果， 對(duì)活性菌株 ER12 、EL09 、FR02 和 FL10 進(jìn)行菌種鑒定，分別鑒定為刀孢 蠟 蚧菌、黑曲霉、溜曲霉以及三線鐮孢。以菌絲體生物量、發(fā)酵產(chǎn)物重量、抗 菌活性、薄層色譜分析以及高效液相色譜分析為評(píng)價(jià)依據(jù)，對(duì) 4 株活性內(nèi) 生 真菌進(jìn)行了發(fā)酵產(chǎn)物穩(wěn)定性試驗(yàn)， 培養(yǎng)基選擇試驗(yàn)， 發(fā)酵時(shí)間試驗(yàn)， 萃取實(shí) 驗(yàn)，確定了 4 株活性內(nèi)生真菌的擴(kuò)大培養(yǎng)條件以及提取條件。 4 ）經(jīng)

7、過擴(kuò)大培養(yǎng)，采用常規(guī)的硅膠柱層析、反相硅膠柱層析，凝 Sephadex LH-20 柱層析、制備薄層層析以及重結(jié)晶等分離手段，從 4 株活 性 內(nèi)生真菌分離到 90 個(gè)單體化合物。利用各種現(xiàn)代波譜技術(shù) （ EI-MS 、 1 13 1 1 HR-ESI-MS、H-NMR、C-NMR、DEPT、H- HCOSY、HSQC HMBC等） 并結(jié)合化學(xué)方法鑒定了這 90 個(gè)化合物的結(jié)構(gòu)， 其中新化合物 3 個(gè)，分別是 malformin E （19）、 cyclo- N-methyl-Trp-Leu （62 ）和 helovlic acid ester （ 83）。 從 ER12 中分離到 34 個(gè)化

8、合物， 其代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)類型是 12 個(gè)環(huán)二 肽 類化 合物（ 3-10 ，13-16 ），1 個(gè)新的 環(huán)五肽化 合物 （ 19）， 4 個(gè) fumiquinazoline 生物堿類化合物（ 17，18， 22 ，23 ），2 個(gè)二苯酮類化合物（ 20 ，21 ）， 1 個(gè) 咪唑類化合物（12），2 個(gè)甾體化合物（1，2 ），8 個(gè)苯的衍生物 （11，24-28 ， 31，32 ）及 4 個(gè)核酸苷（ 29 ， 30，33， 34 ）。從 EL09 中分離到 18 個(gè)化 合物， 其代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)類型是 9 個(gè)甾體類化合物（ 38-44, 1, 2 ），3 個(gè)脂肪酸 （35-37 ），2 個(gè)呋喃類

9、化合物（ 45 ，46 ），2 個(gè)多羥基醇化合物（ 47 ， 48 ）及 2 個(gè)吲哚類化合物（ 49 ， 50 ）。從 FR02 中分離到 22 個(gè)化合物，其代謝 產(chǎn)物 的結(jié)構(gòu)類型是 13 個(gè)吲哚二酮哌嗪類化合物（ 53-65 ，其中 62 為新化合物， 65 為新天然產(chǎn)物），2 個(gè)萜類化合物 （51，52 ），2 個(gè)甾體化合物 （1，39 ）， 2 個(gè)多元羧酸（ 67， 68 ）和 1 個(gè)多元醇（ 66 ）。從 FL10 中分離到 33 個(gè) 化合 物，其代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)類型是 7 個(gè) gliotoxin 類化合物（ 74-80 ）， 3 個(gè)煙 曲霉 酸的衍生物（81-83 ），3 個(gè)環(huán)二肽化合

