全血線粒體DNA萃取試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)中文版

1、全血線粒體DNA萃取試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)(中文版) 主要用途 全血線粒體DNA萃取試劑是一種旨在通過(guò)化學(xué)溶解純化血白細(xì)胞、物理或化學(xué)破膜及離心處理獲得線粒 體，然后進(jìn)一步生物酶處理以獲得高質(zhì)量的線粒體DNA的權(quán)威而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過(guò)精心研制、 成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種動(dòng)物血細(xì)胞中的線粒體核酸成分處理。用于后續(xù)的雜交、克隆、酶切、PCR 分析等。產(chǎn)品即到即用，操作簡(jiǎn)易，性能穩(wěn)定，無(wú)核酶污染，萃取純度和產(chǎn)量皆高。 技術(shù)背景 線粒體細(xì)胞器的研究是現(xiàn)代細(xì)胞生物學(xué)的最重要的課題之一。線粒體成為生物衰老、古生物、細(xì)胞凋亡、 腫瘤、HIV、老年癡呆癥、糖尿病、肌肉疾病等研究的主要對(duì)象。線粒體DNA的

2、分離和定量以及突變分析 是研究中必不可少的。 產(chǎn)品內(nèi)容 溶血液(Reagent A) 毫升 清理液(Reagent B) 毫升 裂解液(Reagent C) 毫升 凈化液(Reagent D) 毫升 強(qiáng)化液(Reagent E) 毫升 保存液(Reagent F) 毫升 破膜液(Reagent G) 毫升 去干擾液(Reagent H) 微升 酶解液(Reagent I) 微升 萃取液(Reagent J) 毫升 濃縮液(Reagent K) 毫升 助沉液(Reagent L) 微升 沉淀液(Reagent M) 毫升 純化液(Reagent N) 毫升 緩沖液(Reagent O) 毫升 產(chǎn)

3、品說(shuō)明書(shū)1份 保存方式 保存凈化液(Reagent D)、 去干擾液(Reagent H)、 酶解液(Reagent I)、萃取液(Reagent J和 助沉 液(Reagent L)在20C冰箱里，其余的保存在4 C冰箱里，有效保證 6月 用戶自備 1.5毫升離心管：用于核酸操作的容器 15毫升錐形離心管：用于線粒體初步制備的容器 50毫升錐形離心管：用于血細(xì)胞處理的容器 渦旋震蕩儀：用于混勻 4C微型臺(tái)式離心機(jī)：用于沉淀細(xì)胞和核酸 4C超速離心機(jī)：用于分離細(xì)胞器成分 DOUNCE勻漿器：用于裂解細(xì)胞 58 C恒溫水槽：用于孵育反應(yīng)物 實(shí)驗(yàn)步驟 一、白細(xì)胞分離 實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，室溫預(yù)熱血溶液(R

4、eagent A),同時(shí)4C預(yù)冷 清理液(Reagent B)。然后進(jìn)行下列操作。 1. 準(zhǔn)備2個(gè)無(wú)菌的50毫升錐形離心管 2. 輕輕混勻新鮮的EDTA抗凝的全血樣品 3. 分別移出5毫升全血樣品到每個(gè) 50毫升錐形離心管 4. 分別加入毫升室溫預(yù)熱的 血溶液(Reagent A) 5. 輕輕上下傾倒離心管 5次，確保充分混勻 6. 室溫下(25C)孵育4分鐘，期間輕輕上下傾倒離心管數(shù)次(注意：肉眼可以觀察到血液顏色由不透 明紅色到清澈紅色的變化) 7. 放進(jìn)臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為300g & 小心抽掉上清液，留下 500微升液體，以防抽掉白細(xì)胞顆粒群 9. 用手指輕彈離心管2至3下，使

5、白細(xì)胞顆粒群松動(dòng) 10. 分別加入毫升預(yù)冷的 清理液(Reagent B)，混勻細(xì)胞 11. 2管50毫升錐形離心管合并為 1管 12放進(jìn)臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為300g 13. 小心抽去上清液 14. 加入毫升預(yù)冷的 清理液(Reagent B)，混勻細(xì)胞 15放進(jìn)臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為300g 16.小心抽去上清液，確保沒(méi)有液體殘留(注意：如果暫時(shí)停止操作，須暫時(shí)放進(jìn)一70C冰箱里) 二、白細(xì)胞線粒體分離 實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，將試劑盒里的 凈化液(Reagent D)凍融，然后移出毫升 凈化液(Reagent D)和 毫 升的 裂解液(Reagent C)到15毫升錐形離心管里，混勻

6、后，標(biāo)記為裂解工作液，置入冰槽里備用。然 后進(jìn)行下列操作，根據(jù)用戶要求選擇其中一種方法： 方法一：細(xì)胞勻漿法 1. 加入預(yù)冷的毫升裂解工作液 2. 渦旋震蕩5秒，充分混勻細(xì)胞顆粒群 3. 即刻放進(jìn)預(yù)冷的DOUNCE勻漿器 4. 在冰槽里用勻漿棒勻化細(xì)胞(約 20至40下)(注意：參見(jiàn)注意事項(xiàng)11) 5. 將所有細(xì)胞勻漿物移入 15毫升錐形離心管 6. 放進(jìn)4C臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為1500g 7. 小心移出上清液到另一個(gè)新的預(yù)冷的15毫升錐形離心管一一此步驟去除細(xì)胞核和未溶解的細(xì)胞 8 放進(jìn)4C超速離心機(jī)離心10分鐘，速度為10000g 9. 小心抽去上清液，保留沉淀顆粒 一一此步驟獲

