牙周病分子生物學(xué)課件

1、牙周病分子生物學(xué)1 牙周病分子生物學(xué)牙周病分子生物學(xué) Molecular Biology of Periodontal Diseases 牙周病分子生物學(xué)2 一、概述一、概述 二、牙周病的分子致病二、牙周病的分子致病 1.1.微生物的毒力因子微生物的毒力因子 2.2.宿主因子宿主因子 三、核酸雜交法檢測(cè)牙周病有關(guān)細(xì)菌三、核酸雜交法檢測(cè)牙周病有關(guān)細(xì)菌 牙周病分子生物學(xué)3 定義（定義（Definition） 分子生物學(xué)技術(shù)研究與牙周病密切分子生物學(xué)技術(shù)研究與牙周病密切 相關(guān)生物大分子（蛋白、核酸）的一門相關(guān)生物大分子（蛋白、核酸）的一門 新興學(xué)科新興學(xué)科前瞻性、交叉性。前瞻性、交叉性。 牙周病分子

2、生物學(xué)4 研究內(nèi)容研究內(nèi)容 4宿主基因水平或分子水平闡明牙周病發(fā)病機(jī)制和流宿主基因水平或分子水平闡明牙周病發(fā)病機(jī)制和流 行規(guī)律行規(guī)律 4牙周病原菌的蛋白和核酸牙周病原菌的蛋白和核酸(DNA、RNA)分子結(jié)構(gòu)分子結(jié)構(gòu) 追蹤病原菌傳播途徑、發(fā)現(xiàn)病原體變異。追蹤病原菌傳播途徑、發(fā)現(xiàn)病原體變異。 4牙周病的發(fā)生發(fā)展規(guī)律與微觀的病原菌或宿主基因牙周病的發(fā)生發(fā)展規(guī)律與微觀的病原菌或宿主基因 特征聯(lián)系起來特征聯(lián)系起來牙周病臨床的分子診斷、分子指征、牙周病臨床的分子診斷、分子指征、 分子預(yù)后乃至基因治療分子預(yù)后乃至基因治療 牙周病分子生物學(xué)5 牙周病的分子致病牙周病的分子致病 Molecular Pathog

3、enesis of Periodontal Disease 牙周病分子生物學(xué)6 微生物的毒力因子微生物的毒力因子 研究牙周病原菌的蛋白和核酸分子研究牙周病原菌的蛋白和核酸分子 結(jié)構(gòu)，評(píng)價(jià)毒力因子的作用。結(jié)構(gòu)，評(píng)價(jià)毒力因子的作用。 宿主因子宿主因子 研究細(xì)胞因子和遺傳因子的作用。研究細(xì)胞因子和遺傳因子的作用。 牙周病分子生物學(xué)7 微生物的毒力因子微生物的毒力因子 Microbial Viralence Factors 牙周病分子生物學(xué)8 內(nèi)毒素內(nèi)毒素(lipopolysaccharide, LPS) G-菌胞壁外膜的脂多糖成分菌胞壁外膜的脂多糖成分 （磷脂多糖蛋白質(zhì)）。（磷脂多糖蛋白質(zhì)）。 牙周

4、病分子生物學(xué)9 十二烷基磺酸鈉聚丙烯凝膠電泳十二烷基磺酸鈉聚丙烯凝膠電泳 PAGE-SDS gel 銀染色銀染色 Silver stain 內(nèi)毒素免疫印跡內(nèi)毒素免疫印跡 LPS-immuno-blotting 牙周病分子生物學(xué)10 牙齦素牙齦素(gingipains) 最初稱為胰酶樣蛋白酶最初稱為胰酶樣蛋白酶(trypsin-like protease, TLP),又稱卟啉素又稱卟啉素(porphypains) 存在于存在于Pg的外膜、膜泡或胞外的一組蛋白酶的外膜、膜泡或胞外的一組蛋白酶 超速離心超速離心(10000g20min,4)提取胞外膜提取胞外膜 泡泡高凝膠液相色譜法高凝膠液相色譜法(

