蛋白質(zhì)組分析

1、蛋白質(zhì)組分析蛋白質(zhì)組(proteome)源于蛋白質(zhì)(protein )與基因組(genome)兩個詞的雜合，其定義 為proteins expressed by a genome,即一個基因組表達的全部蛋白質(zhì)。目前認為蛋白質(zhì)組的內(nèi) 涵是一個細胞、一類組織或一種生物的基因組所表達的全部蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)組學(proteomics)是研究蛋白質(zhì)組的一門新興學科，旨在闡明生物體全部蛋白質(zhì) 的表達模式及功能模式。蛋白質(zhì)化學著重于單一蛋白質(zhì)結構、功能的研究，例如某一種蛋白 質(zhì)或蛋白質(zhì)亞基的全序列分析，三維立體結構的確定，這樣的結構如何執(zhí)行功能、在生理上 所扮演的角色，以及代謝的生化機制等。蛋白質(zhì)組學則是研究

2、多種蛋白質(zhì)組成的復雜系統(tǒng)。 Proteomics的字尾-omics”的意思是組學”，代表對生物、生命體系研究工作方式的重新 定義，也就是說，蛋白質(zhì)組學是對基因組所表達的整套蛋白質(zhì)的分析，其研究對象是多蛋白 質(zhì)混合物的“系統(tǒng)”行為，而不是“單一組成”的行為。它通過對一個大系統(tǒng)中包含的所有 蛋白質(zhì)進行分離、鑒定、表征和定量，提供關于該系統(tǒng)準確和全面的數(shù)據(jù)和信息。蛋白質(zhì)組與基因組通常，一個細胞中表達兩類基因：必須功能蛋白質(zhì)的基因；行使細胞專一性功能蛋 白質(zhì)的基因。因此，一種生物有一個基因組，但有許多蛋白質(zhì)組。因此，蛋白質(zhì)組與基因組 在內(nèi)涵上有很大的不同，主要表現(xiàn)在以下四個方面:(1) 蛋白質(zhì)組具有多

3、樣性EXON1EXON2EXON1EJU3FU衲EXONZ1 rullranOaEiLrtil2PTTM)啣 Vf iriLjsaujE)圖11.1基因以多種mRNA形式剪接的示意圖EXON :外顯子，真核細胞基因DNA中的編碼序列。這樣的序列可轉錄為RNA并進而翻譯為蛋白質(zhì)。 P代表磷酸化，sugar代表糖基化，lipid代表脂肪?；琔b代表泛素化。(2) 在蛋白質(zhì)組的研究中，時間和空間的影響都不可忽視(3) 蛋白質(zhì)間主要以相互作用的形式參與生命活動(4) 蛋白質(zhì)組研究對技術的依賴性和要求遠遠超過基因組學蛋白質(zhì)組學研究對生物分析化學提出的挑戰(zhàn)表11.1目前蛋白質(zhì)組學分析中使用的分離與鑒定技

4、術6-12技術是否需要標記是否可可測定的蛋白質(zhì) 用于分子量范圍動態(tài)范圍PTM檢測USA1|：GTPA 卜 -j 5 kD的肽或蛋限于UV檢測，否是1002 500二維色譜系統(tǒng)白質(zhì)未與MS聯(lián)用適用于較復雜的可 以用LC-MS/MS多維色1415 蛋白質(zhì)經(jīng)酶解后910蛋白質(zhì)混合物，N /N 標記是10, 0009872譜系統(tǒng)(MudPit)的多肽混合物進行MS分析前氨基酸需進行分級分離 10 kD，實際測通過肽質(zhì)量指紋MALDI-TOF-MS否是定蛋白質(zhì)經(jīng)酶解25不適用圖鑒定已分離的后的多肽混合物蛋白質(zhì)利用蛋白質(zhì)芯片11對生物樣品中蛋SELDI-TOF-MS 否是v 40 kD25不適用白質(zhì)的質(zhì)量

