2021生物制品中CHO細(xì)胞DNA殘留量的檢測

1、生物制品中CHO細(xì)胞DNA殘留量的檢測CHO細(xì)胞是生物制品生產(chǎn)中應(yīng)用較為廣泛的哺乳動物細(xì)胞之一1。理論上，存在于生物制品中的微量DNA雜質(zhì)，可能傳遞腫瘤或病毒相關(guān)的基因，并導(dǎo)致癌變或其他病理變化2-3。因此，宿主細(xì)胞DNA殘留量的控制是生物制品質(zhì)量控制中非常重要的環(huán)節(jié)。1997年，WHO第46屆生物制品標(biāo)準(zhǔn)化專家委員會（Expert Committee on Biological Standardiza-tion，ECBS）通過對傳代細(xì)胞殘余DNA風(fēng)險的再評估，將DNA視為細(xì)胞污染物。FDA規(guī)定，重組蛋白制品中殘余CHO細(xì)胞DNA接收標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)小于100pg劑量，對于大劑量的制品（如單克隆抗體），

2、DNA殘留量放寬到10ng劑量。但應(yīng)視制品的用途、用法和使用對象而決定可接受的限度4，特別是對于以康柏西普制品中細(xì)胞殘留量的檢測牛冬云，連煒，何靜，鄔智剛，柯瀟成都康弘生物科技有限公司，四川成都610036摘要：目的建立特異的CHO細(xì)胞DNA殘留量熒光定量PCR（Q-PCR）檢測方法。方法采用DNeasy Tissue Kit提取CHO細(xì)胞基因組DNA，制備DNA標(biāo)準(zhǔn)品；確定Q-PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立CHO細(xì)胞DNA 殘留量Q-PCR檢測方法，并驗證其專屬性、準(zhǔn)確性及精密性；用建立的方法對1003b02、1008b05、1012b09、1104b04、1108b13、11

3、12b24批康柏西普原液的CHO細(xì)胞DNA殘留量進(jìn)行檢測。結(jié)果建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線Ct值與模板DNA濃度的對數(shù)值之間呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.99以上；檢測HUVEC、HEK293細(xì)胞的DNA殘留量均無特異性擴(kuò)增曲線；檢測高、中、低濃度的DNA標(biāo)準(zhǔn)品（105、103、101pgml）的平均回收率均在Q-PCR方法可接受的回收率范圍（50%200%）內(nèi)，批間變異系數(shù)分別為9.3%、21.8%、26.8%；檢測100pgml濃度的DNA標(biāo)準(zhǔn)品的平均回收率為111.6%，變異系數(shù)為20.4%；康柏西普原液的DNA殘留量遠(yuǎn)低于100pg劑量。結(jié)論已成功建立特異的CHO細(xì)胞DNA殘留量Q-PCR檢測方法

4、，該方法專屬性好，準(zhǔn)確性及精密性高，可作為CHO宿主細(xì)胞DNA殘留量的常規(guī)檢測方法。關(guān)鍵詞：CHO細(xì)胞；DNA殘留量；熒光定量PCR中圖分類號：R392-33文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A文章編號：1004-5503（2021）07-1023-04Determination of residual CHO cell DNA in ConberceptNIU Dong-yun，LIAN Wei，HE Jing，WU Zhi-gang，KE XiaoChengdu Kanghong Biotechnology Co.Ltd，Chengdu610036，Sichuan Province，ChinaCorrespon

5、ding author:NIU Dong-yun，niudongyunAbstract：Objective To develop a specific fluorescent quantitative PCR（Q-PCR）method for determination of residual Chinese hamster ovary（CHO）cell DNA.Methods Genomic DNA of CHO cells was extracted by using DNeasy Tissue Kit and prepared into standard DNA.The reaction

6、 system and condition for Q-PCR were determined，and a standard curve was plotted，based on which a Q-PCR method for residual CHO cell DNA was developed and verified for specificity，accuracy and precision.The residual CHO cell DNA contents in six batches（Lot No.1003b02，1008b05，1012b09，1104b04，1108b13a

7、nd1112b24of bulks of Conbercept were determined by the developed method.Results The Ct value of established standard curve showed good linear relationship to the concentration of template DNA，with a correlation coefficient of more than0.99.No specific amplification curves for residual HUVEC and HEK2