5、GF-HPLC)分離純分離純 化?；?牙周病分子生物學(xué)11 精氨酸牙齦素精氨酸牙齦素(Arginine-gingipains, Rgps): 特異性切斷蛋白質(zhì)與精氨酸殘基結(jié)合的肽段，由特異性切斷蛋白質(zhì)與精氨酸殘基結(jié)合的肽段，由 rgpA(前肽區(qū)、蛋白酶區(qū)、粘附區(qū)前肽區(qū)、蛋白酶區(qū)、粘附區(qū))和和rgpB(無粘無粘 附區(qū)附區(qū))二個(gè)基因編碼二個(gè)基因編碼 賴氨酸牙齦素賴氨酸牙齦素(Lysine-gingipain, Kgp): 特異性切斷蛋白質(zhì)與賴氨酸殘基結(jié)合的肽段，由特異性切斷蛋白質(zhì)與賴氨酸殘基結(jié)合的肽段，由 kgp(前肽區(qū)、蛋白酶區(qū)、粘附區(qū)前肽區(qū)、蛋白酶區(qū)、粘附區(qū))單個(gè)基因編碼單個(gè)基因編碼 牙周病

6、分子生物學(xué)12 Pg同源突變株的性狀改變同源突變株的性狀改變 突變株突變株性狀改變性狀改變 rgpA粘附能力部分喪失粘附能力部分喪失 降解降解I型膠原能力喪失型膠原能力喪失 rgpA、rgpB抑制中性粒細(xì)胞功能喪失抑制中性粒細(xì)胞功能喪失 菌毛缺失菌毛缺失 kgp菌落無法變黑菌落無法變黑(影響利用血紅蛋白影響利用血紅蛋白) rgpA、rgpB、kgp胞外蛋白水解活性喪失胞外蛋白水解活性喪失 牙周病分子生物學(xué)13 牙齦素功能牙齦素功能 有助于粘附定植：對(duì)纖維蛋白的親和力。有助于粘附定植：對(duì)纖維蛋白的親和力。 毒性作用：破壞宿主組織細(xì)胞的活性成分毒性作用：破壞宿主組織細(xì)胞的活性成分(蛋白、多肽蛋白、

7、多肽)、 降解膠原；促進(jìn)緩激肽釋放，提高血管通滲性，增加降解膠原；促進(jìn)緩激肽釋放，提高血管通滲性，增加 齦溝液量，組織水腫。齦溝液量，組織水腫。 幫助細(xì)胞生長：將組織蛋白質(zhì)降解為短肽鏈，擴(kuò)大細(xì)幫助細(xì)胞生長：將組織蛋白質(zhì)降解為短肽鏈，擴(kuò)大細(xì) 菌營養(yǎng)攝取范圍，為細(xì)菌生長和毒力發(fā)揮提供養(yǎng)分。菌營養(yǎng)攝取范圍，為細(xì)菌生長和毒力發(fā)揮提供養(yǎng)分。 干擾宿主免疫反應(yīng)：影響中性白細(xì)胞功能，降解宿主干擾宿主免疫反應(yīng)：影響中性白細(xì)胞功能，降解宿主 細(xì)胞的細(xì)胞的LPS受體受體CD14，降解細(xì)胞因子降解細(xì)胞因子IL-1、IL-6、IL- 8及及TNF等。等。 牙周病分子生物學(xué)14 菌毛亞單位蛋白結(jié)構(gòu)基因菌毛亞單位蛋白結(jié)構(gòu)

8、基因(fim A) 粘附有關(guān)的毒力因子粘附有關(guān)的毒力因子 纖毛素纖毛素(fimbrilin) 粘附素粘附素(adhesin) 血細(xì)胞凝集素血細(xì)胞凝集素 (hemagglutinin) 牙周病分子生物學(xué)15 1988年年Dickinson等首先獲得含編碼等首先獲得含編碼Pg 纖毛素基因的克隆質(zhì)粒纖毛素基因的克隆質(zhì)粒PUC 13Bg12.1，該基，該基 因?yàn)槿旧w上的單拷貝基因，它的氨基酸序列因?yàn)槿旧w上的單拷貝基因，它的氨基酸序列 與其他菌毛無同源性，可利用該特異基因作探與其他菌毛無同源性，可利用該特異基因作探 針鑒定針鑒定Pg，可進(jìn)一步研究，可進(jìn)一步研究Pg菌毛的致病作用。菌毛的致病作用。 牙

