敲除小鼠常見問題與回答

1、敲除小鼠常見問題與回答一、什么是 ES 細(xì)胞顯微注射？ 答：胚胎干細(xì)胞顯微注射是制作基因敲除小鼠的一個(gè)最常用的方法。 主要過程是將攜帶目的 基因的胚胎干細(xì)胞注射到小鼠的囊胚腔中獲得嵌合體小鼠。 所得嵌合體小鼠的組織， 將同時(shí) 含有來源于囊胚的細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞。 嵌合體小鼠必須和野生型小鼠配種以決定遺傳改變的 生殖系能否傳遞， 這樣可能獲得轉(zhuǎn)基因或打靶基因 （來源于胚胎干細(xì)胞） 穩(wěn)定的生殖系傳遞 的小鼠。一般情況下，大約能獲得50%繼承了目的基因的后代。二、嵌合體遺傳學(xué)上用以指不同遺傳性狀嵌合或混雜表現(xiàn)的個(gè)體。 免疫學(xué)上的涵義則指一個(gè)機(jī)體身上有 兩種或兩種以上染色體組成不同的細(xì)胞系同時(shí)存在 ,彼

2、此能夠耐受 , 不產(chǎn)生排斥反應(yīng) ,相互間 處在嵌合狀態(tài)。 在基因敲除鼠中指通過向囊胚注射被外源基因轉(zhuǎn)化了的胚胎干細(xì)胞，使得發(fā)育成為的個(gè)體中含有不同基因型的細(xì)胞， 產(chǎn)生的個(gè)體也叫嵌合體， 即該生物體中嵌合了兩種 不同遺傳結(jié)構(gòu)的細(xì)胞（一種是基因型被改變了的細(xì)胞，另一種是原來的基因型的細(xì)胞） 。三、條件性敲除的原理？答：Cre-LoxP系統(tǒng)是源于P1噬菌體的一個(gè) DNA重組體系，由Cre酶和相應(yīng)的LoxP位點(diǎn)組成， 它能導(dǎo)致重組發(fā)生在特定的DNA序列處（LoxP位點(diǎn)）,該系統(tǒng)可以將外源基因定點(diǎn)整合到染色體上或?qū)⑻囟―NA片段刪除?；?Cre-LoxP的基因打靶要分兩步來進(jìn)行。首先要在胚胎干 細(xì)胞的

3、基因組中引入 LoxP 序列，這一步可以通過打靶載體的設(shè)計(jì)和對同源重組子的篩選來 實(shí)現(xiàn)。下一步通過 Cre 介導(dǎo)的重組來實(shí)現(xiàn)靶基因的遺傳修飾或改變。 Cre-LoxP 系統(tǒng)既可以 在細(xì)胞水平上用 Cre重組酶表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染中靶細(xì)胞，通過識別LoxP位點(diǎn)將抗性標(biāo)記基因切除，又可以在個(gè)體水平上將重組雜合子小鼠與 Cre 轉(zhuǎn)基因小鼠雜交， 篩選子代小鼠就可得到 刪除外源標(biāo)記基因的條件性敲除小鼠。四、如何鑒定和挑選嵌合體？答：動(dòng)物只有部分組織細(xì)胞整合有外源基因， 則稱為嵌合體動(dòng)物。 它的鑒定主要根據(jù)毛色去 鑒定。注射的ES和囊胚來源不同的小鼠品系。它們的毛色不同。因此可以根據(jù)毛色的嵌合 率來鑒定和挑選嵌

4、合體。五、ROSA26與定點(diǎn)插入？答：利用同源重組技術(shù)，把外面的cDNA片段或者其他 DNA片段，定點(diǎn)插入到 ROSA26位置。ROSA26是一個(gè)安全區(qū)域，外源性的基因定點(diǎn)插入這個(gè)位點(diǎn)不會影響其他基因的表達(dá)。10、何謂 Flox 小鼠？所謂 Flox 小鼠是指在某個(gè)基因的某個(gè)外顯子兩側(cè)各放一個(gè)LoxP 序列。這段序列就是Flankedby LoxP，也就叫做Flox小鼠。這種Flox小鼠一般要通過設(shè)計(jì)構(gòu)建打靶載體、胚胎干細(xì)胞重組、囊胚顯微注射、和嵌合體小鼠傳代來獲得。11、 條件性敲除設(shè)計(jì)中，為什么在抗性基因的兩側(cè)設(shè)計(jì)的是Frt-Flip 重組系統(tǒng)，而敲除目 的基因用的是 Cre-Loxp 重