8、93cell DNA were found.All the mean recovery rates of standard DNA at high（105pgml），moderate（103pgml）and low（101pgml）concentrations were within the acceptable range of Q-PCR（50%200%），with inter-CV values of9.3%，21.8%and26.8%respectively.The mean recovery rate of standard DNA at a concentration of100p

9、gml was111.6%，with a CVvalue of20.4%.The residual CHO cell DNA content in bulk of Conbercept was far less than100pgdose.ConclusionA specific Q-PCR method for determination residual CHO cell DNA content was successfully developed，which showedhigh specificity，accuracy and precision，and might be used a

10、s a routine method for residual CHO cell DNA content.Key words：CHO cells;Residual DNA content;Fluorescent quantitative PCR技術(shù)方法通訊作者：牛冬云，E-mail:niudongyunCHO細(xì)胞、Vero細(xì)胞等具有致瘤性的連續(xù)傳代細(xì)胞系生產(chǎn)的預(yù)防疫苗等制品，殘余外源DNA的質(zhì)量要求應(yīng)更加嚴(yán)格，如乙型肝炎疫苗DNA殘留量應(yīng)不超過10pg劑量。目前，國外對于宿主細(xì)胞DNA殘留量的檢測，一般采用定量PCR（quantitative PCR，Q-PCR）技術(shù)、SYBR green染料

11、法或探針標(biāo)記法5-9。國內(nèi)檢測一般采用中國藥典（三部）2021版附錄B“外源性DNA殘留量測定法”收錄的2種方法“DNA探針雜交法”和“熒光染色法”，前者操作繁雜，種屬特異性較差；后者測定對象為所有雙鏈DNA10-11。因此，為了對此類制品的宿主細(xì)胞DNA殘留量進(jìn)行更好的質(zhì)量控制，需要建立特異性的檢測方法。本文建立了殘余CHO細(xì)胞DNA檢測方法，并對該方法進(jìn)行了驗證。1材料與方法1.1細(xì)胞CHO細(xì)胞、人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）、人胚腎293細(xì)胞（human embryo kidney293cells，HEK

12、293）均由成都康弘生物科技有限公司提供。1.2供試品康柏西普眼用注射液原液由成都康弘生物科技有限公司提供，批號為：1003b02、1008b05、1012b09、1104b04、1108b13、1112b24、080303。1.3主要試劑及儀器DNeasy Tissue Kit、QIAquick PCR Purification Kit均購自德國QIAGEN公司；DNA Extractor Kit購自日本W(wǎng)AKO公司；SYBR Premix Ex Taq PCR反應(yīng)混合液購自日本TaKaRa公司；熒光定量PCR儀及分析軟件OPTICON為美國MJ research 公司產(chǎn)品。1.4DNA標(biāo)準(zhǔn)

13、品的制備采用DNeasy Tissue Kit 提取CHO細(xì)胞基因組DNA，經(jīng)EcoR酶切線性化，采用QIAquick PCR Purification Kit純化回收酶切片段，經(jīng)紫外分光光度計檢測A260和A280值，并計算純化產(chǎn)物的濃度和純度（A260A280值）。15l支分裝后，置-70保存，作為Q-PCR DNA標(biāo)準(zhǔn)品。1.5康柏西普原液中殘留DNA的提取取不同批號的康柏西普原液，加入適量的蛋白酶K消化，取100l 消化后的樣品，按DNA Extractor Kit說明書提取殘留的CHO細(xì)胞DNA。1.6Q-PCR方法的建立及標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制利用CHO細(xì)胞16sRNA的序列設(shè)計特異性引物

14、，引物序列如下：上游：5-CCAGGCATTGGTGGCAC-3；下游：5-AGACAGGGTTTCTCTGT-3。序列由日本TaKaRa 公司合成8，12。反應(yīng)體系中各成分的終濃度為：上、下游引物各200nmolL，1SYBR Premix Ex Taq，各加入模板DNA10l，反應(yīng)總體積為25l。反應(yīng)條件為：952min；951min，511min，721min，共45個循環(huán)。取用滅菌超純水稀釋至105pgml的DNA標(biāo)準(zhǔn)品10l，進(jìn)行10倍系列稀釋（104100pgml），以各濃度的DNA為模板進(jìn)行Q-PCR擴(kuò)增。利用OPTICON軟件分析實驗數(shù)據(jù)，以Ct值為橫坐標(biāo)，以模板DNA濃度的對