9、周病分子生物學(xué)16 膠原酶基因膠原酶基因(prtc) Pg的膠原酶能降解的膠原酶能降解I型膠原，破壞牙型膠原，破壞牙 周組織附著。周組織附著。 已測(cè)知表達(dá)膠原酶活性的已測(cè)知表達(dá)膠原酶活性的prtc基因基因 序列，它存在于序列，它存在于Pg的三種主要血清型中，的三種主要血清型中， 編碼編碼1個(gè)個(gè)37501.38蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)。 牙周病分子生物學(xué)17 白細(xì)胞毒素基因白細(xì)胞毒素基因(lkt A、B、C、D) Aa是口腔中唯一能產(chǎn)生白細(xì)胞毒素是口腔中唯一能產(chǎn)生白細(xì)胞毒素 (leukotoxin,LKT)的細(xì)菌，白細(xì)胞毒素僅能的細(xì)菌，白細(xì)胞毒素僅能 殺死人或靈長類的多形核白細(xì)胞、單核細(xì)胞殺死人或靈長類的

10、多形核白細(xì)胞、單核細(xì)胞 和巨噬細(xì)胞，抑制破壞宿主的免疫防御機(jī)制。和巨噬細(xì)胞，抑制破壞宿主的免疫防御機(jī)制。 現(xiàn)已克隆和測(cè)知現(xiàn)已克隆和測(cè)知lkt A的序列，且在受體的序列，且在受體 菌中得到表達(dá)。編碼毒素結(jié)構(gòu)，激活白細(xì)胞菌中得到表達(dá)。編碼毒素結(jié)構(gòu)，激活白細(xì)胞 毒素。毒素。 牙周病分子生物學(xué)18 牙周病分子生物學(xué)19 牙周病分子生物學(xué)20 牙周病分子生物學(xué)21 牙周病分子生物學(xué)22 牙周病分子生物學(xué)23 宿主因子宿主因子 Host Factors 牙周病分子生物學(xué)24 細(xì)胞因子細(xì)胞因子(cytokines) 細(xì)胞生物學(xué)細(xì)胞生物學(xué) 細(xì)胞因子細(xì)胞因子cytokine(CK) 免疫學(xué)免疫學(xué)淋巴因子淋巴因子

11、lymphokine interleukincytikine(LI) 血液學(xué)血液學(xué)集落刺激因子集落刺激因子colony stimulation factor(CSF) 分子生物學(xué)分子生物學(xué)生長因子生長因子growth factors(GFS) 牙周病分子生物學(xué)25 活化的活化的免疫細(xì)胞免疫細(xì)胞和某些和某些基質(zhì)細(xì)胞基質(zhì)細(xì)胞分泌的微量分泌的微量 生物活性物質(zhì)。生物活性物質(zhì)。 本質(zhì)是本質(zhì)是蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)或或多肽多肽。 在體內(nèi)發(fā)揮廣泛的在體內(nèi)發(fā)揮廣泛的生物學(xué)作用生物學(xué)作用，與生長、分，與生長、分 化、免疫、腫瘤、造血和創(chuàng)傷愈合等多種生化、免疫、腫瘤、造血和創(chuàng)傷愈合等多種生 理、病理狀態(tài)有關(guān)。理、病理狀態(tài)

