啤酒酵母蔗糖酶的提取、純化及測(cè)定研究

1、浙江工業(yè)大學(xué)海洋學(xué)院生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)論文專業(yè)：食品科學(xué)與工程班級(jí)：食品1201姓名：徐素媛啤酒醉母蔗糖酶的提純及相關(guān)性質(zhì)測(cè)定研究作者：徐素媛 單位：浙江工業(yè)大學(xué)海洋學(xué)院食工1201班摘要：為了了解酶的提取及及初提純方法，并在此基礎(chǔ)上掌握q sepharose層析法提純酶、dns法測(cè)定酶活力、folin-酚法和微量凱式定氮法測(cè)定蛋白含量以 及sds-page測(cè)定蛋白質(zhì)分子量的原理和方法，需要進(jìn)行一系列的實(shí)驗(yàn)，主要 實(shí)驗(yàn)過(guò)程如下：啤酒酵母自溶后經(jīng)多次分別離心得到初提液a、熱提取液b和乙醇提取液co利用q sepharose柱層析法洗脫乙醇提取液 c得到洗脫液，通過(guò) 測(cè)定洗脫液的吸光值及酶活力的定性測(cè)定

2、，選取活力最高的洗脫液得到柱分離液do接著進(jìn)行定量酶活力測(cè)定，根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的方程計(jì)算4個(gè)樣品的總活力單位數(shù)和酶回收率，并得出隨著蔗糖酶的不斷提純，酶的總活力單位數(shù)和酶回 收率都逐漸減小。隨后用folin-酚試劑法測(cè)樣品中蛋白質(zhì)的含量，與用微量凱氏 定氮法測(cè)定的結(jié)果進(jìn)行比較，后者測(cè)出的總蛋白含量比前者大，并得出 a、b、 c、d4個(gè)樣品的比活力在一步步的純化中逐漸升高，純化倍數(shù)也明顯增大，而 總酶活、總蛋白和蛋白回收率卻在下降。最后用sds-聚丙烯酰胺凝膠電泳法通過(guò)凝膠對(duì)樣品的篩選分離、染色、洗脫等步驟測(cè)量蛋白質(zhì)分子和染料的遷移距離 來(lái)間接測(cè)定蔗糖酶的相對(duì)分子質(zhì)量。關(guān)鍵詞：蔗糖酶提純酶活力

3、folin-酚法微量凱式定氮法 sds-聚丙烯酰胺凝 膠電泳法 正文：1、文獻(xiàn)綜述1.1 總述啤酒酵母也叫營(yíng)養(yǎng)酵母，為酵母科、釀酒酵母屬，可作食用、藥用和飼料酵母， 還可以從其中提取核酸、谷胱甘肽、蔗糖酶、細(xì)胞色素c等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)1從啤酒酵母中提取蔗糖酶的一般工藝過(guò)程包括提取和分離純化以及相關(guān)性質(zhì)測(cè)定2 o1.2 蔗糖酶的提取蔗糖酶(sucrase ec 3.2.1.26)又稱轉(zhuǎn)化酶(invertase),可作用于伊1, 2糖昔鍵，并 將蔗糖水解為d-葡萄糖和d-果糖。按水解蔗糖的方式，蔗糖酶可分為從果糖末 端切開(kāi)蔗糖的 伊d-吠喃果糖甘酶(,d-frutofuranosidases, ec 3.

4、2.1.26和從葡萄 糖末端切開(kāi)蔗糖的a-d-葡萄糖甘酶(a-d-glucosidases, ec3.2.1.20。前者存在于 酵母中，后者存在于霉菌中。工業(yè)上多從酵母中提取咒 酵母蔗糖酶的提取可采用酵母自溶法、凍融法和sds由提法，用不同提取方法所得蔗糖酶的活性不同， 實(shí)驗(yàn)研究表明，sd觸提法的酶活性最高，凍融法次之，常規(guī)的甲苯自溶法酶活 性最低。sds由提法提取效率最高最高，還具有操作簡(jiǎn)便易行、生產(chǎn)成本低、回收 率高等特點(diǎn)，更適合酵母蔗糖酶的工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)4。1.3 蔗糖酶的純化1.3.1 初步純化蔗糖酶的初步純化一般采用熱提取法、乙醇沉淀提取法，并在此過(guò)程中應(yīng)用離心的方法，得到蔗糖酶的