10、物 （13，14，84），5 個(gè)脂肪酸（69-71， 36，37 ），4 個(gè)甾體化合物（ 1，39，72，73），3 個(gè)苯 的衍生物（ 87-89 ）， 4 個(gè)堿基或核酸苷（ 29 ，30，85，86）及 4 個(gè)多元羧酸或多元醇（ 47 ，48 ， 68， 90 ）。 （5 ）采用 MIC 法，以 11 種指示菌（ 4 個(gè)細(xì)菌和 7 個(gè)植物病原真 菌） 為模型，對(duì) 4 株活性內(nèi)生真菌產(chǎn)生的 90 個(gè)單體化合物進(jìn)行抑菌活性評(píng)價(jià)， 結(jié)果表明有 26 個(gè)化合物對(duì)指示菌顯示了較強(qiáng)的抑制作用。 新化合 物 19 (malformin E )和 83(helovlic acid ester)對(duì)多種指示菌表

11、 現(xiàn)了很強(qiáng)的抗菌 作用。綜合分析抗菌活性測試的結(jié)果，明確了 4 株活性內(nèi)生真菌生物活性 物 質(zhì) 的 類 別 ， ER12 Lecanicilliumpsalliotae的 活 性 物 質(zhì) 主 要 是 fumiquinazoline 類生物堿和環(huán)肽類化合物； EL09Aspergillus niger的活性物質(zhì)主要是甾 醇類 和呋喃類化合物； FR02Aspergillus tamarii 的活性物質(zhì)主要是吲哚二酮 哌嗪 生物 堿 類 化合 物； FL10 Fusariumtricinctumi的活 性物 質(zhì) 主 要是 gliotoxin 類 生物堿和煙曲霉酸類化合物 采用MTT法，以3個(gè)腫瘤細(xì)

12、胞株（MCF-7人乳腺癌細(xì)胞、HepG2人肝 癌細(xì)胞、 A549 人肺癌細(xì)胞）為模型，對(duì)分離得到的新化合物和生物堿類代 II 謝產(chǎn)物的抗腫瘤活性進(jìn)行了初步評(píng)價(jià)， 結(jié)果表明這些化合物對(duì)不同腫瘤細(xì)胞 系表現(xiàn)出不同程度的增殖抑制活性。 其中新化合物 malformin E （ 19）MCF-7 和 HepG2 系表現(xiàn)出很好的細(xì)胞毒活性， IC50分別 是 0.65和 2.42 卩 M ; fumiquinazoline C（18）和 fumiquinazoline J （23 ）對(duì) HepG2和 A549腫瘤 細(xì)胞的增殖有抑制作用，verruculogen（ 56 ）對(duì)HepG2和 A549腫瘤細(xì)胞

13、表 現(xiàn)出很強(qiáng)的細(xì)胞毒性，IC50分別是1.95和2.56卩M 。 總之，本文經(jīng)過篩選獲得 4 株活性內(nèi)生真菌，通過 分離鑒定闡明了 4 株內(nèi)生真菌中 90 個(gè)化合物的結(jié)構(gòu)， 其中包括 3 個(gè)新化合物。 評(píng)價(jià)了這些單 體化合物的抗菌活性和抗腫瘤活性， 發(fā)現(xiàn)了 26 個(gè)單體化合物具有較強(qiáng)抗菌 活性和 4 個(gè)單體化合物具有較強(qiáng)抗腫瘤活性。上述研究結(jié)果證明植物內(nèi)生 真 /、 菌作為植物生態(tài)一個(gè)重要的組成部分，是新結(jié)構(gòu)和新活性物質(zhì)的主要來源， 是尋找藥物先導(dǎo)化合物的重要資源 關(guān)鍵詞： 藥用植物；內(nèi)生真菌；活性篩選；次級(jí)代謝產(chǎn)物；生物活性 III SECONDARY METABOLITES OF ENDO

14、PHYTIC FUNGI FROM TWO MEDICINAL PLANTS AND THEIR BIOACTIVITIES ABSTRACT Endophytic fungi are a special and important microorganisms with taxonomic diversity, which show high potential as sources of antimicrobial, antiviral, anticancer, antioxidant, and insecticidal compounds. In order to investigate