12、有關(guān)。 正常情況下發(fā)揮廣泛正常情況下發(fā)揮廣泛生理功能生理功能，一旦失調(diào)異，一旦失調(diào)異 常分泌，又與常分泌，又與疾病相關(guān)疾病相關(guān)。 牙周病分子生物學(xué)26 目前發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞因子有目前發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞因子有10余族，每余族，每 族又有若干亞族，共族又有若干亞族，共100多種，功能大多種，功能大 多已闡明，部分已克隆成功，其基因定多已闡明，部分已克隆成功，其基因定 位、結(jié)構(gòu)與受體結(jié)合機(jī)制等均有大量研位、結(jié)構(gòu)與受體結(jié)合機(jī)制等均有大量研 究。究。 牙周病分子生物學(xué)27 6 白介素白介素(1-18型糖蛋白型糖蛋白)(interleukin, IL) 6 腫瘤壞死因子腫瘤壞死因子(tumor nocrosis fac

13、tor, TNF) 6 粘附分子粘附分子(adhesion molecule, AM) 6 干擾素干擾素(interferan, IFN) 6 轉(zhuǎn)化生長因子轉(zhuǎn)化生長因子-(transforming growth factor- , TGF- ) 6 成纖維細(xì)胞生長因子成纖維細(xì)胞生長因子(fibroblast growth factors, FGFs) 牙周病分子生物學(xué)28 細(xì)胞因子作用特點(diǎn)細(xì)胞因子作用特點(diǎn) 4特異性特異性(自分泌、旁分泌作用自分泌、旁分泌作用) 對(duì)靶細(xì)胞存在不同程度特異性。對(duì)靶細(xì)胞存在不同程度特異性。 4多樣性、多功能性多樣性、多功能性 對(duì)不同靶細(xì)胞、不同濃度或不同生理狀態(tài)靶對(duì)

14、不同靶細(xì)胞、不同濃度或不同生理狀態(tài)靶 細(xì)胞可有不同作用。細(xì)胞可有不同作用。 4整體性整體性 對(duì)細(xì)胞、組織的調(diào)控不是僅靠對(duì)細(xì)胞、組織的調(diào)控不是僅靠1種，而是種，而是多因多因 子參與子參與及及多步驟反應(yīng)多步驟反應(yīng)，由幾種因子協(xié)同或拮由幾種因子協(xié)同或拮 抗配合形成網(wǎng)絡(luò)抗配合形成網(wǎng)絡(luò)(network)發(fā)揮作用。發(fā)揮作用。 牙周病分子生物學(xué)29 遺傳因子遺傳因子(genetic factors) 基因水平闡明牙周病發(fā)生、發(fā)基因水平闡明牙周病發(fā)生、發(fā) 展和流行規(guī)律。展和流行規(guī)律。 牙周病分子生物學(xué)30 細(xì)菌是引發(fā)牙周炎必不可少的因素，但不細(xì)菌是引發(fā)牙周炎必不可少的因素，但不 是唯一因素，宿主也起重要作用。

15、是唯一因素，宿主也起重要作用。 單純遺傳能為患嚴(yán)重牙周炎提供單純遺傳能為患嚴(yán)重牙周炎提供50%以上以上 危險(xiǎn)性，如：危險(xiǎn)性，如： 白細(xì)胞減少癥白細(xì)胞減少癥 白細(xì)胞粘附缺陷病白細(xì)胞粘附缺陷病 Down綜合征綜合征 掌跖角化牙周破壞綜合征掌跖角化牙周破壞綜合征 牙周病分子生物學(xué)31 牙周病的基因研究牙周病的基因研究 6號(hào)染色體號(hào)染色體組織相容性位點(diǎn)變異組織相容性位點(diǎn)變異 產(chǎn)生產(chǎn)生IgG2能力降低，能力降低， IgG2是保護(hù)性的，能調(diào)理識(shí)別是保護(hù)性的，能調(diào)理識(shí)別 細(xì)菌，以利吞噬殺死。細(xì)菌，以利吞噬殺死。 染色體染色體1q H131殘基多態(tài)性殘基多態(tài)性 組氨酸組氨酸純合子純合子 吞噬細(xì)胞識(shí)別吞噬細(xì)胞識(shí)