5、進行分析適用于含巰基蛋ICAT以ICAT試劑蛋白質(zhì)經(jīng)酶解后是無數(shù)據(jù)49612白質(zhì)的相對定量分析技術標記巰基的多肽混合物分析以可裂解的適用于含巰基蛋cICATC /C ICAT蛋白質(zhì)經(jīng)酶解后分析技術試劑標記巰否的多肽混合物10, 000496白質(zhì)的相對定量基分析注: 2-DE，雙向電泳 (two dime nsional electrophoresis)； DIGE，熒光雙向差示凝膠電泳(fluoresce nee two-dime nsio nal differe ntial gelelectrophoresis)； MudPit，用于蛋白質(zhì)分離的多維色譜(multi-dimensional

6、for protein identification )； SELDI-MS，表面增強激光解吸離子化一質(zhì)譜(surface enhanced laser desorption ionization-MS);基質(zhì)輔助激光解吸離子化 一質(zhì)譜(MALDI-MS ，matrix-assisted laser desorption ionization-MS)； ICAT，同位素標記的親和標簽 (isotope-coded affinity tag)技術；cICAT，可裂解的 ICAT ( cleavable ICAT) 技術；PTM，蛋白質(zhì)翻譯后的修飾(posttranslational modifi

7、cation )。A-.蚩白質(zhì)組學方法的員戦度B：當自區(qū)組學方法釣分耕率圖11.2蛋白質(zhì)組學分析方法的靈敏度和分辨率13表11.1和圖11.2表明，蛋白質(zhì)組學研究對生物分析化學提出了很高的要求：(1) 對含有巨大數(shù)量的多蛋白質(zhì)成分的復雜體系進行全分離是蛋白質(zhì)組學研究迫切需要解決的問題。(2) 所建立的生物分析化學分離分析方法應具有很寬的動態(tài)范圍，才能適應細胞內(nèi)蛋白質(zhì) 組分析的要求。(3) 蛋白質(zhì)組學研究對檢測靈敏度也提出了很高的要求。(4) 原位、實時檢測。(5) 對蛋白質(zhì)相互作用的檢測是蛋白質(zhì)組學研究中一個非常重要的內(nèi)容，因此，發(fā)展基于 生物化學的新的、重現(xiàn)性好的蛋白質(zhì)相互作用研究策略也是十

8、分重要的。蛋白質(zhì)組學的分析策略與研究路線Nit圖11.3蛋白質(zhì)組學分析的基本分析策略tl.OW 斡的&.務肚的MS- MS質(zhì)誥戳據(jù)也數(shù)據(jù)冉中址打搜盍和匹配蛋白質(zhì)組學的基本分析策略Bnlwin! lb童.略甌向電綠畀H電巻蔓略圖11.4鳥槍法的基本分析策略蛋白質(zhì)組學的研究路線一條路線類似于基因組學的研究，即力圖查清人類34萬個基因編碼的所有蛋白質(zhì)，建立蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，從而獲得有關生命活動的“全景式”信息。另一條是基于比較的研究路線， 稱為比較蛋白質(zhì)組學(comparative proteomics ),國外的文獻中也有稱為差異顯示蛋白質(zhì)組學(differential display proteom

9、ics ) 或表達蛋白質(zhì)組學(expression proteomics)。圖11.5比較蛋白質(zhì)組學分析的研究路線雙向電泳技術及其改進雙向電泳（two dimensional electrophresis， 2-DE）是當前蛋白質(zhì)組學研究中分辨率最高、信息量最大的分離技術。在比較蛋白質(zhì)組學研究中，雙向電泳還是不可缺少的手段。目前所 應用的二維電泳體系是由O Farrell等人于1957年發(fā)明，其原理是根據(jù)蛋白質(zhì)的兩個一級屬性（等電點和相對分子質(zhì)量），將一種蛋白質(zhì)樣品進行兩次電泳，即：在第一個方向上按等電 點高低進行分離，稱為等電聚焦；在第二個方向（與第一次電泳成直角的方向）上按相對分 子質(zhì)量大

10、小進行分離。蛋白質(zhì)組學研究中用得最多的是由固相 pH梯度等電聚焦（immobilized pH gradients isoelectric focusing， IEF）/SDS-PAGE 所構成的雙向電泳體系。雙向電泳的流程+- 尊電興桔后的（1承A:為：W向弊|1贏殂屯債“通也樂的術白M固対氈HI備冃的畀電由豪離儒訊黑上不日前卩H嶽度他.4 （ it即電at*.折的.J?勢在他s和urn申平hef權粘上的出門威朋吹帶卻開的斷|.盧虺城再聲段蟲BiASOS-PAGE.料!品中的出白虞史白M亞塔般尹的天小切夙冊冨圖11.6雙向電泳流程圖19蛋白質(zhì)樣品的制備蛋白質(zhì)樣品制備的一般要求一般來說，一種理