15、 the potential bioactive compounds derived from endophytic fungi, this dissertation described the discovery of several antimicrobial compounds isolated from four endophytic fungi of plants by bioassay-guided group of medicinal fractionation. Studies include isolating of endophytic fungi, seleeting a

16、imed strains, fermentation studies, bioassay-guided fractionation, structural elucidation, preliminary evaluation of antimicrobial and anti-tumor activities of pure compounds. The results are concluded as follows: Sixty-two strains isolated from roots, stems and leaves of Eucommia ulmoides, were cla

17、ssified, identified, and belonged to fifteen genera, nine families, and seven orders according to their morphological and micro-structure characters. Alternaria sp., Fusrium sp. and Alternaria sp. are dominant endophytic fungi population in Eucommia ulmoides . Fifty-seven strains from Ficus carice w

18、ere classified, identified,and belonged to twenty-one genera, ten families, and seven orders while Fusrium sp., Penicillium sp. and Alternaria sp. are dominant endophytic fungi population. It showed that the quantities, species, and distribution of the endophytic fungus varied in different parts of

19、Eucommia ulmoides and Ficus carice . The endophytic fungi isolated from Eucommia ulmoides and Ficus carice , were first screened by antimicrobial assay to obtain 20 strains which showed strong antimicrobial activities, and possessed 16.8 % of total 119 strains tested. The 20 strains were subjected t

20、o the flow antimicrobial secondary screening and 10 strains were found to have more strong activities, which possessed 10.1 % of total 119 strains tested. On the basis of antimicrobial activities, the results of IV TLCand HPLCanalysis, four ested strains, ER12, EL09, FR02and FL10, were chosen as the

21、 aimed strains to investigate their bioactive metabolites in this study. According to their morphology, cultural characteristics, 18S rDNA and ITS sequences, the strains ER12, EL09, FR02 and FL10 were indentified as Lecanicillium psalliotae, Aspergillus niger , Aspergillus tamari and Fusarium tricin

22、ctum, respectively. Onthe basis of mycelia biomass, weight of fermentation extracts, antimicrobial activities, the results of TLC and HPLC analysis, stability-tests for the bioactive components and fermentation studies perfomred on the aimed strains. The time course experiments for the fermentation

23、of four strains were then carried out, followed by solvent extraction tests for the active components. Then, large-scale fermentation and preparation of the active fractions were perfomred to obtain the active fractions of the four strains. Ninety compounds were isolated from the four active strains

24、 by repeated column chromatography on silica gel, Sephadex LH-20, preparative thin layer chromatography PTLC and recrystallization. The structures of these compounds were elucidated by means of spectroscopic methods including 13 imidazoles 12sterols 1, 2benzene derivatives ESI-MS, HR-ESI-MS, 1D-NMR

25、H NMR, NMR, DEPT and 2D-NMR 1 1 H- H COSY,HSQC,HMBC as well as chemical method. Amongthem there were three new compounds, malformin E 19 , cyclo- N-methyl-Trp-Leu 62 and helovlic acid ester 83 . Thirty-four compounds were isolated from fungus ER12, and the chemical structure types of compoundswere i

26、nvolved in cyclic dipeptides 3-10, 13-16 , malformin E 19 , fumiquinazolines 17, 18, 22, 23 , diphenyl ketones 11, 24-28, 31, 32 and nucleosides 29, 30, 33, 34 . Eighteen compounds were isolated from fungus EL09, and the structure types of compounds were involved in sterols 38-44, 1, 2 , fatty acids

27、 35-37 , furan derivatives 45, 46 , polyhydric alcohols 47, 48 and indole derivatives 49, 50 . Twenty-two compounds were isolated from fungus FR02, and the structure types of compounds were involved in indolyl diketopiperazine analogs 53-65 , terpenes 51, 52 , sterols 1, 39 , polycarboxylic acids 67