16、別IgG2的的hFcrRa 受體親和力受體親和力高高(IgG包裹的致病包裹的致病 菌易被吞噬清除菌易被吞噬清除) 精氨酸精氨酸純合子純合子 受體親和力低受體親和力低 組組/精氨酸精氨酸雜合子雜合子 親和力居中親和力居中 牙周病分子生物學(xué)32 染色體染色體2q 13的的IL-1基因基因多態(tài)性多態(tài)性 產(chǎn)生的產(chǎn)生的IL-1約為該基因陰性的約為該基因陰性的4倍，倍，40 歲后患重度牙周炎的可能性是陰性個(gè)體歲后患重度牙周炎的可能性是陰性個(gè)體 的的20倍倍 6號(hào)染色體號(hào)染色體TNF-基因基因多態(tài)性多態(tài)性 產(chǎn)生大量產(chǎn)生大量TNF-，增強(qiáng)對(duì)感染的反應(yīng)性，增強(qiáng)對(duì)感染的反應(yīng)性 牙周病分子生物學(xué)33 牙周病分子生物

17、學(xué)34 牙周病分子生物學(xué)35 牙周病分子生物學(xué)36 牙周病分子生物學(xué)37 核酸雜交法核酸雜交法 (molecular hybridization) 檢測(cè)牙周病相關(guān)細(xì)菌檢測(cè)牙周病相關(guān)細(xì)菌 牙周病分子生物學(xué)38 概概 述述 牙周病分子生物學(xué)39 細(xì)菌分類學(xué)四個(gè)水平細(xì)菌分類學(xué)四個(gè)水平 w 細(xì)菌形態(tài)和行為水平：顯微結(jié)構(gòu)、運(yùn)動(dòng)性、細(xì)菌形態(tài)和行為水平：顯微結(jié)構(gòu)、運(yùn)動(dòng)性、 酶、生化及營養(yǎng)需要等酶、生化及營養(yǎng)需要等 w 細(xì)菌組分水平：胞壁組分、脂類、細(xì)胞色細(xì)菌組分水平：胞壁組分、脂類、細(xì)胞色 素及噬菌體系分析素及噬菌體系分析 w 蛋白質(zhì)水平：氨基酸系列、可溶性蛋白凝蛋白質(zhì)水平：氨基酸系列、可溶性蛋白凝 膠電泳

18、及血清學(xué)膠電泳及血清學(xué) w 基因水平：基因水平：GC mol%，DNA-DNA雜交，雜交， 質(zhì)粒及遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)導(dǎo)質(zhì)粒及遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)導(dǎo) 牙周病分子生物學(xué)40 牙周病有關(guān)的特殊細(xì)菌牙周病有關(guān)的特殊細(xì)菌 證據(jù)充分的致病菌中等證據(jù)的致病菌 伴放線放線桿菌伴放線放線桿菌Aa直腸彎曲菌直腸彎曲菌 (Actinobacillus actinomycetemcomitans)(campylobacter rectus) 牙齦卟啉單胞菌牙齦卟啉單胞菌Pg纏結(jié)優(yōu)桿菌纏結(jié)優(yōu)桿菌 (Porphyromonas gingivalis)(Eubacterium nodatum) 福塞似桿菌福塞似桿菌Bf具核梭桿菌具核梭桿

19、菌Fn (Bacteroides forsythus)(Fusobacteruim nucleatum) 中間普氏菌中間普氏菌Pi (prevotella intermedia) 微小消化鏈球菌微小消化鏈球菌Pm (Peptostreptocoscus micros) 中間鏈球菌群中間鏈球菌群 (Intermedius streptococci) 牙密螺旋體牙密螺旋體Td (Treponema denticola) 牙周病分子生物學(xué)41 常規(guī)方法不能鑒定牙周大量標(biāo)本細(xì)菌的原因：常規(guī)方法不能鑒定牙周大量標(biāo)本細(xì)菌的原因： X大多為厭氧菌大多為厭氧菌 X培養(yǎng)條件要求高培養(yǎng)條件要求高 X鑒定繁雜鑒定繁