5、初提取液。1.3.2 離子交換層析法離子交換層析是分離蛋白質(zhì)應(yīng)用最廣泛的技術(shù)，蛋白質(zhì)的兩性特征意味著它們可以依ph值不同而呈陽(yáng)離子或陰離子狀態(tài)存在。具等電點(diǎn)決定了所用介質(zhì)的ph值及所選離子交換劑的類型。蔗糖酶的等電點(diǎn)在酸性，在ph=7.3條件下選擇陰離子交換劑。蛋白質(zhì)與離子交換劑之間結(jié)合的強(qiáng)度取決于蛋白質(zhì)上共同發(fā)揮作 用的離子基團(tuán)數(shù)目、離子交換劑上電荷的密度以及流動(dòng)相的離子強(qiáng)度。因此，蛋白質(zhì)的洗脫可用離子強(qiáng)度遞增的梯度方式進(jìn)行，也可用ph梯度方式進(jìn)行。由于ph的變化可能導(dǎo)致酶的失活，故一般用離子強(qiáng)度遞增的方法來(lái)純化酶。提高分 離效果的實(shí)驗(yàn)條件選擇可以從以下三方面考慮：（1）離子交換劑類型的選擇

6、；（2）洗脫液ph選擇；（3）洗脫液的離子強(qiáng)度的選擇。通過(guò)實(shí)驗(yàn)，比較 deae- 纖維素層析法、deae sepharose層析法和q sepharose析法，得出采用deae- 纖維素層析法的結(jié)果是穿透峰大，且穿透峰的酶活很大，說(shuō)明纖維素吸附蔗糖酶 的量很少，即介質(zhì)載量低，柱容量低，導(dǎo)致回收率低。由于穿透峰大，得到的洗 脫峰很小，且酶活也很低，有時(shí)測(cè)得的酶活峰不在蛋白峰上，達(dá)不到實(shí)驗(yàn)效果， 通過(guò)比較最終得出q sepharose析法的效果最好，其具有如下特點(diǎn)：（1）提高 實(shí)驗(yàn)效果。瓊脂糖凝膠離子交換介質(zhì)比纖維素介質(zhì)載量高，分離純化蔗糖酶穿透峰小，分辨率高，回收率高，蔗糖酶與雜蛋白得到了很好的

7、分離，提高純度，真 正體現(xiàn)離子交換色譜蛋白質(zhì)純化上的優(yōu)越性。（2）縮短實(shí)驗(yàn)時(shí)間。梯度洗脫時(shí) 間大大減少。（3）節(jié)約實(shí)驗(yàn)支出。離子交換介質(zhì) deae-纖維素由于流速慢，柱 床高度會(huì)隨緩沖液濃度及ph改變，不能承受0.1m以上naoh清洗，重生效果 差，壽命短。瓊脂糖介質(zhì)在分辨率、回收率、流速等具有優(yōu)越性，且其化學(xué)穩(wěn)定 性極高，不易破碎，可以承受imnaoh的清洗，重生效果好，可以使用數(shù)百至 上千次，因而降低了成本 汽1.4 酶活力測(cè)定法測(cè)定酶活力的方法多種多樣，包括還原法、色原底物法、粘度法、hplc法（高壓液相色譜法）、免疫學(xué)方法，其中還原法是指酶與底物在特定的條件（溫度、 值、底物濃度等）下

8、反應(yīng)，酶可以促使底物釋放出還原性的基團(tuán)。在此反應(yīng)體系 中添加化學(xué)試劑，酶促反應(yīng)的產(chǎn)物可與該化學(xué)試劑發(fā)生反應(yīng)， 生成有色物質(zhì)。通 過(guò)在特定的波長(zhǎng)下比色，即可求出還原產(chǎn)物的含量，從而計(jì)算出酶活力的大小。目前常用的還原法有：dns法、神鋁酸鹽法、酚硫酸法和地衣酚法。這些方法 各有特點(diǎn)，應(yīng)用的范圍也不盡相同。dns法和神鋁酸鹽法主要用于木聚糖酶、 伊 葡聚糖酶和纖維素酶的活力測(cè)定，神鋁酸鹽法較dns法更為適合微量測(cè)定；酚硫酸法測(cè)定的是全糖而非還原性的糖，因此該法不適于測(cè)定nsp酶類；地衣酚法用于測(cè)定戊糖，雖然靈敏性好，但因試劑昂貴等原因較少應(yīng)用6。本實(shí)驗(yàn)采用的是dns法。1.5 蛋白質(zhì)濃度測(cè)定蛋白質(zhì)含