28、, 68 and polyhydric alcohols 66 . Thirty-three compounds were isolated and the structure types of V compounds were involved helvolic acid derivatives from fungus Fl10, in gliotoxins 74-80 , 14, 84 , fatty acids 69-71, 36, 37 , 87-89 , nucleosides 29, 81-83 , cyclic dipeptides 13, sterols 1, 39, 72,

29、73 , benzene derivatives 30, 85, 86 , polyhydric alcohols and polycarboxylic acids 47, 48, 68, 90 . Ninety compounds were evaluated for their antimicrobial activities agains eleven tested strains. The results indicated that twenty-six compounds showed strong antimicrobial activities and the structur

30、e types of bioactive compounds were involved in indolyl diketopiperazines, gliotoxins, quinazoline alkaloids, cyclic dipeptides and sterols. Remarkably, malformin E and helovlic acid ester show strong antimicrobial activities against different tested strains. The results of antibacterial activity te

31、st indicated bioactive substances of four active fungi. Active substances of ER12 were mainly fumiquinazoline alkaloids and cyclic peptide compounds. Active substances of EL09 were sterols and furans. Active substances of FR02were indolyl diketopiperazines. Active substances of FL10 were gliotoxins

32、and helvolic acid derivatives. Three new compounds and isolated alkaloids were evaluated for their cytotoxicities against three cancer cell lines, MCF-7, HepG2and A549, by the MTTmethod. The results indicated that four of them showedsignificantcytotoxicities against different cancer cell lines and o

33、thers were weak. Among them, new compond, malformin E, showed significant inhibitory activities against MCF-7 and HepG2 cell lines with IC50 0.65, 2.42 卩 M respectively. Fumiquinazoline and fumiquinazoline J exhibited moderate activities against HepG2 and A549. Verruculogen showed significant inhibi

34、tory activities against HepG2 and A549 with IC50 1.95, 2.56 卩M. Summarily, this work obtained four active fungi from two medicinal plants and ninety compounds, including three new compounds and a new natural product, were isolated from the fungi. The bioactivities results indicated that twenty-six c

35、ompounds showed significant antimicrobial activities and four compoundsshowedsignificant cytotoxicities against different cancer cell lines. This thesis indieated that endophytic fungi, as an important part of plant system, which contain novel and bioactive compounds in its secondary metabolisms, is

36、 an important source for searching lead compounds for drugs. KEY WORDS:medicinal plant, endophytic fungi, active screening, secondary metabolites, bioactivity VI 縮略詞語 HPLC high performance liquid chromotography ITS Internal Transcribed Spacer PDB Potato Dextrose Broth SDB Sabouraud s Dextrose Broth

37、CDB Czapek-Dox Broth PYG Peptone Yeast extract Glucose medium MeOH methanol CHCl3 chloroform Pet. petroleum DMSO demethylsulfoxide EtOAc ethyl acetate TLC thin-layer chromatography Recrys. Recrystallize NMR nuclear magnetic resonance DEPT distortionless enhancement by polarization transfer HMBC 1H-d

38、etected heteronuclear multiple bond connectivity HMQC 1H-detected heteronuclear multiple quantum coherence COSY shift correlation spectrosocopy 1D NMR one dimensional NMR 2D NMR two dimensional NMR ESI-MS electrospray ionization mass spectra HRESI-MS high resolution electrospray ionization mass spec

39、troscopy mp. melting point Rf value of relative mobility MIC minimal inhibitory concentration IC50 half inhibitory concentration MTT 3- 4,5-dimethyl-2-thiazoyl -2,5-diphenyl-tetrazolium bromide DMEM Dulbecco s modified Eagle medium RPMI Roswell Park Memorial Institute VII Structure of secondary meta