20、雜 X每牙周袋至少取每牙周袋至少取2個(gè)區(qū)樣本個(gè)區(qū)樣本 X每樣本至少分離每樣本至少分離10株以上可疑菌株以上可疑菌 牙周病分子生物學(xué)42 原理原理 所有生物體都以所有生物體都以DNA形式通過形式通過4種堿基順序種堿基順序 來貯存遺傳信息，同種生物含相同的來貯存遺傳信息，同種生物含相同的DNA序列，序列， 生物種差別越大，生物種差別越大，DNA堿基順序差別越大。堿基順序差別越大。 鳥嘌呤鳥嘌呤 腺嘌呤腺嘌呤 胞嘧啶胞嘧啶 胸腺嘧啶胸腺嘧啶 G A C T C T 示蹤劑標(biāo)記的特定堿基序列的核酸片段，能示蹤劑標(biāo)記的特定堿基序列的核酸片段，能 和互補(bǔ)堿基配對(duì)、特異地結(jié)合。和互補(bǔ)堿基配對(duì)、特異地結(jié)合。

21、牙周病分子生物學(xué)43 w 4種核苷酸組成種核苷酸組成DNA w 2條互補(bǔ)鏈繞成雙螺旋結(jié)構(gòu)條互補(bǔ)鏈繞成雙螺旋結(jié)構(gòu)(氫鍵氫鍵)嚴(yán)格嚴(yán)格 配對(duì)規(guī)律牢固結(jié)合，使配對(duì)規(guī)律牢固結(jié)合，使DNA具遺傳信息具遺傳信息 貯存庫功能（恒定性、專一性）貯存庫功能（恒定性、專一性） w DNA上相鄰上相鄰3個(gè)核苷酸編排個(gè)核苷酸編排1個(gè)密碼子，個(gè)密碼子， 決定決定1個(gè)特定氨基酸個(gè)特定氨基酸 w DNA核苷酸順序決定蛋白質(zhì)的氨基酸順核苷酸順序決定蛋白質(zhì)的氨基酸順 序決定細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能序決定細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能 牙周病分子生物學(xué)44 核酸探針核酸探針(probe) 定義定義 能與特定核酸序列發(fā)生特異性互補(bǔ)的能與特定核酸序列發(fā)生特異

22、性互補(bǔ)的 已知核酸片段，用于檢測(cè)待測(cè)樣品中是否存已知核酸片段，用于檢測(cè)待測(cè)樣品中是否存 在與探針相同或相近的在與探針相同或相近的DNA序列。序列。 牙周病分子生物學(xué)45 牙周病相關(guān)菌的核酸探針是牙周病相關(guān)菌牙周病相關(guān)菌的核酸探針是牙周病相關(guān)菌 染色體染色體DNA上的有種屬特異性的一小段上的有種屬特異性的一小段DNA （或（或RNA）分子的堿基序列，為帶標(biāo)記的單股）分子的堿基序列，為帶標(biāo)記的單股 核苷酸，能以互補(bǔ)方式與相應(yīng)核苷酸，能以互補(bǔ)方式與相應(yīng)DNA鍵結(jié)合。用鍵結(jié)合。用 已知細(xì)菌的已知細(xì)菌的DNA探針去探測(cè)未知細(xì)菌的探針去探測(cè)未知細(xì)菌的DNA， 若能雜交形成若能雜交形成DNA雙鏈則認(rèn)為該菌為

23、與探針相雙鏈則認(rèn)為該菌為與探針相 同的菌。同的菌。 牙周病分子生物學(xué)46 放射性同位素標(biāo)記：如放射性同位素標(biāo)記：如 32P、35S、3H 靈敏度高靈敏度高 理化影響小理化影響小 污染環(huán)境污染環(huán)境 使用某些半抗原：如使用某些半抗原：如 生物素、地高辛、熒光素生物素、地高辛、熒光素 特異性較低特異性較低 敏感性較低敏感性較低 牙周病分子生物學(xué)47 合成小段單鏈合成小段單鏈DNA方法日臻完善方法日臻完善 寡核苷酸的化學(xué)合成可由高度自動(dòng)化寡核苷酸的化學(xué)合成可由高度自動(dòng)化 的儀器完成的儀器完成 核酸雜交技術(shù)得到發(fā)展核酸雜交技術(shù)得到發(fā)展 牙周病分子生物學(xué)48 探針類型探針類型 w全基因探針：屬內(nèi)代表菌株分

