CCK8試驗原理與步驟

1、CCK8實驗 1、在96孔板中配置100|11的細(xì)胞懸液。將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng) 24 小時（37C，5% CO2）。 2、向培養(yǎng)板加入10）11不同濃度的待測物質(zhì)。 3、將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱孵育一段適當(dāng)?shù)臅r間（例如：6、12、24或48小 時）。 4、向每孔加入10|11 CCK8溶液（注意不要在孔中生成氣泡，它們會影響 OD值的讀數(shù)）。 5、將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1-4小時。 6、用酶標(biāo)儀測定在450nm處的吸光度。 7、若暫時不測定OD值，可以向每孔中加入101 0.1 M的HCL溶液或者 1%w/v SDS溶液，并遮蓋培養(yǎng)板避光保存在室溫條件下。24小時內(nèi)測定， 吸光度不會發(fā)生變化。 PS

2、 : 1%w/v SDS溶液配制方法： 組份濃度：10% （W/V） SDS配制量：100ml配制方法： 1. 稱量10g高純度的SDS置于100-200ml燒杯中，加入約80ml的去 離 子水，68C加入溶解 2. 滴加濃鹽酸調(diào)節(jié)pH值至7.2 3. 將溶液定容至100ml后，室溫保存。 注意：如果待測物質(zhì)有氧化性或還原性的話，可在加CCK8之前更換新鮮 培養(yǎng)基（除去培養(yǎng)基，并用培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞兩次，然后加入新的培養(yǎng)基）， 去掉藥物影響。當(dāng)然藥物影響比較小的情況下，可以不更換培養(yǎng)基，直接扣 除培養(yǎng)基中加入藥物后的空白吸收即可。活力計算： 細(xì)胞活力* （%） =A （加藥）-A（空白）/A（0加

3、藥）-A（空白）x 100 A （加藥）：具有細(xì)胞、CCK8溶液和藥物溶液的孔的吸光度 A （空白）：具有培養(yǎng)基和CCK8溶液而沒有細(xì)胞的孔的吸光度 A （0加藥）：具有細(xì)胞、CCK8溶液而沒有藥物溶液的孔的吸光度*細(xì)胞活 力：細(xì)胞增殖活力或細(xì)胞毒性活力 CCK-8可以用于細(xì)胞增殖和毒性分析。其基本原理為：該試劑中含有 WST-8，它在電子載體（1-Methoxy PMS）的作用下被細(xì)胞線粒體中的脫 氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚染料，生成的甲瓚物的數(shù)量與活細(xì)胞 的數(shù)量成正比，因此可以用這一特性直接進行細(xì)胞增殖和毒性分析。 其使用方法在增殖和毒性試驗中有所區(qū)別： 細(xì)胞增殖試驗： 1 接種細(xì)

4、胞懸液100微升于96孔板,預(yù)先置于37度,5%CO2飽和濕度 的 培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng) 2在每孔內(nèi)加入10微升的CCK-8試劑. 3把培養(yǎng)板放培養(yǎng)箱內(nèi)1-4小時（根據(jù)細(xì)胞類型其時間有所不同） 4在450nm波長處測定吸光值，參比波長為600nm或以上波長. 毒性分析試驗： 1 接種100微升細(xì)胞懸液（5000個/孔）于96孔板 2. 預(yù)先放置37度5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時 3. 加入10微升不同濃度的毒性物質(zhì)到孔內(nèi)培養(yǎng)基 4在培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48小時. 5.在每孔內(nèi)加入10微升CCK-8試劑，在培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)1-4小時;6在 450nm波長處測定吸光值，參比波長為600nm或以上以上步驟摘自

5、CCK-8的說明書，由于涉及到某些原因，我省去了上面的一些推銷用語） （內(nèi)有標(biāo)價，1245元/1000孔） 寫在前面：一直都像個新手，從未老道過。所有新手的迷茫與無奈我最能體 會?？吹綀@子里有一些同學(xué)在問有尖CCK8試驗的事情，當(dāng)初我也和他們 一樣，像個被蜘蛛絲纏住頭的迷茫蒼蠅一頭扎進園子里，期待能找到些解決 謎團的只言片語。希望我寫的這些非專業(yè)文字能夠幫助那些在實驗室里沒有 前行者指點迷津的筒子們。當(dāng)然仁者見仁智者見智，我寫的只是個人實驗 心得，僅供參考。歡迎大家拍磚共同進步。實驗是簡單的，道路是曲折的， 時間就是用來浪費的，科研就是自娛自樂使勁折騰。 我沒有做過MTT實驗，但其實原理及目的

6、都是一樣的（反應(yīng)機理不一 樣）。都說CCK8簡單點而且數(shù)據(jù)更穩(wěn)定，所以就用了這個試劑盒。 CCK8的說明書大家一定要認(rèn)真閱讀，里面很多細(xì)節(jié)的問題都有提到。而且 說明書里提供的一些尖于各種細(xì)胞的種板數(shù)都很有參考價值，因為那是反復(fù) 驗證過的最佳數(shù)值。但無論如何，做這個試驗一定 要摸條件。你就算再懶, 這個懶不得，否則你都只是在做無用功。以下言論全部以細(xì)胞毒性試驗為前 提，如果你做的是促進細(xì)胞生長的藥 物的藥效實驗?zāi)蔷土懋?dāng)別論了。 摸條件包括1、種板數(shù)；2、種板后細(xì)胞的貼壁生長時間；3、加藥后的孵 育時間；4、CCK8試劑加入量；5、CCK8試劑加入后細(xì)胞孵育時間。 看起來很多，其實這就是一個實驗。