5、組系統(tǒng)？ 在設(shè)計(jì)中，其中的一個(gè)系統(tǒng)是為了把抗性基因去掉。另一個(gè)系統(tǒng)是為了把目的基因去掉。Frt-Flip 系統(tǒng)或 Cre-Loxp 系統(tǒng)都可以用來放在抗性基因或是目的基因外顯子的兩側(cè)。理論上是沒有區(qū)別的。只所以“在抗性基因的兩側(cè)設(shè)計(jì)的是 Frt-Flip 重組系統(tǒng)，而敲除目的基 因用的是 Cre-Loxp 重組系統(tǒng)”，主要有以下幾個(gè)原因：1）工具鼠： Cre-LoxP 系統(tǒng)已經(jīng)用了將近 20 年了，科學(xué)家研發(fā)了很多的 Cre 工具鼠。其實(shí) 目前絕大部分工具鼠都是 Cre工具鼠?，F(xiàn)在大家做一個(gè) Flox（Flanked By LoxP）小鼠花費(fèi) 很多的時(shí)間和金錢，都會希望自己的小鼠與更多的工具鼠

6、交配，得到更多的結(jié)果。2）Flip 酶的活性比較低。 Flip 酶是從酵母中分離出來的。 其最適溫度是 30 度，而小鼠的 體溫是 37 度。盡管現(xiàn)在有些實(shí)驗(yàn)室對 Flip 的 37 度適應(yīng)性做了優(yōu)化，但應(yīng)該還是沒有 Cre 的活性好。 把 Frt 放在抗性基因的兩側(cè)， 得到小鼠之后， 跟 Flip Deleter 小鼠交配， 篩選 出去掉了抗性基因的小鼠，就是 Flox 小鼠了。即使 Flip 的活性不高，也可以得到 Flox 小 鼠。這些 Flox 小鼠可以跟各種 Cre 工具鼠交配， 得到條件性敲除小鼠。 反過來， 如果用 Cre 來去掉抗性基因，得到的是 Frt 小鼠。這種情況下，一是

7、可用的工具鼠很少，二是即使有， 效率也可能不高。如果看 5、6年前的文章， 大家其實(shí)是把 Loxp 不僅放在要敲除基因的兩側(cè)， 也用來敲除抗性 基因（NeoR）。那個(gè)時(shí)候篩選起來特別麻煩。因?yàn)橐龃罅康暮Y選，篩出只敲掉抗性基因，而沒有敲掉目的基因的 Flox 小鼠。需要很多的時(shí)間和精力。12、怎樣用最簡單的描述區(qū)分基因敲除、基因敲進(jìn)、基因敲降、和轉(zhuǎn)基因1）基因敲除（Knockout） ：把一個(gè)基因從基因組里面全部或部分拿掉；2） 條件性基因敲除 （ConditionalKO）: 把一個(gè)基因從特定細(xì)胞的基因組里面全部或部分 拿掉；3） 基因敲進(jìn)（Knockin）:在基因組里放一個(gè)外源基因 （如G

8、FP, LacZ, TdTomato等）；4） 基因敲降（Knock-down）: 通過降解mRNA勺方法降低蛋白的表達(dá)水平（一般是用microRNA 或 siRNA）。5）轉(zhuǎn)基因: 在體內(nèi)過表達(dá)一個(gè)特定基因， 就象在細(xì)胞系里用高水平表達(dá)載體表達(dá)一個(gè)蛋白。13、嵌合鼠的嵌合率很高，但是得不到雜合子是什么原因？高嵌合率不代表種系傳遞就好。 許多實(shí)驗(yàn)室， 包括我們公司， 都發(fā)現(xiàn)特別高嵌合率的嵌合體 小鼠不能交配產(chǎn)仔。原因不是很清楚 , 這應(yīng)該跟打靶的基因是不是性染色體沒有關(guān)系?？梢?檢查一下嵌合體小鼠是不是有隱睪的現(xiàn)象。 另外，毛色看到的嵌合率與生殖細(xì)胞的嵌合率不 一定完全一致。也有人認(rèn)為雄性ES