24、離出全基因探針：屬內(nèi)代表菌株分離出DNA并進(jìn)行標(biāo)記，制并進(jìn)行標(biāo)記，制 備簡便，特異性較差，有時(shí)可與相近屬菌種發(fā)生雜交備簡便，特異性較差，有時(shí)可與相近屬菌種發(fā)生雜交 w克隆克隆DNA片段探針片段探針 隨意探針：代表菌隨意探針：代表菌DNA用限制性內(nèi)切酶酶切，隨意克隆用限制性內(nèi)切酶酶切，隨意克隆 一些片段，找到僅能與本屬內(nèi)菌株雜交的一些片段，找到僅能與本屬內(nèi)菌株雜交的DNA片段片段 特異性高，但需大量試驗(yàn)方能驗(yàn)證其特異性特異性高，但需大量試驗(yàn)方能驗(yàn)證其特異性 w特定探針：克隆屬內(nèi)代表菌特異性蛋白或毒力因子的基特定探針：克隆屬內(nèi)代表菌特異性蛋白或毒力因子的基 因，從該基因中取一段作為探針，檢驗(yàn)致病菌

25、具獨(dú)特作因，從該基因中取一段作為探針，檢驗(yàn)致病菌具獨(dú)特作 用，但需對(duì)其特異性、敏感性驗(yàn)證用，但需對(duì)其特異性、敏感性驗(yàn)證 牙周病分子生物學(xué)49 探針的驗(yàn)證探針的驗(yàn)證 w 特異性驗(yàn)證：特異性驗(yàn)證： 必須與必須與50種菌屬的種菌屬的80300株菌株進(jìn)行雜交株菌株進(jìn)行雜交 必須與相近細(xì)菌屬中的大量菌間排除必須與相近細(xì)菌屬中的大量菌間排除“交叉雜交交叉雜交” 如伴放線放線桿菌嗜血桿菌屬菌株如伴放線放線桿菌嗜血桿菌屬菌株 w 敏感性驗(yàn)證：敏感性驗(yàn)證： 必須與同屬各地區(qū)分離的必須與同屬各地區(qū)分離的100株以上菌種進(jìn)行雜株以上菌種進(jìn)行雜 交交 如核酸雜交結(jié)果與生化反應(yīng)鑒定結(jié)果有出入，應(yīng)如核酸雜交結(jié)果與生化反應(yīng)

26、鑒定結(jié)果有出入，應(yīng) 進(jìn)一步驗(yàn)證生化結(jié)果。進(jìn)一步驗(yàn)證生化結(jié)果。 牙周病分子生物學(xué)50 寡核苷酸寡核苷酸(oligonucleotide)探針序列探針序列 細(xì)菌 探針名稱 序列 AaAa-2CTTCGGGCACYAGGGCTAAACCCC PgPg-1CAATACTCGTATCGCCCGTTATTC Pg-3CTGTGGAATCTTGACGGTATATCG Pg-4GTATAAAAGAAGTTTAAAYCCTT Pg-5CCGATGCTTATTCTTACGGTACAT Pg-6CCTTAGGACAGTCTTCCTTCACGC BfBf-2CGTATCTCATTTTATTCCCCTGTA Bf-4C

27、TGTAGAGCTTACACTATATCGCA PiPi-1GGTCCTTATTCGAAGGGTAAATGC Pi-2CCCTAGGYGCGCTCCTCGCGGTTA 牙周病分子生物學(xué)51 特定特定DNA片段探針序列（基因探針）片段探針序列（基因探針） 細(xì)菌 靶基因 序列 長度 AaLkta5-CAGCAAGCTGCACAGTTTGCAAA-3238bp 5-CATTAGTTAATGCCGGGCCGTCT-3 16Sr DNA5-GCTAATACCGCGTAGAGTCGG-3443bp 5-ATTTCACCCTCACTTAAAGGT-3 16Sr DNA 5-CTCAGAGATGGTTTGTG

