實(shí)驗(yàn)三、從瓊脂糖凝膠中回收并純化DNA

1、實(shí)驗(yàn)三：從瓊脂糖凝膠中回收并純化DNA片段生技 1101 112301103 顧晨一 實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后回收并純化 DNA片段的方法二實(shí)驗(yàn)原理將DNA羊品在瓊脂糖凝膠電泳后，在紫外燈下切割下含目的 DNA 片段的凝膠塊； 在高鹽和促溶劑的作用下， 瓊脂糖聚合物中糖之間的 氫鍵斷裂而迅速溶解，DNA就從膠基質(zhì)中釋放出來(lái)并選擇性地吸附到 球狀的硅膠顆料或特定的柱子上；然后用高鹽緩沖液洗滌除去殘余的瓊脂糖， 再用含乙醇的緩沖液洗去鹽和染料。最后用TE緩沖液或水將球狀硅膠顆?；蛑由系?DNA 洗脫下來(lái)?；厥占兓蟮腄NA可直接用于DNA勺連接反應(yīng)、標(biāo)記反應(yīng)、 測(cè)序反應(yīng)或DNA的微量注

2、射等研究。三實(shí)驗(yàn)材料1. 水浴鍋、離心機(jī)、移液器2. PCR擴(kuò)增的Rv1791基因3. Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0( Taraka )四實(shí)驗(yàn)步驟(1) 實(shí)驗(yàn)三中的PCF產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳。(2) 在紫外燈下切出含有目的 DNA的瓊脂糖凝膠，用紙巾吸盡凝膠 表面的液體。盡量切除不含目的DNA部分的凝膠，盡量減小凝膠體積，提高 DNA回收率。切膠時(shí)不要將DNA長(zhǎng)時(shí)間暴露于紫外燈下，以防止 DNA損傷。(3) 切碎膠塊。膠塊切碎后可以減少步驟6的膠塊融化時(shí)間，提高 DNA勺回收率。(4) 稱量膠塊重量，計(jì)算膠塊體積。計(jì)算膠塊體積時(shí)，以1

3、mg=1卩 l進(jìn)行計(jì)算。(5) 向膠塊中加入3倍凝膠體積的膠塊融化液DR-I Buffer。(6) 均勻混合后75C加熱融化膠塊，此時(shí)應(yīng)間斷振蕩混合，使膠 充分融化(約610min)。(7) 向上述膠塊融化液中加入 DR-I Buffer量的1/2體積量的DR-IIBuffer，均勻混合。當(dāng)分離小于400 bp的DNA片段時(shí)，應(yīng)在此溶液 中再加入終濃度為20%勺異丙醇。(8) 離心柱放入收集管中，將步驟7的溶液轉(zhuǎn)移至離心柱中，12,000 rpm, 1mi n,棄濾液。如將濾液再加入離心柱中離心一次，可以提高DNA勺回收率。(9) 將500卩l(xiāng)的Rinse A加入離心柱中，12,000 rpm

4、, 30s，棄濾 液。(10) 將700卩l(xiāng)的Rinse B加入離心柱中，12,000 rpm , 30s，棄 濾液。(11) 重復(fù)操作步驟10，將離心柱放入收集管中，12,000 rpm, 1min。(12) 將離心柱放入新的指形管中，在離心柱膜的中央處加入25卩l(xiāng)的滅菌蒸餾水或Elution Buffer，室溫靜置1min。注)把滅菌蒸餾水或 Elution Buffer 加熱至60C使用時(shí)有利于提高洗脫效率。(13) 12,000 rpm , 1min,洗脫 DNA五實(shí)驗(yàn)結(jié)果根據(jù)電泳結(jié)果，描述對(duì)DNA片段回收的結(jié)果與效率?；厥招瘦^低。實(shí)驗(yàn)時(shí)操作不夠到位六、思考題凝膠抽提法回收純化DNA片段的原理是什么？將DNA羊品在瓊脂糖凝膠電泳后，在紫外燈下切割下含目的DNA片段的凝膠塊； 在高鹽和促溶劑的作用下, 瓊脂糖聚合物中糖之間的 氫鍵斷裂而迅速溶解，DNA就從膠基質(zhì)中釋放出來(lái)并選擇性地吸附到 球狀的硅膠顆料或特定的柱子上；然后用高鹽緩沖液洗滌除去殘余的瓊脂糖, 再用含乙醇的緩沖液 洗去鹽和染料。最后用TE緩