40、bolites 1-90， *new compounds) XI XII 目 錄 摘 要 ABSTRACT .IV 縮略詞 語 VII Structureofsecondary metabolites VIII 1 文 獻(xiàn) 綜 述 1 1.1 內(nèi) 生 真 菌 的 定 義 1 1.2 內(nèi) 生 真 菌 的 研 究 方 法 和 內(nèi) 容 2 1.2.1 內(nèi) 生 真 菌 的 分 離 培 養(yǎng) 和 鑒 定 1.2.2 內(nèi)生真菌活性菌株的篩 2 選 4 1.2.3 內(nèi) 生 真 菌 的 發(fā) 酵 培 養(yǎng) 條 件 6 1.2.4 內(nèi) 生 真 菌 代 謝 產(chǎn) 物 的 提 取 、 分 離 和 鑒 定 6 1.3 內(nèi) 生

41、 真 菌 活 性 代 謝 產(chǎn) 物 的 研 究 進(jìn) 展 7 1.3.1 抗 菌 活 性 的 內(nèi) 生 真 菌 代 謝 產(chǎn) 物 7 1.3.2 抗 腫 瘤 活 性 的 內(nèi) 生 真 菌 代 謝 產(chǎn) 物 27 1.3.3 抗 HIV 活 性 的 內(nèi) 生 真 菌 代 謝 產(chǎn) 物 41 1.3.4 殺 蟲 活 性 的 內(nèi) 生 真 菌 代 謝 產(chǎn) 物 43 1.3.5 抗 氧 化 活 性 的 內(nèi) 生 真 菌 代 謝 產(chǎn) 物 46 1.3.6 酶 抑 制 劑 活 性 的 內(nèi) 生 真 菌 代 謝 產(chǎn) 物 .46 1.3.7 其 他 生 物 活 性 的 內(nèi) 生 真 菌 代 謝 產(chǎn) 物 .47 1.4 研 究 的 目

42、 的 和 意 義 49 2 兩 種 藥 用 植 物 內(nèi) 生 真 菌 的 分 離 和 活 性 菌 株 的 篩 51 2.1 內(nèi)生真菌 的分離及鑒 I 析 定 51 2.1.1 料 實(shí)驗(yàn)方 51 2.1.2 法 52 2.1.3 結(jié)果 與分 53 選 . 2.2 內(nèi)生 60 真菌 的 篩 2.2.1 材 料 . 60 2.2.2 方 法 與 步 驟 . 61 2.2.3 結(jié) 果 與 分 析 64 2.3 小 結(jié) 70 活性內(nèi)生真菌的鑒定及發(fā)酵條件的初步考 察 73 3.1 料 73 3.1.1 株 73 3.1.2 鑒定培 養(yǎng)基 發(fā)酵 培養(yǎng) 基 73 3.1.3 劑 74 主要 3.1.4 主要儀

43、 器 74 3.2 法 75 3.2.1 菌 株 的 形 態(tài) 學(xué) 鑒 定 75 3.2.2 菌 株 的 分 子 鑒 定 75 3.2.3 活 性 菌 株 發(fā) 酵 條 件 的 考 察 76 3.3 結(jié)果與 論 77 3.3.1 活 性 菌 株 的 宏 觀 和 微 觀 形 態(tài) 及 培 養(yǎng) 特 征77 3.3.2 活 性 菌 株 的 系 統(tǒng) 發(fā) 育 樹 的 構(gòu) 建 和 菌 種 的 鑒 定 結(jié) 果79 3.3.3 活 性 菌 株 的 發(fā) 酵 物 質(zhì) 穩(wěn) 定 性 試 驗(yàn) 結(jié) 果 82 3.3.4 活 性 菌 株 的 發(fā) 酵 培 養(yǎng) 基 選 擇 試 驗(yàn) 結(jié) 果 83 3.3.5 活 性 菌 株 發(fā) 酵 時(shí)