9、細(xì)胞注射到雌性囊胚使得胚胎發(fā)育過程中性別轉(zhuǎn)化不完全，造成的所謂不男不女現(xiàn)象?，F(xiàn)在好像還沒有一個(gè)定論知道到底是什么原因。14、ROSA26位點(diǎn)插入外源基因的設(shè)計(jì)原理是什么？Rosa26位點(diǎn)基因敲入，在原來的設(shè)計(jì)中，目的基因cDNA上游帶有一段轉(zhuǎn)錄終止序列“ Stop ”（3個(gè)拷貝的SV40多聚A序列，tPA）,轉(zhuǎn)錄終止序列的兩端各有一個(gè)Loxp位點(diǎn)，將此結(jié)構(gòu)定點(diǎn)嵌入Rosa26基因位置，整個(gè)結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄受Rosa26啟動(dòng)子控制。在沒有 Cre的情況下，由于Rosa26啟動(dòng)子與目的基因之間“ STOP的存在，目的基因不能被表達(dá)。如果有 Cre表 達(dá)， Cre重組酶將去除“ STOP , Rosa26

10、啟動(dòng)子就可以啟動(dòng)目的基因表達(dá)。但是，由于Rosa26 啟動(dòng)子是一個(gè)弱啟動(dòng)子，其啟動(dòng)能力有限，目的基因經(jīng)常達(dá)不到研究人員需要的表 達(dá)水平。為了解決這一問題，可以對原Rosa26基因敲入系統(tǒng)做改進(jìn)，引入了一個(gè)強(qiáng)效的啟動(dòng)子，如CAG啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子由雞actin啟動(dòng)子和CMV增強(qiáng)子融合而成，用這一雜合啟 動(dòng)子代替 Rosa26 啟動(dòng)子，從而高效地啟動(dòng)目的基因表達(dá)。15、 在做條件性基因敲除小鼠模型的設(shè)計(jì)時(shí)，為什么不能從exon1 敲除？條件性基因敲除小鼠模型的設(shè)計(jì)，不能從 exon1 開始敲除，原因是 loxp site 最好不要 插入到啟動(dòng)子區(qū)域，因?yàn)楹茈y預(yù)測啟動(dòng)子和所有調(diào)控元件的位置，loxp

11、的插入很有可能會因?yàn)槠茐牧藛?dòng)子或調(diào)節(jié)原件而影響野生型蛋白的表達(dá)，所以條件性敲除設(shè)計(jì)中， 一般都不會從 exon1 開始敲除。16、目前基因沉默小鼠模型存在的缺陷有哪些？1）目前用于基因沉默的技術(shù)方法主要是siRNA。對于一個(gè)待敲除的候選基因，需要設(shè)計(jì)多個(gè)siRNA，并對每一個(gè)siRNA進(jìn)行驗(yàn)證（一般利用細(xì)胞系），這就造成篩選具有干擾作用 siRNA的選擇難度相當(dāng)大。2）一般情況下， RNAi 對于基因的抑制不會很完全。在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，我們一般只是觀察1-5天，以驗(yàn)證siRNA的抑制功能。而在小鼠體內(nèi)，siRNA盡管可以降低 mRNA的水平，從而影響蛋白的表達(dá)， 但并不一定影響基因的功能。

12、一是蛋白表達(dá)水平雖然達(dá)不到正常水平， 但可能同樣發(fā)揮完整的功能； 二是蛋白表達(dá)水平降低會導(dǎo)致蛋白降解速度降低， 從而使蛋白 的整體水平得到補(bǔ)償。所以，除非非常運(yùn)氣，siRNA轉(zhuǎn)基因一般很難得到比較肯定的結(jié)果。如果不能完全阻斷基因的表達(dá)，利用siRNA進(jìn)行基因敲降時(shí)沉默掉的基因仍保留一定的表達(dá) 信號，可能會得到無法解釋的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。除非是為了研究siRNA,或miRNA在體內(nèi)的功能（而不是研究siRNA/miRNA所對應(yīng)的候選基因），一般我們不建議利用 siRNA法進(jìn)行基因敲除的 設(shè)計(jì)。在這種情況下， 我們通常會建議客戶做基因敲除來達(dá)到目標(biāo)基因缺失其原始蛋白功能 的目的。17、為什么來源于 129