15、數(shù)值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性擬合，得出回歸方程。每個濃度作3個復(fù)孔，每個樣品作5個復(fù)孔。1.7方法的驗證1.7.1專屬性驗證采用DNeasy Tissue Kit提取HUVEC細(xì)胞及HEK293細(xì)胞DNA，進(jìn)行Q-PCR檢測，分析方法的專屬性。1.7.2準(zhǔn)確性及精密性驗證在080303批康柏西普原液中分別加入104、103、102、101和100pgml的DNA標(biāo)準(zhǔn)品，采用DNA Extractor Kit提取總DNA后，進(jìn)行Q-PCR檢測，并按下式計算加標(biāo)回收率（%），分析該方法的準(zhǔn)確性。加標(biāo)回收率（%）=（實際檢測值-藥品檢測值）加標(biāo)理論值100%分別配制高、中、低濃度的DNA樣品

16、（105、103、101、100pgml），進(jìn)行Q-PCR檢測，計算回收率和變異系數(shù)CV（%），分析該方法的準(zhǔn)確性和精密性?；厥章剩?）實測值理論值100%1.8方法的初步應(yīng)用用建立的Q-PCR方法對1003-b02、1008b05、1012b09、1104b04、1108b13、1112b24批康柏西普原液的CHO細(xì)胞DNA殘留量進(jìn)行檢測。2結(jié)果2.1DNA標(biāo)準(zhǔn)品的濃度和純度標(biāo)定后的DNA 濃度為2gml，純度為1.84。2.2Q-PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性回歸方程標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1，線性回歸方程為：y=a x+b，Ct值與模板DNA濃度的對數(shù)值之間呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.99以上。2.3方法

17、的驗證2.3.1專屬性以HUVEC、HEK293細(xì)胞DNA為模板的Q-PCR熒光信號與空白對照基本一致，無特異性擴(kuò)增曲線，見圖2。表明該方法的專屬性較好，可用于制品中CHO細(xì)胞DNA殘留量的檢測。2.3.2準(zhǔn)確性及精密性加標(biāo)回收率依次分別為104.3%、81.8%、82.0%、86.0%、148.0%，均在Q -PCR 法可接受的回收率范圍（50%200%）內(nèi)。見表1。105、103、101pg ml 濃度的DNA 標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行2次檢測，每次重復(fù)測定3次，平均回收率均在Q -PCR 法可接受的回收率范圍（50%200%）內(nèi)；批間CV 分別為9.3%、21.8%、26.8%。見表2。對100pg

18、ml 濃度的DNA 標(biāo)準(zhǔn)品重復(fù)檢測6次，平均回收率為111.6%，批內(nèi)CV 為20.4%，準(zhǔn)確性和精密性均符合要求，表明以此濃度作為該方法的定量下限是適合的。圖1Q -PCR 標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig 1.Standard curve of Q -PCR圖2Q -PCR 檢測CHO 細(xì)胞DNA 殘留量的專屬性Fig 2.Specificity of Q -PCR for determination of residual CHO cell DNA表1不同濃度DNA 標(biāo)準(zhǔn)品的回收率（%）Tab 1.Recovery rates （%）of standard DNA at various concen -t

19、rationsDNA 濃度（pg ml ）理論值提取后實測值10410433102.1104.3103817.623.181.810282.89.682.80.9971018.60.486.01001.480.5148.0表2不同濃度DNA 標(biāo)準(zhǔn)品的精密性Tab 2.Precision of Q -PCR method for standard DNA at various concentrations測定理論值實測值回收率批內(nèi)批間次數(shù)（pg ml）（pg ml ）（%）CV （%）CV （%）11051111500.000118.912.79.32136333.0003109000.0002

20、1114000.000121.07.42118000.0003131000.000110311263.470118.229.121.821478.1703803.98021938.800117.818.421237.00031357.0001101113.130108.935.726.8213.15036.4002110.202131.620.0214.060315.2301100 1.241111.620.42 1.28430.8294 1.3785 1.09760.8662.4方法的初步的應(yīng)用檢測結(jié)果顯示，康柏西普原液的DNA 殘留量遠(yuǎn)低于100pg 劑量，符合FDA 及中國藥典（三部）2