28、CC-3273bp 5-AGATTCACTCCCCATCGCTG-3 Pg Fim A5-ATAATGGAGAACAGCAGGAA-3131bp 5-TCTTGCCAACCAGTTCCATTGC-3 Prt C5-ACAATCCACGAGACCATC-3584bp 5-TTCAGCCACACCGAGACG-3 16Sr DNA5-AGGCAGCTTGCCATACTGCG-3404bp 5-ACTGTTAGCAACTACCGATGT-3 牙周病分子生物學(xué)52 續(xù)表 細(xì)菌 靶基因 序列 長度 Pg16Sr RNA5-GCGTATGCAACTTGCCTTAC-3518bp 5-GTTTCAACGGC

29、AGGCTGAAC-3 Fn50475-CAAATGCTTGTGTCAATAATACT-30.5Kb 5-TTTAGAAGAAATGGTAGAATAAT-3 505905-ATTGTGGCTAAAATTASTAGTT-31Kb 5-ACCCTCACTTTGAGGATTATAG-3 Pi 18Sr RNA5-CCTAATACCCGATGTCCACA-3855bp 5-AAGGAGTCAACATCTCTGTATCC-3 TdTdpA5-AAGGCGGTAGAGCCGCTCA-3311bp 5-AGCCGCTGTCGAAAAGCCA-3 牙周病分子生物學(xué)53 PCR擴(kuò)增擴(kuò)增16SrRNA 基因病原菌

30、檢測(cè)遺基因病原菌檢測(cè)遺 傳學(xué)分類傳學(xué)分類 rRNA是細(xì)胞中最多的一種是細(xì)胞中最多的一種RHA，很多分，很多分 子組成核蛋白體子組成核蛋白體(核糖體核糖體)，rRNA分子大小一般分子大小一般 用超速離心的沉降系數(shù)用超速離心的沉降系數(shù)S表示，表示，S越大，分子越大，分子 也越大。也越大。 牙周病分子生物學(xué)54 16SrRNA基因：細(xì)菌染色體上編碼基因：細(xì)菌染色體上編碼 rRNA相對(duì)應(yīng)的相對(duì)應(yīng)的DNA序列序列 4保守區(qū)穩(wěn)定性（細(xì)菌共有，稱保守區(qū)穩(wěn)定性（細(xì)菌共有，稱“分子化分子化 石石”） 4可變區(qū)特異性（保守區(qū)間有可變區(qū)特異性（保守區(qū)間有V1V10可變可變 區(qū)，含種屬差異信息，如出現(xiàn)區(qū)，含種屬差異信息，如出現(xiàn)3個(gè)堿基以上個(gè)堿基以上 差異，便可判定不同屬）差異，便可判定不同屬） 4多拷貝敏感性（約多拷貝敏感性（約1500個(gè)核苷酸，每細(xì)菌個(gè)核苷酸，每細(xì)菌 含含510個(gè)拷貝）個(gè)拷貝） 牙周病分子生物學(xué)55 16SrRNA編碼基因編碼基因 4保守區(qū)的引物：對(duì)所有細(xì)菌均適宜的引物保守區(qū)的引物：對(duì)所有細(xì)菌均適宜的引物 4可變區(qū)的引物：可變區(qū)的引物：PCR擴(kuò)增，凝膠電泳可鑒擴(kuò)增，凝膠電泳可鑒 別細(xì)菌種屬別細(xì)菌種屬 4間隔區(qū)的引物：間隔區(qū)的引物：16SrRNA和和23SrRNA編碼編碼 基因間存在基因間存在0.5Kb間隔區(qū)，不同種屬間隔區(qū)間隔區(qū)，不同種屬間隔區(qū) 長度的序列有特異性，可鑒別細(xì)菌種屬長度的