9、量測(cè)定的方法有考馬斯亮藍(lán)法、紫外分光光度法、folin-酚法及雙縮月尿試劑法，本實(shí)驗(yàn)采用folin-酚法，folin-酚法又稱lowry法，首先在堿性溶液中 形成銅-蛋白質(zhì)復(fù)合物，然后這一復(fù)合物還原磷鋁酸-磷鴇酸試劑，產(chǎn)生深藍(lán)色的 鋁藍(lán)和鴇藍(lán)復(fù)合物，這種深藍(lán)色的復(fù)合物在750nm和660nm處有最大的吸收峰， 顏色的深淺（吸收值）與蛋白質(zhì)濃度成正比，可根據(jù) 750nm的光吸收值大小計(jì) 算蛋白質(zhì)的濃度7。1.6 蛋白質(zhì)分子量測(cè)定蛋白質(zhì)分子量的測(cè)定方法有多種，如滲透壓法、光散射法、超速離心法、凝膠色 譜法及聚丙烯酰胺凝膠電泳法等，目前在實(shí)驗(yàn)室中應(yīng)用較多的是聚丙烯酰胺凝膠 電泳法，另外近年來(lái)發(fā)展較快

10、的質(zhì)譜技術(shù)也可測(cè)定生物大分子物質(zhì)的質(zhì)量，其靈敏度和準(zhǔn)確度為各種方法之首，電噴霧質(zhì)譜法是目前測(cè)定蛋白質(zhì)分子質(zhì)量最準(zhǔn)確 地方法之一，其系統(tǒng)誤差非常小，但質(zhì)譜儀價(jià)格昂貴，不宜做常規(guī)分析手段網(wǎng)。2、實(shí)驗(yàn)研究過(guò)程2.1 蔗糖酶的提取及初提純2.1.1 實(shí)驗(yàn)原理酵母中含有蔗糖酶，而蔗糖酶屬于胞內(nèi)酶，所以常將細(xì)胞壁破碎后進(jìn)行提取。酶 的生產(chǎn)方法有生物提取法、微生物發(fā)酵法及化學(xué)合成法，本法屬于生物提取法、 菌體自溶的方法。酵母經(jīng)自溶破碎細(xì)胞壁后，經(jīng)菌體分離提取蔗糖酶液，再經(jīng)熱 提取、乙醇沉淀提取，使蔗糖酶得到初步的提純。2.1.2 材料與方法2.1.2.1 材料2.1.2.1.1 試齊1j新鮮的啤酒酵母；醋酸

11、鈉(ar);甲苯(ar);4mol/l醋酸；95%乙酉i ( njx 14.008 xv”(v1w3) =17.21mg/ml(b=0, n=0.0105mol/l , v二0.1ml , v2=50ml, v3=5ml)所以 樣品蛋白質(zhì)含量=17.21 x6.25=107.56mg/ml2.5.4.2 討論1、在做消化步驟時(shí)，結(jié)果溶液并未變成透明的淡綠色，而是褐色，本步 驟失敗，因此借用了其他組的消化液，可能的原因是加試劑時(shí)出現(xiàn)差錯(cuò)或加熱的 獲利過(guò)大，樣品被濃硫酸氧化過(guò)度，所以為褐色。2、本實(shí)驗(yàn)可能存在的誤差：蒸汽洗滌不徹底 樣液中可能含有含氮非蛋白成分 收集氨氣過(guò)程中帶入了水蒸氣，對(duì)硼酸的

12、 ph產(chǎn)生了一定的影響 滴定時(shí)終點(diǎn)的判斷存在一定的人為誤差。3、與folin-酚法測(cè)定的結(jié)果相比，結(jié)果偏大，可能的原因是樣液中含有 含氮非蛋白物質(zhì)，或者洗滌時(shí)不夠徹底，反應(yīng)室內(nèi)還有殘留。4、實(shí)驗(yàn)選取的是熱提取液b,作為實(shí)驗(yàn)的樣液，未選擇 c、d,其原因 是樣品c、d中均有tris-hcl溶液，而tris-hcl溶液是含有氮元素的，這會(huì)對(duì) 實(shí)驗(yàn)造成影響。2.5.5 結(jié)論本實(shí)驗(yàn)以熱提取液b0.1ml為樣液，采用微量凱氏定氮法進(jìn)行含氮量測(cè)定， 測(cè)得樣品總氮量為17.21mg/ml ,樣品總蛋白質(zhì)含量為107.56mg/ml。該方法測(cè) 得的蛋白質(zhì)含量比用folin-酚法測(cè)得的高，這是由實(shí)驗(yàn)中存在的誤差