7、而且都是種的空白板，也就是不加藥 物，只加細(xì)胞和CCK8。 1、種板數(shù)：這個要查文獻，看你所用細(xì)胞別人有無做過，把范圍大致找出。 記住還要參考說明書，這個很重要。然后稀釋一系列濃度種板。首先你要觀 察多長時間細(xì)胞可貼壁完全，一般貼壁生長24小時。然后還有在你的實驗 時間內(nèi)，不同細(xì)胞數(shù)下孔內(nèi)生長情況。比如我擬定考察4天的時間，那么 在4天內(nèi)，細(xì)胞是剛好鋪滿還是堆積生長？因為每塊板都會設(shè)置對照孔， 也就是含有細(xì)胞的培養(yǎng)基+CCK8，這個數(shù)值是板上的最大數(shù)值，CCK8試 驗最佳OD值在1.0附近，所以這 個最大數(shù)值最好能控制在1.0左右。我 的實驗經(jīng)驗是不要讓細(xì)胞長滿，一旦長滿了很難去判斷是否堆積生

8、長了，對 藥物能否順利進入細(xì)胞有影響此為其一，其二生長不均勻易導(dǎo)致孔間OD 值數(shù)據(jù)偏差大，而且OD值也很大。 2、貼壁生長的時間我一般就直接讓它貼壁長24h 了，這個時間細(xì)胞已經(jīng)貼 壁完全，而且這樣設(shè)置時間對自己安排實驗時間也方便。沒人愿意大半夜 爬起來做實驗吧。 3、加藥后的孵育時間，我的實驗摸了 3個時間，24h，48h，72h。然后 根據(jù)數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性（RSD）、OD值的范圍（1.0左右）這些來選擇最好 的時間。太長了就沒有必要了，細(xì)胞呆在孔里幾天不換液結(jié)果可 想而知 了。 4、CCK8試劑加入量，說明書中明確寫出建議加入量為培養(yǎng)基體積的 10%。這里有一個問題：假設(shè)我要孔內(nèi)是200微升的

9、體系，即細(xì)胞懸液+ 藥液+CCK8=200微升呢，還是細(xì)胞懸液+藥液=200微升，CCK8不算在體 系內(nèi)呢。尖于這一點文獻報道不一致。本人最終采用的是后者。 5、cck8試劑加入后孵育時間，隨著時間的增加，OD值就會增大?？傊?原則就是把OD值控制在1.0左右。這里我考察了 0.5h、1 .Oh、2.0h。 再說一下尖于種板設(shè)置問題。眾所周知周圍一圈孔因為邊緣效應(yīng)都是不用來 做實驗的。一般每組樣品我會設(shè)置6個復(fù)孔，得到的OD值去掉最大值與 最小值，其余取平均值。我用的是排槍，會省很多力氣， 但是也會增大組內(nèi)誤差。這個只有通過校正移液槍和選用最適槍頭了。 做這個實驗我想大家遇到的最大問題應(yīng)該是數(shù)

10、據(jù)不穩(wěn)定，組內(nèi)數(shù)據(jù)偏差大。 講了很多怎樣摸條件，其實就一個原則，把OD值控制在1.0左右。數(shù)據(jù)不 穩(wěn)定也只能通過增大樣品數(shù)，借助數(shù)據(jù)處理來彌補。還有實驗操作一定要仔 細(xì)小心，盡量平行操作。 能力有限，表達不清的大家湊合著看看吧。有疑問的歡迎大家留言討論， 我們的目標(biāo)是共同進步，哈哈。 補充：謝謝大家的熱烈討論。突然想起用酶標(biāo)儀檢測的時候還有一些細(xì)節(jié)問 題，園子里也有前輩提過。比如孔里不能有氣泡，如果有氣泡，就用吸耳 球吹掉，氣泡會很影響檢測結(jié)果。樣品板要擦拭干凈，當(dāng)然了，蓋子一定要 記得拿掉啊 補充說明：這幾天有同學(xué)提出了一個問題，這個問題非常好也非常尖鍵： 將OD值控制在1.0這個說法是否有依據(jù)?這里我還是想提醒大家一定要認(rèn) 真閱讀試劑盒的說明書，試想一個試劑盒的上市并且作為技術(shù)手段得到認(rèn)可 需要經(jīng)過多少試驗反復(fù)驗證。我購買的是同仁化學(xué)硏究所的CCK8試劑盒， 說明書的P7Q23 : OD值在什么范圍比較合適？答：一般情況下OD值在 0.1-2.0都可以，在1.0附近比較好。 再說到自己的實驗設(shè)計，酶標(biāo)儀的原理其實和紫外分光光度計是一樣的，所 以UV上很多減小誤差的注意事項在酶標(biāo)儀上同樣受用。這就能夠理解為 什么不能有氣泡，為什