復(fù)方地黃合劑及復(fù)方逍遙合劑中黃芩苷含量測(cè)定

1、復(fù)方地黃合劑及復(fù)方逍遙合劑中黃芩苷含量測(cè)定Determination of baicalin content in both compound Dihuang and compound Xiaoyao oral solutionsZHANG Dejing* ， NIU Xiaocai(Department of R&D ， Shanghai Meiyou Pharmaceutical Co. Ltd. ， Shanghai 201423 ， China )Objective ： To establish a method for the determination of baicalin co

2、ntent in both compoundDihuang and compound Xiaoyao oral solutions. Methods ： The established HPLCmethod was carried out on a C18 column at detection wavelength of 280 nm with a mobile phase consisted of acetonitrile-0.2% phosphoric acid solution (27 ： 73 ) . Results ： The peak shape of baicalin in d

3、ifferent preparations of traditional Chinese medicine and the specificity of the method were good. The standard curve of baicalin showed a good linear relationship over therange of 16- 320 卩 g/ml (r=0.999 3). The average recoveries were 99% with RSD 1.7% for compound Dihuang oral solution and 97% wi

4、th RSD 1.6% for compound Xiaoyao oral solution under the concentrations of 50%， 100%， 150% of original ones. Besides ， the RSDof baicalin content change was 0.3%and 0.2% in 8 hours of storage， indicating its goodstability. Conclusion： This method is convenient andaccurate with high sensitivity and g

5、ood reproducibility，can be used to determine the content of baicalin in both compound Dihuang and compound Xiaoyao oral solutions.S compound Dihuang oral solution； compound Xiaoyaooral solution ； baicalin ； HPLC?S苓苷(baicalin )是從黃苓根中提取分離出來(lái)的一種黃酮類(lèi)化合物，具有顯著的生物活性，具有降壓、鎮(zhèn)靜、保肝、利 膽、抗菌、消炎、抗腫瘤等作用和生理功效 1-2 ，在臨床醫(yī)

6、學(xué) 已占有重要地位。各種藥物制劑，如雙黃連口服溶液、柴黃口服 溶液、芩桑化痰顆粒、復(fù)方地黃合劑、復(fù)方逍遙合劑等，均含有 黃芩苷，且黃芩苷含量作為藥品質(zhì)量控制的關(guān)鍵項(xiàng)目。因此，黃 芩苷含量的測(cè)定方法至關(guān)重要。根據(jù)文獻(xiàn)查閱，黃芩苷含量測(cè)定方法較多，如薄層掃描法、薄層-紫外法4、紫外分光光度計(jì)法5、HPLC法、高 效毛細(xì)管電泳法等 7 ，各種方法均存在一定的優(yōu)劣性 8-9 ，如 耗時(shí)長(zhǎng)、操作復(fù)雜等。本研究建立了新的黃芩苷含量的測(cè)定方法， 有利于復(fù)方地黃合劑及復(fù)方逍遙合劑的質(zhì)量控制。1 材料和方法1.1 儀器Agilent 1200 型高效液相儀(美國(guó)安捷倫公司)； ThermoU3000型高效液相儀

7、（賽默飛世爾科技 XX公司）；Waters 2695 型高效液相儀（沃特世科技XX公司）；電子天平（型號(hào)BS124S 賽多利斯）。1.2 樣品與試劑復(fù)方地黃合劑和復(fù)方逍遙合劑（上海美優(yōu)制藥XX公司，批號(hào) 1 50 1 02、 1 50 1 02） ；黃芩苷對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢驗(yàn) 所，批號(hào) 1107515-201318 ）。乙腈及甲醇（色譜純，默克公司）；磷酸和乙醇（分析純，永華化學(xué)科技（江蘇）XX公司）；蒸餾水（自制）。1.3 方法1.3.1 溶液配制精密量取樣品 2 ml ，置 50 ml 容量瓶中，加甲醇 ?s30 ml ， 超聲處理 10 min ，放冷后加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾

8、過(guò)，作 為供試品溶液。 精密稱(chēng)取黃芩苷對(duì)照品適量， 用甲醇溶解并稀釋 成濃度為60卩g/ml的對(duì)照品溶液。按照復(fù)方地黃合劑和復(fù)方逍遙合劑的配方， 剔除中藥飲片黃 芩，模擬生產(chǎn)工藝分別制備復(fù)方地黃合劑和復(fù)方逍遙合劑的空白 樣品；依次精密移取空白樣品 2 ml ，分別置 50 ml 容量瓶中， 加甲醇稀釋至刻度， 搖勻作為復(fù)方地黃合劑和復(fù)方逍遙合劑的空 白對(duì)照溶液。各取 9 份空白溶液 2 ml ，均置于 50 ml 容量瓶中， 將濃度為2 mg/ml對(duì)照品溶液1、2和3 ml分別加入各三份空白 溶液中，加入甲醇定容，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液作為準(zhǔn)確度測(cè)試加樣供試品溶液。1.3.2 色譜條件采用高效液

9、相色譜法，C18色譜柱(4.6 mM 250 mm 5卩m), 波長(zhǎng)280 nm,流動(dòng)相為乙腈-0.2%磷酸溶液(27 : 73),流速1.2 ml/min，柱溫 25 C,進(jìn)樣量 20 I。1.3.3 線(xiàn)性和范圍精密稱(chēng)取黃芩苷對(duì)照品適量，置 100 ml 容量瓶中，加甲醇 稀釋至刻度，搖勻，配制成濃度為320卩g/ml對(duì)照品貯備液，依次稀釋制備成濃度梯度為 240、160、80和16卩g/ml的5個(gè) 標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別注入液相色譜儀( Agilent 1200)測(cè)定并記錄色 譜圖。1.3.4 方法驗(yàn)證1) 專(zhuān)屬性 取空白對(duì)照溶液、 供試品溶液以及對(duì)照品溶液各 20卩I，分別注入高效液相色譜儀(A