11、想的、有效的樣品制備方法應滿足以下要求：應使所有待分析的蛋 白樣品全部處于溶解狀態(tài)（包括多數(shù)疏水性蛋白），且制備方法應具有可重現(xiàn)性；溶解方法要保證樣品在電泳過程中保持溶解狀態(tài)，避免溶解性低的蛋白質(zhì)（如膜蛋白）在等電聚焦時由于溶解度降低而沉淀析出；防止在樣品處理過程發(fā)生蛋白質(zhì)的化學修飾，包括蛋白質(zhì)降解、 蛋白酶或尿素熱分解后所引起的修飾；排除核酸、多糖、脂類和其它干擾分子；同時，應 避免處理環(huán)境對蛋白質(zhì)的污染；盡量去除起干擾作用的高豐度或無關蛋白，從而保證待研究蛋白在可檢測水平；盡可能縮短處理樣品的時間，盡可能在低溫環(huán)境中處理樣品。 雙向電泳圖譜所傳達的信息由雙向電泳圖可以得到：蛋白質(zhì)的分布范圍

12、(偏酸性或偏堿性)；表達蛋白質(zhì)的可能個數(shù)(凝膠點的數(shù)目)：蛋白質(zhì)的大概相對分子量；蛋白質(zhì)的大概等電點；蛋白質(zhì)相對 表達豐度(點的灰度值)等信息。人血茶的須向電蘇冊圖11.7 雙向電泳例圖23圖像分析技術圖像分析包括圖像采集、背景消減、斑點配比、數(shù)據(jù)庫構建。常用的圖像采集系統(tǒng)有電感偶合裝置(charge coupled devices, CCD)、光密度儀、激光誘導熒光檢測器等。無論何種 采集系統(tǒng)，都必須具備透射掃描的功能以獲得較高的靈敏度。圖像采集的信息為光密度值， 一般來說，該光密度值與蛋白質(zhì)點的表達豐度成正比。影響圖像采集質(zhì)量的因素有：掃描系 統(tǒng)的分辨率、靈敏度，以及掃描時所選擇的圖像對比

13、度和明亮度。雙向電泳圖像分析通過軟件的運行來實現(xiàn)。軟件分析所要做到的有以下幾點：蛋白質(zhì)點 數(shù)的統(tǒng)計；蛋白質(zhì)點的定位、編號；相對豐度分析；在進行差異蛋白質(zhì)組分析時，則要對相 互對照樣品的凝膠圖像進行同步分析，比較對應蛋白點的表達豐度，獲得差異蛋白質(zhì)點的缺 失、出現(xiàn)以及表達量的變化等信息。目前有多種圖像分析軟件可以使用，如表11.6所列。表11.6用于2-DE圖像分析的軟件工具軟件名稱來源應用FlikerNational Cancer Institute ( / fliker/ )可視的膠-膠對比PDQuestBio-Rad ()

14、凝膠圖像比較Image MsterAmersham Biosciences ()凝膠圖像比較DeCyderAmersham Biosciences ()*2D-DIGE 分析MelanieGenebio (http: / / )凝膠圖像比較Phoretix/ProgenesisNonlinear Dynamics (http: / /)凝膠圖像比較Investigator HT AnalyzerGenomic Solut

15、ions ( http: / / )凝膠圖像比較Proteome WeawerDefiniens (http: / / )凝膠圖像比較Delta 2DDecodon (http: / / )凝膠圖像比較* 2D-DIGE :熒光雙向差示凝膠電泳目前雙向電泳技術存在的問題(1) 進行可完全重復的 2-DE分析是困難的。(2) 許多較大的疏水蛋白質(zhì)在IEF分析中的結果不理想。(3) 對相對分子質(zhì)量過大(100, 000)的蛋白質(zhì)分離分析能力差。(4) 雙向電泳不易實現(xiàn)自動化操作，因此，尚