44、 間 的 考 察 試 驗(yàn) 結(jié) 果 . 86 3.3.6 不 同 溶 劑 萃 取 試 驗(yàn) 結(jié) 果 90 結(jié) 3.4 91 4 四 株 活 性 內(nèi) 生 真 菌 次 生 代 謝 產(chǎn) 物 的 提 取 和 分 離93 4.1 杜仲內(nèi)生真菌 Lecanicillium psalliotae 次生代謝產(chǎn)物的提取 和分離 93 4.1.1 ER12 的 來 源 與 保 藏 93 II 4.1.2 ER12 的 發(fā) 酵 培 養(yǎng) 93 4.1.3 ER12 次 生 代 謝 產(chǎn) 物 的 提 取 與 分 離 93 4.1.4 次 生 代 謝 產(chǎn) 物 的 結(jié) 構(gòu) 鑒 定 97 4.2 杜仲內(nèi)生真菌 Aspergillu

45、s niger 次生代謝產(chǎn)物的提取和分 離 128 4.2.1 EL09 的 來 源 與 保 藏 . 128 4.2.2 EL09 發(fā) 酵 培 養(yǎng) 128 4.2.3 EL09 次 生 代 謝產(chǎn)物 的 提 取 與分 離 128 定 4.2.4 次生代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)鑒 131 4.3 無花果內(nèi)生真菌 Aspergillus tamarii 次生代謝產(chǎn)物的提取和 分離 143 4.3.1 FR02 的 來 源 與 保 藏 143 4.3.2 FR02 的 發(fā) 酵 培 養(yǎng) 143 4.3.3 FR02 的 次 生 代 謝 產(chǎn) 物 的 提 取 與 分 離 143 4.3.4 次 生 代 謝 產(chǎn) 物 的

46、結(jié) 構(gòu) 鑒 定 146 4.4 無花果內(nèi)生真菌 Fusarium tricinctum 次生代謝產(chǎn)物的提取和 分離 165 4.4.1 FL10 的 來 源 與 保 藏 165 4.4.2 FL10 的 發(fā) 酵 培 養(yǎng) 165 4.4.3 FL10 的 次 生 代 謝 產(chǎn) 物 的 提 取 與 分 離 165 4.4.4 次 生 代 謝 產(chǎn) 物 的 結(jié) 構(gòu) 鑒 定 168 4.5 小 結(jié) 190 析 193 5 單 體 化 合 物 生 物 活 性 的 初 步評(píng) 價(jià) 192 5.1. 材 料 和 法 192 5.1.1 抑 菌 活 性 的 試 192 步測 5.1.2 抗 腫 瘤 活 性 的 初

47、試 192 5.2 結(jié)果與 5.2.1 抗菌活性的結(jié)果與分 析 193 5.2.2 抗 腫 瘤 活 性 的 初 步 測 定 結(jié) 果 194 5.3 小 結(jié) 195 III 6 結(jié) 論 和 展 望 199 6.1 結(jié)論 和 創(chuàng) 新 點(diǎn) 6.2 望 199 致 謝 201 參 考 文 獻(xiàn) 202 附圖：部分活性代謝產(chǎn)物核磁共振圖 224 攻讀博士期間發(fā)表的論 文 258 原創(chuàng)性聲明及關(guān)于學(xué)位論文使用授權(quán)的聲 明 .259 IV 兩種藥用植物內(nèi)生真菌次生代謝產(chǎn)物及其生物活性的 研究 1 文獻(xiàn)綜述 1.1 內(nèi)生真菌的定義 內(nèi)生真菌 endophyte 是那些棲息在植物尤其是根、莖、葉內(nèi)部的微 生物，但

48、是宿主 植物沒有顯示出明顯的病癥。目前，內(nèi)生真菌被廣泛接受的概念是 1991 年 Petrini 的定 義，植物內(nèi)生真菌是指全部或部分生活史寄居在健康植物的細(xì)胞內(nèi)或者各類 組織中的真 菌 （圖 1-1 ），但其不會(huì)對(duì)宿主產(chǎn)生任何感染病癥，內(nèi)生真菌的內(nèi)生性可以 通過組織學(xué)方 法或從嚴(yán)格表面消毒的植物組織中分離， 也可以通過從植物組織內(nèi)擴(kuò)增出微 生物 DNA 1 來證明 。發(fā)現(xiàn)內(nèi)生真菌的存在已經(jīng)超過百年，其英文 endophyte 源自于希 臘語，“ endo” 的 意 思 是 “ 內(nèi) 部 ”，“ phyte ” 的 含 義 是 “ 植 物 ” 。 直 到 20 世紀(jì) 80 年代， Strobel