13、造成的，微 量凱氏定氮法比f(wàn)olin-酚法操作復(fù)雜，但干擾小，精確度大。2.6 sds-page測(cè)定蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量2.6.1 實(shí)驗(yàn)原理電泳是指溶液中帶點(diǎn)粒子在外加電場(chǎng)的作用下，向相反電極方向移動(dòng)的現(xiàn) 象。蛋白質(zhì)的電泳遷移率主要取決于它在某ph下所帶的凈電荷量、分子大小（即分子量）和形狀的差異性。聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺單體（acr）和交聯(lián)劑甲叉雙丙烯酰胺（bis） 在催化劑過(guò)硫酸錢（ap）和加速劑n,n,n ,n-四甲基乙二胺（temed）的作 用下聚合交聯(lián)成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠。 凝膠孔徑大小可通過(guò)改變 acr和bis濃度 來(lái)調(diào)節(jié)。濃度越大，孔徑越小，顆粒穿過(guò)網(wǎng)孔的阻力越大，反之亦然。

14、網(wǎng)孔大小 根據(jù)所分離物的分子量的大小來(lái)選擇。本實(shí)驗(yàn)選擇分離膠濃度12%。聚丙烯酰胺 凝膠電泳分為連續(xù)的和不連續(xù)的凝膠電泳兩類。不連續(xù)凝膠電泳有三大效應(yīng)：（1）濃縮效應(yīng)：兩層凝膠的孔徑不同（孔徑的不連續(xù)性）；緩沖液與凝膠離子成分和 ph不同（緩沖系統(tǒng)的不連續(xù) 性）（2）分子篩效應(yīng)：顆粒小，圓球形的樣品分子，移動(dòng)較快；顆粒大，形狀 不規(guī)則的分子阻力較大，移動(dòng)較慢。（3）電荷效應(yīng)：大部分蛋白質(zhì)在ph8.3帶負(fù)電，電荷多遷移快sds即十二烷基硫酸鈉，是一種陰離子表面活性劑。它可以破壞蛋白質(zhì)分子 之間的非共價(jià)鍵，形成帶大量負(fù)電荷的蛋白質(zhì) -sds復(fù)合物，使蛋白質(zhì)喪失了原 有的電荷狀態(tài)，從而降低或消除了各

15、種蛋白質(zhì)分子之間天然電荷的差異；引起蛋白質(zhì)分子構(gòu)象的改變。2.6.2 材料與方法2.6.2.1 材料2.6.2.1.1 試齊1j30%丙烯酰月5貯液：稱丙烯酰胺（ar） 29.2g、甲叉雙丙烯酰胺0.8g, 先用80ml雙蒸儲(chǔ)水溶解，攪拌，直到溶液變成透明，再用雙蒸儲(chǔ)水稀釋至100ml, 過(guò)濾。用棕色瓶中，4c保存一個(gè)月。兩種單體和溶液都是中樞神經(jīng)毒物，要戴 手套小心操作，不可直接接觸。 10%的 temed ;10%過(guò)硫酸錢（ap）:現(xiàn)用現(xiàn)配。；分離膠緩沖液貯液（1.5mol/l tris-hcl, ph8.8）:取tris 9.08g溶解 在40ml雙蒸水中，用4mol/l鹽酸調(diào)節(jié)至ph8

16、.8,用雙蒸水定容至50ml, 4c保 存； _濃縮膠緩沖液貯液（1.5mol/l tris-hcl, ph6.8）:取tris 6.06g溶解 在40ml雙蒸水中，用4mol/l鹽酸調(diào)節(jié)至ph6.8,用雙蒸水定容至50ml, 4c保 存； _ _2 xsds-樣品緩沖液：1ml濃縮膠緩沖液貯液（1mol/l tris-hcl ,ph6.8） +4ml10%sds+1ml琉基乙醇+2ml甘油0.5ml0.1%（質(zhì)量濃度）澳酚藍(lán)，加雙蒸水 定容至10ml, 4c保存。sds-電極緩沖液貯存液（0.025mol/l tris, 0.25mol/l甘氨酸， 0.1%sds, ph8.3）:取tris