21、021版的相關(guān)要求。見表3。表3康柏西普原液中DNA 殘留量的檢測結(jié)果Tab 3.Determination of residual CHO cell DNA content in bulk of Conbercept1003b02 1.20.17314.31008b05 2.60.154 5.91012b09 1.30.25519.01104b04 1.40.074 5.11108b13 1.30.1239.61112b240.90.0364.23討論為了更好地控制產(chǎn)品的質(zhì)量，需要針對不同產(chǎn)品的特性，建立特異的質(zhì)量控制方法，并對其進(jìn)行全面的驗證。熒光強(qiáng)度值空白對照0.0500.0250.10

22、00.0750.0000.1250.1500.175Ct 值5 3025202110403545回收率R 2次數(shù)批號D N A 濃度的對數(shù)值0.00.51.01.52.02.53.03.54.05.55.04.53025202110Ct 值y -03012x +847r 2099916sRNA是微生物的核糖體RNA，在進(jìn)化過程中保持相對恒定的序列結(jié)構(gòu)。因此，常用于特異引物序列的設(shè)計，從而進(jìn)行微生物的種屬鑒定。本研究利用CHO細(xì)胞16sRNA的特異性引物，通過SYBR Green染料Q-PCR法，根據(jù)熒光信號的強(qiáng)度確定PCR 體系中存在的雙鏈DNA數(shù)量8，13。Q-PCR方法尚無統(tǒng)一的驗證接受標(biāo)

23、準(zhǔn)，本文參考文獻(xiàn)9，PCR產(chǎn)物的量呈2n增長，每增加1個循環(huán)，產(chǎn)物量即在原有基礎(chǔ)上增加1倍，因此計算回收率時不能按照線性增長的模式，以理論值X%進(jìn)行評價，而應(yīng)按照理論值2x倍進(jìn)行評價，通常最大可接受回收率設(shè)定在理論值21倍，即1個循環(huán)（50%200%）。宿主細(xì)胞DNA屬于微量雜質(zhì)，測定時受干擾因素較多，很難實現(xiàn)靈敏、準(zhǔn)確、快速的檢測。常用的地高辛標(biāo)記的探針雜交法步驟比較繁瑣，且不能實現(xiàn)定量分析；DNA熒光染色法能夠靈敏、快速地進(jìn)行準(zhǔn)確定量，但熒光染料Picogreen能與所有的雙鏈DNA結(jié)合，對于核酸類基因治療制品，如溶瘤腺病毒、核酸疫苗類制品等使用存在一定的局限性。本文所建立的CHO細(xì)胞DN

24、A殘留量檢測方法，經(jīng)過驗證后，殘余DNA的回收率及方法的線性、準(zhǔn)確性、精密度均符合要求，檢測下限達(dá)到1pgml，可有效用于以CHO細(xì)胞為表達(dá)系統(tǒng)的生物制品中宿主細(xì)胞DNA殘留量的特異性檢測，為保證產(chǎn)品的質(zhì)量可控奠定了基礎(chǔ)。而且由于本文所使用的DNA標(biāo)準(zhǔn)品較易制備，適合由國家建立統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)品，可減少不同廠家自己制備造成的差異。確保制品中殘余DNA在抽提過程中能被有效地提取，是采用Q-PCR對其進(jìn)行準(zhǔn)確定量的前提。本文所采用的DNA提取試劑盒，是美國藥典USP32推薦的一種商業(yè)化微量DNA提取試劑盒。其利用載體分子糖原、離液劑碘化鈉和表面活性劑N-月桂酰肌氨酸鈉來破壞DNA和樣品的結(jié)合，提取效率較好

25、13-14。采用本實驗建立的方法檢測6批康柏西普原液的DNA殘留量，結(jié)果均遠(yuǎn)低于100pg劑量，符合相關(guān)法規(guī)的要求。綜上所述，本文建立的檢測方法，可作為CHO細(xì)胞DNA殘留量的常規(guī)檢測方法。參考文獻(xiàn)1Jayapal KP,Wlaschin KF,Hu WS,et al.Recombinant protein therapeutics from CHO cells-20years and countingOLCHOConsortium:SBE Special Edition,2021:40-47.2Yang H,Zhang L,Galinski M.A probabilistic model f

26、or risk assessment of residual host cell DNA in biological productsJ.Vaccine,2021,28（19）:3308-3311.3Sheng-Fowler L,Lewis AM Jr,Peden K.Issues associated with residual cell-substrate DNA in viral vaccinesJ.Biologicals,2021,37（3）:190-195.4FDA.Points to consider in the manufacture and testing of monocl

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