16、不能適應大規(guī)模蛋白質(zhì)組分析的需要。(5) 雙向電泳現(xiàn)有的主要染色技術的檢測靈敏度較差。Ipg 10M a 102 麗 Lmi 10ms JiKimg(IX卩耳卩萬 I於K 10 (IX15*) (1XID1*)K內(nèi)用Eq卻細審融)L一里門計畝號歐嘉JT口廉皓+芷a二-.圖11.8目標蛋白拷貝數(shù)與膠上荷載的由細胞提取的蛋白質(zhì)量的關系24雙向電泳技術的改進目標主要有兩個：提高分辨率，增加可分離的蛋白點的數(shù)目；提高低豐度蛋白點的 可檢出程度。 11.4. 5. 1三步提取法打411 SW%JK IU.i( HAPSiTris. Tftk上帶湫進和HD詼離據(jù)垠議J(mlhjiJvmClfAFSSBJr

17、-ICiTrii BdLvbe-yTBPr：林進f A。!：分髙當i%圖11.9三步提取法流程圖 11.4. 5. 2亞細胞器分離優(yōu)點為：增加了蛋白的點分離數(shù)量；可提高低豐度蛋白的檢出；可明確蛋白點的 亞細胞定位。圖11.10肝癌細胞QGY-7703全細胞及細胞核、20000 g沉淀、100, 000 g沉淀、細胞質(zhì)的雙向電泳圖熒光雙向差示凝膠電泳技術(fluoresce nee two-dime nsional differe ntial gel electrophoresis , 2-DDIGE)2-D DIGE是由Amersham公司開發(fā)的一種改良技術。它在傳統(tǒng)雙向電泳技術的基礎 上，結

18、合多重熒光分析的方法，在同一塊膠上共同分離多個分別由不同熒光染料標記的樣品。在2-D DIGE技術中，每個蛋白點都有它自己的內(nèi)標，并且軟件全自動根據(jù)每個蛋白點的內(nèi)標對其表達量進行校準，保證所檢測到的蛋白豐度變化是真實的。這種技術可檢測到樣品間小 于10%的蛋白表達差異，統(tǒng)計學可信度達到95%以上。3林記時用樣扁處理樣品時光掃描表達義并圖11.112-D DIGE的實驗流程圖蛋白質(zhì)組學分析中的色譜技術及幾種分離技術的“雜交”多維液相色譜技術多維液相色譜（multidimensional HPLC ，MDLC）技術是指連續(xù)使用幾種液相色譜分離模 式以使復雜混合物中的成分得到更大程度的分離的色譜技術

19、。與2-DE相比，多維液相色譜的主要優(yōu)點為：有高的選擇性，能從含多種未知組分、組 成復雜的蛋白質(zhì)樣品中分離出需要的組分；對于低豐度成分有很好的富集和檢出能力； 易于實現(xiàn)自動化操作，分析數(shù)據(jù)重現(xiàn)性好。二維液相色譜的基本操作流程是：樣品在經(jīng)過的基礎上，利用高壓切換閥，把譜圖中的 某個色譜峰（混合組分峰）的一部分（或全部）選擇性地切換到二維色譜柱上進行再次分離。 常采用的二維液相色譜分離模式有：離子交換色譜-反相液相色譜、色譜聚焦-反相液相色譜、分子排阻色譜-反相液相色譜、親和色譜-反相液相色譜等。開展工柜I KIJ %總hi椎色iwm分帆akj.uri3F.wxfii圖11.12酵母可溶性蛋白提取

20、物的MDLC分析幾種分離技術的“雜交”蛋白質(zhì)混合物通過制備 IEF、制備1D-SDS-PAGE或HPLC （如親和色譜）分離整體蛋白 質(zhì)混合物，然后對分離得到的組分進行酶解，所產(chǎn)生的肽在進入MS前進行HPLC分離。這種策略的優(yōu)點在于：利用電泳技術或HPLC技術對整體蛋白質(zhì)混合物進行前端處理的樣品量較大，可以達到若干毫克。去除與分析目標不相關的蛋白質(zhì)，提高MS檢測低豐度組分的能力。生物質(zhì)譜在蛋白質(zhì)組學分析中的應用在蛋白質(zhì)組學的研究中，生物質(zhì)譜可以開展三個方面的基礎工作：（1 ）以MALDI-TOF-MS 或ESI-MS精確測定完整蛋白質(zhì)或肽的相對分子質(zhì)量；（2）以MALDI-TOF進行肽質(zhì)量指紋