7、得線粒體沉淀物 方法二、化學(xué)處理法 1. 加入預(yù)冷的毫升裂解工作液 2. 渦旋震蕩5秒，充分混勻 3. 在冰槽里孵育2分鐘，其中每間隔一分鐘渦旋震蕩5秒 4. 加入預(yù)冷的微升 強(qiáng)化液(Reagent E) 5. 渦旋震蕩5秒，充分混勻 6. 在冰槽里孵育5分鐘，其中每間隔一分鐘渦旋震蕩5秒(注意：參見(jiàn)注意事項(xiàng)12) 7. 加入預(yù)冷的毫升 保存液(Reagent F)，用手指輕彈混勻 8 放進(jìn)4C臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為1500g 9. 小心移出上清液到另一個(gè)新的預(yù)冷的15毫升錐形離心管一一此步驟去除細(xì)胞核和未溶解的細(xì)胞 10. 放進(jìn)4C超速離心機(jī)離心10分鐘，速度為10000g 11小心

8、抽去上清液，保留沉淀顆粒一一此步驟獲得線粒體沉淀物 三、DNA萃取 1. 加入 微升破膜液(Reagent G)到線粒體顆粒樣品中 2. 渦旋震蕩15秒，混勻顆粒群 3. 轉(zhuǎn)入1.5毫升離心管 4. 置入冰槽中孵育15分鐘 5. 加入 微升 去干擾液(Reagent H) 6. 用200微升槍頭上下抽吸混勻 7. 放進(jìn)37C恒溫水槽孵育15分鐘 8 加入 微升酶解液(Reagent I) 9.渦旋震蕩15秒 10放進(jìn)58C恒溫水槽或干式恒溫儀孵育2小時(shí)(注意：可以孵育4至16小時(shí)，增加萃取產(chǎn)量) 11置于室溫下冷卻15分鐘，直至處于室溫狀態(tài)(或置于冰槽里15至30秒) 12. 加入 微升 萃取

9、液(Reagent J)(注意：使用前搖勻) 13 渦旋震蕩15秒 14.放進(jìn)微型臺(tái)式離心機(jī)離心 10分鐘，速度為16000g (或13000RPM，例如eppendorf 5415) 15移出上層液相溶液到新的1.5毫升離心管(注意：切莫觸碰液相交界面上的白色膜狀物) 16. 加入微升 濃縮液(Reagent K) 17. 加入微升助沉液(Reagent L) 18. 加入微升 沉淀液(Reagent M) 19在渦旋震蕩儀上震蕩 15秒，充分混勻 20.放進(jìn)微型臺(tái)式微型離心機(jī)離心15分鐘，速度為16000g (或13000RPM，例如eppendorf 5415)(注意: 離心前做好方位標(biāo)

10、記，以便離心后觀察管底沉淀顆粒) 21 小心抽掉上清液 22. 加入毫升純化液(Reagent N) 23. 放進(jìn)微型臺(tái)式離心機(jī)離心 5分鐘，速度為16000g (或13000RPM，例如eppendorf 5415) 24. 小心抽掉上清液 25. 空氣中晾干沉淀顆粒群 26. 加入微升緩沖液(Reagent O) 27溶解后放進(jìn)20C冰箱長(zhǎng)期保存或移出 2微升進(jìn)行PCR反應(yīng) 注意事項(xiàng) 1. 本產(chǎn)品為20次操作 2. 操作時(shí)，避免污染母液，尤其是 裂解液(Reagent C)和 保存液(Reagent F) 3. 線粒體操作均須在4 C或以下?tīng)顟B(tài)下進(jìn)行 4. 操作時(shí)，須戴手套 5. 建議使用

11、新鮮全血 6. 全血樣品采集建議使用EDTA血液抗凝液(HL12054.1 )、 ACD血液抗凝液(HL12054.2 )或肝 素鈉血液抗凝液(HL12054.3 ) 7. 試劑中的溶液使用前搖勻；酶解液(Reagent I)需放進(jìn)37C溫育少許；為避免反復(fù)凍融，建議適量 分裝 8 建議全血樣品和 血溶液(Reagent A)充分混勻，否則造成血紅細(xì)胞的不完全溶解 9. 建議全血樣品和 血溶液(Reagent A)孵育時(shí)間避免過(guò)長(zhǎng)，不宜超過(guò)5分鐘，以防白細(xì)胞損害 10. 每毫升全血平均可獲得 2.5 X 106白細(xì)胞 11通常勻化次數(shù)為 20至40下(或細(xì)胞顆粒群消失為止)達(dá)到80%的細(xì)胞裂解為理想狀態(tài)，但不同的細(xì) 胞類(lèi)型會(huì)存在差異。用戶可以通過(guò)顯微鏡觀察3微升勻漿物的細(xì)胞裂解程度：完整細(xì)胞呈現(xiàn)發(fā)亮的圓 環(huán)。低于50%可以增加勻化次數(shù) 12通常孵育5分鐘(不宜超過(guò)5分鐘)達(dá)到80%的細(xì)胞裂解為理想狀態(tài)， 但不同的細(xì)胞類(lèi)型會(huì)存在差異。 用戶可以通過(guò)顯微鏡觀察 3微升裂解物的細(xì)胞裂解程度：完整細(xì)胞呈現(xiàn)發(fā)亮的圓環(huán)。低于50%可以增 加孵育時(shí)間和渦旋震蕩次數(shù) 13. 可以通過(guò)增加線粒體溶解時(shí)間(30分鐘)和酶解時(shí)間(直至 16小時(shí))，獲