49、 等從 Taxus 2 brevifolia 中分離出一株內(nèi)生真菌能產(chǎn)生紫杉醇 ，人們才開始認(rèn)識(shí)內(nèi)生真 菌在化學(xué)生態(tài) 學(xué)方面的作用， 關(guān)注其代謝產(chǎn)生的新穎的有生物活性的次生代謝產(chǎn)物。 調(diào)查 發(fā)現(xiàn)幾乎所 有的維管束植物以及一些低等的蕨類植物、 藻類苔蘚植物的各個(gè)組織中， 都 存在內(nèi)生真 菌，近二十多年里， 研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)生真菌的多樣性是相當(dāng)大的， 已研究過的每 種植物都含 3 有多種內(nèi)生真菌 。 圖 1-1 內(nèi)生真菌的無性生活周期 Figure 1-1 Endophytes asexaul life cycle Moricca 和 Ragazzi 研究表明，內(nèi)生真菌和寄主植物之間的相互作用 的類型，

50、受其共 4 生體基因和外在環(huán)境調(diào)節(jié)的控制 。內(nèi)生真菌可能生活在一個(gè)代謝惡劣的環(huán) 境中，寄主 植物不斷受到惡劣外界環(huán)境和各種病蟲害的侵襲， 迫使內(nèi)生真菌不斷產(chǎn)生新 的防御物質(zhì)， 1 陜西科技大學(xué)博士學(xué)位論文 5-6 協(xié)同寄主植物進(jìn)行系統(tǒng)防御， 所以藥用植物內(nèi)生真菌是功能代謝物的新的來 源。 同時(shí)植物內(nèi)生真菌也會(huì)受到寄主植物的刺激， 產(chǎn)生與寄主植物相同或者 相似的次生 7 代謝物。 Baily 研究發(fā)現(xiàn) ，寄居在宿主植物的內(nèi)生真菌，相對(duì)于外界微生 物，其基因表 達(dá)的模式發(fā)生了變化。 先前對(duì)被子植物和裸子植物內(nèi)生真菌進(jìn)行了研究， 都 發(fā)現(xiàn)了不同 于外界真菌代謝的新的次生代謝產(chǎn)物。 盡管內(nèi)生菌在植物體內(nèi)的生物量幾乎可忽略不計(jì) , 但現(xiàn)有的研究認(rèn)為內(nèi) 生菌可通過 自生的代謝產(chǎn)物或存在本身借助于信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)能顯著地影響宿主植物。 植物內(nèi) 生真菌會(huì)產(chǎn) 8 生一些代謝產(chǎn)物，協(xié)同寄主植物防御病原微生物 。研究發(fā)現(xiàn)，共生的植物 比非共生的 植物對(duì)病原微生物的侵入， 能更快速地啟動(dòng)防御系統(tǒng)。 研究人員發(fā)現(xiàn)， 植物 內(nèi)生真菌能 9 10 夠在干旱條件下保護(hù)他們的寄主植物 。感染了內(nèi)生真菌的植物，其耐鹽性 增強(qiáng) 。內(nèi) 11 因此，可 更強(qiáng)烈 生真菌也可以增加了其寄主植物的耐熱性，以及對(duì)抗食草動(dòng)物 以認(rèn)為，與 12 植物內(nèi)生真菌共生的植物比非共生植物，觸發(fā)應(yīng)激反應(yīng)更迅速、 1.2 內(nèi)生真菌的研究方法和