21、譜的測定，這是利用質(zhì)譜測定由一種蛋白質(zhì)酶解出的一 組肽產(chǎn)物的技術；（3）以ESI-MS/MS或ESI-Q-TOF-MS進行肽序列的分析，這是測定一種蛋白質(zhì)酶解出的一 組肽產(chǎn)物中一種（或多種）肽的質(zhì)量碎片譜圖的技術。精確測定完整蛋白質(zhì)或肽的相對分子質(zhì)量MALDI-TOF-MS 測定相對分子質(zhì)量(1)MALDI-TOF-MS測定相對分子質(zhì)量使用線性模式或反射模式。(2)MALDI-TOF-MS對分析樣品的要求。(3)MALDI-TOF-MS分析中的基質(zhì)選擇。(4)MALDI-TOF-MS分析中的質(zhì)量校正。表11.8肽質(zhì)量準確度與蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫檢索結果*分子離子誤差(ppm)匹配蛋白質(zhì)數(shù)所有種類a酵母

22、b1975.954100075417310020076104461562.884100098212010019727101921055.541100013001731005147610876* 通過 http : /prospector, 網(wǎng)址用MS-FIT程序進行檢索a：所有種類蛋白質(zhì)為 52, 205個;b：酵母蛋白質(zhì)為3653 個ESI-MS測疋相對分子質(zhì)量在ESI條件下，能與多肽或蛋白質(zhì)分子結合的質(zhì)子數(shù)，也就是正電荷數(shù)，由分子中所含堿性氨基酸（ARG , LYS , HIS ）總數(shù)和N-端氨基決定。蛋白質(zhì)和多肽形成多電荷離子的特 性使分析質(zhì)量范圍在 24 kDa（ m/

23、z）的四極桿和離子阱質(zhì)量分析器可用于生物大分子的分離。ESI-MS圖不能直接獲得蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量信息，必須通過一個重組的過程，即用計算機軟件處理多電荷譜圖的原始數(shù)據(jù)，求算相對分子質(zhì)量。常用的是Mann等建立的“平均算法” 34。該算法利用蛋白質(zhì)正離子的ESI-MS譜計算其相對分子質(zhì)量是基于兩個假定：在一個多電荷離子系列中，相鄰峰值相差1個電荷；電荷是由于陽離子的加成（通常為質(zhì)子）所致。顯然，多電荷譜圖的的分辨率越高，重組所得的結果越準確。為了保證重組結果 的可靠性，還需注意：用于計算的多電荷峰的分布形狀：隨著電荷的減少，由低豐度向高 豐度再向低豐度變化；該算法需要有至少4個以上的多電荷離子

24、方能保證其準確。表11.10幾種蛋白質(zhì)的多重電荷數(shù)蛋白質(zhì)分子量濃度（卩mol L -1）電荷數(shù)質(zhì)量范圍（m/z）胰島素5, 7301.74 69501,450細胞色素12, 4001.3512 21550 1, 100溶菌酶14, 3000.3510 131, 100 1, 500肌紅蛋白17, 00029.51627600 1, 100a -糜蛋白酶原A25, 70019.017221, 100 1, 500乙醇脫氫酶39, 80012.532 468001,300a -淀粉酶54, 7001.835 588801,550伴清蛋白176, 0000.2249 641,200 1, 500圖1

25、1.13 溶菌酶的ESI-MS質(zhì)譜圖右上角的小圖是溶菌酶的多電荷離子質(zhì)譜圖，大圖是經(jīng)“去卷積”數(shù)據(jù)處理的重組質(zhì)譜圖，溶菌酶的相對分子質(zhì)量為14, 305.7。從重組譜圖中可以看出，該分子質(zhì)量峰有一定的寬度，這是由于同位素峰的影響造成的。用肽質(zhì)量指紋譜鑒定蛋白質(zhì)肽質(zhì)量指紋譜（peptide mass fingerprinting，PMF ）是指蛋白質(zhì)被酶切位點專一的蛋白酶水解后得到的肽片段質(zhì)量圖譜，由于其具有特征性，所以稱為指紋譜。PMF可用于蛋白質(zhì)的鑒定，即用實驗測得的蛋白質(zhì)酶解肽段質(zhì)量數(shù)在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中檢索，尋找具有相似肽指紋 譜的蛋白質(zhì)。肽質(zhì)量指紋譜的基本實驗步驟肽質(zhì)量指紋譜的基本實驗步驟