13、背景的小鼠胚胎干細(xì)胞的模式小鼠一定要在 C57BL/6 背景的小鼠上 進(jìn)行回交？1） 發(fā)明小鼠基因敲除技術(shù)以來，傳統(tǒng)上一直用129 遺傳背景的小鼠胚胎干細(xì)胞進(jìn)行基因打靶制備模式小鼠， 然后在 C57BL/6 等近交系小鼠上回交 （ back-cross） 超過 10代， 才能進(jìn)行 諸如免疫學(xué)、癌癥、 神經(jīng)學(xué)等絕大部分生物醫(yī)學(xué)研究?；亟恢辽傩枰? 年多的時(shí)間，給科研工作者在時(shí)間上、金錢上造成很大損失。比如生物實(shí)驗(yàn)經(jīng)常進(jìn)行諸如細(xì)胞器官移植等實(shí)驗(yàn)，我們從動(dòng)物供應(yīng)商得到的小鼠多數(shù)是C57BL/6或Balb/C等純系小鼠，而很少供應(yīng)大量129小鼠以進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。如果由129品系ES細(xì)胞制備的模式小鼠在 C5

14、6BL/6品系上回交的代次不夠，就會帶有很多 129 小鼠抗原。 將其細(xì)胞等移植到 C57BL/6 或其他近交系小鼠后， 受體鼠 會由于自身免疫排斥的原因，將轉(zhuǎn)移的細(xì)胞殺死或產(chǎn)生耐受現(xiàn)象。2） 由于129品系小鼠遺傳背景復(fù)雜，得到的模式小鼠需在 C57BL/6等近交系小鼠上做回交，并且回交次數(shù)不同也會造成實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性差。 這對開發(fā)制作標(biāo)準(zhǔn)模式動(dòng)物是一個(gè)很大的難 題，對生物科研、醫(yī)藥企業(yè)、安評中心、藥檢部門等，也是一個(gè)很大的缺憾。所以如果能夠 直接用C57BL/6 ES細(xì)胞進(jìn)行基因打靶，就將直接獲得C57BL/6品系的模式小鼠，保證了模式小鼠的穩(wěn)定性，極大的提高了制作速度縮短了科研周期。18、

15、 既然 129背景的模式小鼠不能直接用于多數(shù)實(shí)驗(yàn)科學(xué)研究，為什么目前仍有科研機(jī)構(gòu)利 用 129背景的小鼠胚胎干細(xì)胞制備模式小鼠？目前常用的129品系ES細(xì)胞的優(yōu)點(diǎn)是它們比較皮實(shí)容易操作。與其相對應(yīng)能夠用于基因打 靶的C57BL/6遺傳背景的ES細(xì)胞品系目前世界上少之又少也很難得到，C57BL/6 ES cell比較嬌嫩， 比如支原體污染就容易造成沒有種系傳遞。 現(xiàn)今國外做 129遺傳背景模式小鼠一 般在 35000 美元，而用 C57BL/6 ES 細(xì)胞研發(fā)模式小鼠，價(jià)格一般在5000080000 美元之間。但在增加科研競爭力和省去了回交時(shí)間等多方面來考慮，制備C57BL/6敲除小鼠還是值得的