10、gile nt 1200)測(cè)定并記錄 色譜圖。另取復(fù)方地黃合劑及復(fù)方逍遙合劑的供試品溶液各 20 卩l(xiāng)，注入高效液相色譜儀(Waters 2695 )，采用PDA檢測(cè)器， 測(cè)定并記錄色譜圖。2) 準(zhǔn)確度 取準(zhǔn)確度測(cè)試加樣供試品溶液進(jìn)樣測(cè)定并記錄色 譜圖。3) 重復(fù)性 取兩種制劑的供試品溶液各 6份進(jìn)樣測(cè)定并記 錄色譜圖( Agilent 1200 )。4) 中間精密度 由不同試驗(yàn)人員將供試品溶液注入不同液相色譜儀(Agile nt 1200、Thermo U3000)測(cè)定并記錄色譜圖，觀 察黃芩苷含量的變化。5) 溶液穩(wěn)定性 分別在 0、 1、 2、 4、 6 和 8 h 進(jìn)樣( Agilen

11、t 1200)測(cè)定，以 0 h 峰面積為準(zhǔn)，計(jì)算復(fù)方地黃合劑和復(fù)方逍遙 合劑的供試品溶液在 8 h 內(nèi)峰面積的變化。6) 耐用性 取供試品溶液20卩I進(jìn)樣(Agile nt 1200 ), 通過(guò)改變柱溫、流速及流動(dòng)相比例，考察其對(duì)含量測(cè)定的影響。 條件如下：乙腈-0.2%磷酸溶液=27： 73、流速1.2 ml/min , 柱溫分別為20、25和30 C;乙腈-0.2%磷酸溶液比例分別為 25 : 75、27 : 73 及 21 : 79,柱溫 25 C、流速 1.2 ml/min : 乙腈-0.2%磷酸溶液=27： 73、柱溫25 C,流速分別為1.0、1.2 和 1.4 ml/min 。2

12、 結(jié)果2.1 線(xiàn)性和范圍在16320卩g/ml的濃度范圍內(nèi)，以黃苓苷濃度為橫坐標(biāo)， 峰面積為縱坐標(biāo)，求得線(xiàn)性方程為 y=0.926 5x -3.144 5 ，相關(guān) 系數(shù) r=0.999 3 ，表明在該濃度范圍內(nèi)，線(xiàn)性符合規(guī)定。2.2 專(zhuān)屬性280在 1.3.2 的色譜條件下，黃芩苷主峰保留時(shí)間為 7.82 min ， 空白對(duì)照溶液在黃芩苷主峰的相應(yīng)位置無(wú)干擾峰出現(xiàn)， 供試品溶 液與對(duì)照品溶液黃苓苷主峰的保留時(shí)間一致(圖 1)。PDA檢測(cè) 結(jié)果角度值均小于閾值，表明黃芩苷色譜峰僅為單一成分在 nm波長(zhǎng)下的響應(yīng)值，含量測(cè)定方法專(zhuān)屬性強(qiáng)。2.3 準(zhǔn)確度在相對(duì)于樣品 50%、100%、150%不同濃度

13、下，復(fù)方地黃合劑 及復(fù)方逍遙合劑中黃芩苷的平均回收率分別為99%和97%（表 1），RSD分別為1.7%和 1.6%，回收率良好。2.4 重復(fù)性復(fù)方地黃合劑和復(fù)方逍遙合劑供試品溶液各 6 份含量測(cè)定的RSD分別為1.6%和0.4% （表2），RSDJ、于2% 表明具有較 好的重復(fù)性。2.5 中間精密度由不同操作人員、 采用不同色譜系統(tǒng)測(cè)定， 復(fù)方地黃合劑和 復(fù)方逍遙合劑中黃苓苷含量測(cè)定結(jié)果 RSDJ、于2.0%,黃苓苷中 間精密度良好（表 3）。2.6 溶液穩(wěn)定性在08h內(nèi)，黃苓苷峰面積相對(duì)穩(wěn)定，復(fù)方地黃合劑及復(fù) 方逍遙合劑中黃苓苷峰面積變化的RSD分別為0.3%和0.2% （表4），均、于

14、2%，說(shuō)明穩(wěn)定性良好。2.7 耐用性對(duì)于流動(dòng)相比例、 柱溫和流速的考察表明， 改變色譜條件時(shí)， 黃芩苷色譜峰的理論板數(shù)均大于 2 000，黃芩苷主峰與相鄰峰分 離度均大于 1.5，發(fā)現(xiàn)最佳色譜條件為：流動(dòng)相為乙腈 -0.2%磷 酸溶液（27 : 73）,流速1.2 ml/min，柱溫25 C。3討在流動(dòng)相選擇方面，乙腈具有溶劑強(qiáng)度較高，黏度較小，其截止波長(zhǎng)190 nm比甲醇205 nm更短，更？m合末端吸收進(jìn)行黃 芩苷含量的檢測(cè)。 本研究中色譜檢測(cè)流動(dòng)相有機(jī)溶劑為乙腈， 結(jié) 果表明在該流動(dòng)相下， 黃芩苷主峰與鄰近峰分離度良好， 峰形理 想。在黃芩苷萃取及樣品制備方面，常采用溶劑為乙醇及甲醇， 經(jīng)超聲及加熱回流可高效完成有效成分的萃取。經(jīng)過(guò)PDA僉測(cè)，黃芩苷在