26、包括：2-DE膠上切下需要鑒定的未知蛋白點，脫色；酶切；肽提取及 MALDI-TOF質(zhì)譜分析；數(shù)據(jù)庫檢索、鑒定蛋白質(zhì)。來巾皆DE的未知蛍白點煥逸僵白VIVMMAV4 W2MVU M 2 MU1比對昇片股井子量郵確窪譙黃白質(zhì)身井圖11.14用肽質(zhì)量指紋圖鑒定蛋白質(zhì)的基本流程圖1 1 Jr na/iM ALDI-TDF 悟或 ESi-isflr 析為到 pwPMF分析中所用的蛋白酶在PMF分析中，使用蛋白酶的目的是盡可能多的獲得合適長度的肽片段供MS分析。含有620個氨基酸殘基的肽片段適合于MS分析和數(shù)據(jù)庫比較。氨基酸殘基少于6個的肽太短，不能在數(shù)據(jù)庫檢索中產(chǎn)生唯一的序列匹配；而氨基酸殘基多于20

27、個的肽，難以獲得序列信息。對用于PMF的酶的一般要求是：易得，純度高，穩(wěn)定性好，為提高 PMF檢索數(shù)據(jù)庫的 準確性，產(chǎn)生肽譜的酶切點至少要有兩個。在蛋白質(zhì)組學分析中，常用的酶有胰蛋白酶和Glu-C。PMF的數(shù)據(jù)庫檢索PMF所提供的是蛋白質(zhì)經(jīng)酶解后所得到的肽混合物的精確質(zhì)量數(shù)據(jù)，要完成蛋白質(zhì)的鑒 定，還需要利用這些數(shù)據(jù)通過數(shù)據(jù)庫檢索尋找匹配的蛋白質(zhì)。開展數(shù)據(jù)庫檢索的基礎是： 數(shù)據(jù)庫的選擇；肽質(zhì)量指紋譜軟件工具的選擇與利用。常用的軟件有 Mascot, Peptide Search,MS-fit , ProFound 等。影響PMF結果的因素(1 )靈敏度。(2)可檢測到的肽段少，對數(shù)據(jù)庫檢索是不

28、利的。(3 )精確度。(4) 質(zhì)量校正是實驗中必不可少的一步，尤其是對TOF質(zhì)量分析器，質(zhì)量校正非常重要而且需常規(guī)進行。(5 )分辨率。(6 )數(shù)據(jù)庫。(7)樣品制備。用串聯(lián)質(zhì)譜分析肽序列和鑒定蛋白質(zhì)PMF是鑒定蛋白質(zhì)的一種簡單、可行的分析策略，在目前的蛋白質(zhì)組學分析中，許多工 作可以通過這一策略來完成。例如，人血紅蛋白 a鏈的胰蛋白酶消化產(chǎn)生14個胰蛋白酶酶解肽，其中，序列為VGAHAGEYGAEALER 肽的M+1 +單同位素精確質(zhì)量(m/z)為1529.734 8,而來自小鼠的 血紅蛋白a鏈的IGGHGAEYGAEALER肽有4個氨基酸與之不同， 其M+1 +單同位素精確質(zhì) 量也是152

29、9.34 8，PMF技術沒有能力對這種序列的不同加以辨認。因此，對于難以通過 PMF得到滿意結果的，則需要通過ESI-MS/MS分析來進行蛋白質(zhì)的鑒定。ESI-MS/MS測序的關鍵步驟是在多肽一級質(zhì)譜的基礎上，選擇母離子(pare nt ion)，通常是(M+H) +或(皿+門巴n+離子，使之進一步發(fā)生解離，得到更小的碎片離子，根據(jù)碎片離子之間 的質(zhì)量差來“拼接”、“復原”肽類分子的構成，從而進行氨基酸序列的推測。碎片離子的產(chǎn)生模式產(chǎn)生碎片離子常采用碰撞誘導解離( collision induced dissociation ， CID)、碰撞活化解離(collision active dis