17、 15.1g和94g甘氨酸?解在 900ml雙蒸水中，力口入 50ml 10%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）sds貯存液，加雙蒸水定容至1000ml則成5x sds-電極緩 沖液。10%sds: 25gsds用雙蒸水定容至250ml,室溫保存。染色液：0.25g考馬斯亮藍(lán) r250,加入 90ml 50%甲醇溶液和10ml 冰醋酸，用濾紙過(guò)濾。脫色液：50ml甲醇加75ml冰醋酸，加蒸儲(chǔ)水至1000ml。2.6.2.1.2 器材sds-聚丙烯酰胺不連續(xù)垂直板型凝膠電泳玻璃板；大培養(yǎng)皿；燒杯；吸量管；滴管。2.6.2.2 實(shí)驗(yàn)方法sds-聚丙烯酰胺凝膠電泳法2.6.3 操作過(guò)程1、分離膠制備裝配制膠工具，按表比例

18、配制分離膠，小心加滿水，待聚合好后，傾去 水，用濾紙片吸干膠面。2、濃縮膠制備按表配置濃縮膠，迅速混勻，倒在分離膠上層，插上梳子，待聚合好后， 拔出梳子，用濾紙片去除齒孔中的氣泡。3、加樣取100仙l樣品與100仙l樣品緩沖液混合，沸水浴 3-5min,取20仙l 各樣品加入齒孔中，將電極緩沖液倒入電泳槽。4、電泳調(diào)節(jié)電流，電泳至澳酚藍(lán)距酸前沿1.5cm左右時(shí)，停止電泳，關(guān)閉電源。5、染色和脫色小心取出凝膠，置于平皿中，加染色液后過(guò)夜，用脫色液脫色，換三次 脫色液，至背景透明。6、計(jì)算樣品相對(duì)分子質(zhì)量。2.6.4 結(jié)果與討論2.6.4.1 結(jié)果1、實(shí)驗(yàn)測(cè)得的遷移蛋白共有14條，其中標(biāo)準(zhǔn)液5條，

19、b液4條，c液 2條，d液3條，其中標(biāo)準(zhǔn)液蛋白遷移距離為 0.30、0.93、1.42、2.25、3.00 (cm), 其他各液遷移距離在0.271.15不等，染料遷移距離為5.3cm。結(jié)果如圖6-1所 示：圖6-1凝膠電泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果2、根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液相對(duì)遷移距離和蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量對(duì)數(shù)值作圖 得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，方程為y=-1.2959x+4.8679 。標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖6-2所示：蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線4.90004 80004.70004.60004.50004.4000430004.20004.1000系列1線性（系列1）圖6-2蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線3、根據(jù)未知嚴(yán)謹(jǐn)液蛋白質(zhì)相對(duì)遷移距離可從標(biāo)準(zhǔn)曲線公式求得各蛋

20、白 質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量在38600.45863354.484 不等，結(jié)果如表6-1所示：表6-1樣品蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)處理結(jié)果表樣品樣液蛋白遷移距離/cm樣液蛋白相對(duì)遷 移距離樣液蛋白分子量 對(duì)數(shù)值樣液蛋白分子量b1.080.2044.60440152.208b0.690.1304.69950012.144b0.400.0754.77058882.831b0.250.0474.80764071.949c0.650.1234.70951151.292c0.300.0574.79462293.325d1.150.2174.58738600.458d0.720.1364.69249174.463d0.270.0514.80263354.4842.6.4.2 討論1、本次試驗(yàn)最重要的是制備凝膠的環(huán)節(jié)，在實(shí)驗(yàn)中，第一次制作分離膠 失敗，重做后才趕上進(jìn)度，在實(shí)驗(yàn)中還應(yīng)注意acr和bis的毒性。2、在準(zhǔn)備電泳的時(shí)候發(fā)現(xiàn)電泳槽有一定的漏液現(xiàn)象， 但重做已經(jīng)來(lái)不及， 且會(huì)拖慢另一組同學(xué)的進(jìn)度，因此只能通過(guò)不斷補(bǔ)充電極液的方法來(lái)補(bǔ)救， 這樣 影響了電泳效果。3、sds-page凝膠電泳法是目前測(cè)定蛋白質(zhì)分子量較準(zhǔn)確的辦法，但 也存在一定的缺點(diǎn)：(1)凝膠聚合前體物acr和bis具有神經(jīng)毒性，對(duì)人體存 在傷害性。(2)所測(cè)定的蛋白質(zhì)分子量具有局