16、。19、KO First 技術(shù)流程KO-First技術(shù)是通過在內(nèi)含子中插入一個(gè)兩邊帶有FRT位點(diǎn)的基因破壞盒來達(dá)到敲除的目的，這個(gè)破壞盒含有 Splice acceptor （SA）（SA 發(fā)揮剪接作用后，會將基因序列剪接，相應(yīng) 的片段就會被K0,所以叫KOFirst），報(bào)告基因和Nea除此之外，在目的基因敲除的外顯子兩側(cè)各插入兩個(gè) LoxP 位點(diǎn)。因此得到的小鼠是目的基因敲除同時(shí)敲入報(bào)告基因與抗 性基 因的小鼠。通過靈活選擇 Cre/LoxP 重組系統(tǒng)或者 Flp/FRT 重組系統(tǒng)，可達(dá)到同時(shí)獲得完全 性敲除和條件性敲除的實(shí)驗(yàn)?zāi)康?。即?dāng)該小鼠與表達(dá) Cre 的小鼠交配時(shí)，可獲得目的基因 敲除

17、同時(shí)敲進(jìn)報(bào)告基因的小鼠； 當(dāng)該小鼠與 Flp 小鼠交配時(shí)， 可還原已敲除基因的表達(dá)， 獲 得基因條件性敲除小鼠，在此基 礎(chǔ)上 Cre 小鼠交配又可獲得目的基因敲除小鼠。參考：畢業(yè)生租房補(bǔ)貼每月補(bǔ)貼 600 元上月底，南京市公布于 7 月 1 日起實(shí)施南京市公共租賃住房貨幣化保障政策， 大 學(xué)畢業(yè)在寧租房每月至少補(bǔ)貼 600 元。昨天，南京市人社局在官網(wǎng)公布了 南京市發(fā)放高校畢業(yè)生住房租賃補(bǔ)貼實(shí)施辦 法，符合條件的大學(xué)生可以申請租房補(bǔ)貼了。值得注意的是，申請時(shí)畢業(yè)生需 提供只含本人姓名的租房發(fā)票。符合三個(gè)條件可拿租房補(bǔ)貼 王小姐一年前畢業(yè)，在南京一家單位上班，每月需要負(fù)擔(dān)房租 1000 元，她一

18、直 殷殷期盼的租房補(bǔ)貼細(xì)則昨天出臺。 記者看到，高校畢業(yè)生申請租房補(bǔ)貼的需要 同時(shí)具備三個(gè)基本條件： 全日制普通高校 （含海外留學(xué)人員） 取得學(xué)士及以上學(xué) 位或在全日制技工院校取得技師職業(yè)資格證書的畢業(yè)生； 畢業(yè) 2 年內(nèi)在南京納 稅的各類企業(yè)或民辦非企業(yè)單位、 社會團(tuán)體等單位就業(yè)且簽訂 1 年及以上期限勞 動(dòng)合同，或在寧自主創(chuàng)業(yè)， 繳納企業(yè)職工養(yǎng)老保險(xiǎn)； 具有本市戶籍且住房困難 或者非本市戶籍在寧無自有住房，且租房居住的。補(bǔ)貼標(biāo)準(zhǔn)是博士每人每月 1000 元、碩士每人每月 800 元、學(xué)士和技師每人每月 600 元。實(shí)際租金低于補(bǔ)貼標(biāo)準(zhǔn)的，按實(shí)際租金補(bǔ)貼。補(bǔ)貼期限累計(jì)不超過 24 個(gè)月，按月補(bǔ)助、按季發(fā)放。配偶父母有 2 套房不能拿補(bǔ)貼記者了解到， 從昨天開始，符合條件的高校畢業(yè)生就可以向人社部門提出申請租 房補(bǔ)貼。相關(guān)部門會對每個(gè)申報(bào)人進(jìn)行嚴(yán)格審核。據(jù)了解，人社部門會對申請人身份及簽訂勞動(dòng)合同、 繳納社會保險(xiǎn)等情況進(jìn)行初 審。初審后，區(qū)稅務(wù)部門負(fù)責(zé)核查企業(yè)納稅的情況，區(qū)公安部門負(fù)責(zé)核查戶籍、 居住信息，區(qū)住房保障部門負(fù)責(zé)核查房產(chǎn)情況，這三個(gè)部門將于每季度首月 10 日前將上季度符合條件的人員名單報(bào)市人社部門，不符合條件的反饋本人。其中，對非本市戶籍在寧無自有住房的認(rèn)定是， 申請人本人、 配偶及未成年子女 在寧名下無房， 認(rèn)定的住房包括私房和依合同尚未交付的房屋。 申請人父母或