30、sociation ，CAD )、源后衰變(post-source decay， PSD)等模式。MS/MS中的肽離子裂解11IH單IN卑子-Stiff 錚析屮件壯丼井子St主單巾產(chǎn)主JE小曲離石if片.離尸辟片4：.圖 11.15串聯(lián)質(zhì)譜CAD分析示意圖的開裂II Cl I-CcanoNH-CI1-C-UIL圖11.16肽的串聯(lián)質(zhì)譜碎片離子示意圖蛋白質(zhì)多肽主鏈開裂的主要方式有三種，即：a/x、b/y和c/z的成對出現(xiàn)。一般而言，b/y開裂產(chǎn)物的豐度較高，a/x開裂在許多蛋白質(zhì)的開裂中也占有主導地位，而c/z開裂則較少出現(xiàn)。N端的片段，y離子是電荷b離子和相應的y離子。(1) 酰胺鍵斷裂，形成

31、 b離子、y離子。b離子是電荷保留在保留在C端的片段。當母離子帶有雙電荷時，有可能產(chǎn)生一系列正離子Jffi齟散b島子汕子8?.1SPAFDSliXrAETLF 比討1J2J.A185.SFhjAFD5ILklLTLf1226.4256.3SPAFUSBIAEILF :巧Jn5.4SSPAFDMAETLFT*11SPAFD$BIAETir 鈕Jz1645.點SFAFDS佝】B1AETLF g0SSPAFDy(Ih,)MAETEF 如JI側.0SPAFDSBIgAETL F g.7911.1sPArosnugETLF gWMb3O50.2SPAFDSBMAE啊丿TLF知Jfi.5im.SSPAFD

32、SBIAETLF yp4I26J4SPAiTOSilMrAETLF(V,)1417.2圖11.17 帶有雙電荷的SPAFDSIMAETLF 2+可能產(chǎn)生的b、y離子系列(括號內(nèi)為離子片斷的質(zhì)量數(shù))(2) 羰基碳原子與相鄰的a碳原子間的C-C鍵斷裂，形成a離子、x離子。a離子是電荷 保留在N端的片段，x離子是電荷保留在 C端的片段。(3) 酰胺氮原子與相鄰的a碳原子間的N-C鍵斷裂，形成c離子、z離子。c離子是電荷 保留在N端的片段，z離子是電荷保留在 C端的片段。通過MS/MS進行肽序列分析的基本原理在目前的MS/MS分析中，主要是根據(jù)完整或互補的y、b離子系列來確定肽的序列。用ESI-MS/

33、MS譜圖鑒定蛋白質(zhì)的策略(1) 串聯(lián)質(zhì)譜數(shù)據(jù)直接搜尋策略(2) de Novo 策略(3) 肽序列標簽(peptide sequenee tags PSTs)策略T 二二丄*7IS.8 S-M.O 9M.I I0MI.2|i!1執(zhí)庠附質(zhì)捷*圖11.18肽序列標簽示意圖肽序列標簽是由一個肽段的分子量、該肽段的部分氨基酸序列、該肽段未測序前部分和測序后部分的質(zhì)量組成表面增強激光解析電離飛行時間質(zhì)譜技術表面增強激光解析電離飛行時間質(zhì)譜技術( surfaee-enhanced laser desorption/ionization time-of-?ight mass spectrometry , S

34、ELDI-TOF-MS )是在 MALDI-TOF-MS 基礎上發(fā)展起來的 一種有效的比較蛋白質(zhì)組學研究技術。這一技術最早由德國科學家Lueking等開始研究，美國賽弗吉公司(Ciphergen Biosystem Inc.)進行了系統(tǒng)研發(fā)，對 MALDI-TOF-MS 技術所使用的 疏水性樣品板表面進行了系統(tǒng)的改進，發(fā)展成為蛋白質(zhì)芯片(proteinchip arrays )系列。蛋白質(zhì)芯片的種類與特點分為化學表面芯片(chemical surfaces protein expression profiling )和生物表面芯片(biochemical surfaces prote in in teract ion assays )兩大類?；瘜W表面芯片化學表面芯片是基于色譜的原理設計的，即將色譜介質(zhì)鋪于芯片材料表面，形成一個特 殊的物理化學表面，通