免疫組織化學(xué)步驟詳解

1、免疫組織化學(xué)技術(shù)取材將小鼠麻醉，打開胸腔充分暴露心臟，在心尖處剪一個小口，將注射器針 頭經(jīng)小口送入左心室并插至升主動脈起始部，用線將針頭固定，剪破右心耳， 灌注50ml生理鹽水。隨后緩緩注入150ml4%多聚甲醛(pH7.4),固定1h后將腦取出，浸于4%的多聚甲醛中放入4C冰箱內(nèi)固定 12h,然后轉(zhuǎn)入30%的蔗糖溶液中浸泡48h。石蠟包埋1取出皮層及海馬，流水沖洗24h，用梯度濃度的酒精進(jìn)行脫水，酒精濃度 梯度為70%酒精80%酒精90%酉精，各30min, 95%酒精I(xiàn) 95%酒精I(xiàn)I，各 20min, 100%酒精 I 100%酉精 I ,各 15min。2取出皮層及海馬，浸入到二甲苯中

2、透明，1h X2次。3. 取出皮層及海馬,浸入到二甲苯與石蠟 1:1 混合液中,浸泡 1 小時。4取出皮層及海馬，浸入到石蠟中，浸泡1小時X2次。5在石蠟包埋機(jī)上進(jìn)行組織包埋，冷卻后保存在4 C冰箱中備用。切片將組織用石蠟切片及進(jìn)行切片，切片厚度為2 am。連續(xù)切片5次，取1張切片，水浴鍋展片后貼附在多聚賴氨酸包被的載玻片上。每個組織取 5張切 片。所有切片在烤箱中60C烤片2h。脫蠟及水化 (48min)1. 切片在二甲苯中脫蠟10min x次。2切片在梯度濃度酒精中水化，酒精梯度濃度為100%酒精I(xiàn) 100%酉精I(xiàn) 95%!精 I 95%!精 I，各 5min，90%酒精80%!精，各 3

3、min，70%酒 精， 2min。3.最后蒸餾水中浸泡 1min。滅活內(nèi)源性的過氧化物酶 (40min)1. 用0.01M PBS沖洗3次，每次5min2. 滴加 3%H2O2(先用現(xiàn)配)到切片上，孵育 10分鐘。3. 切片用0.01M PBS洗 5 分鐘 X3次?？乖迯?fù) (70min)1將事先配制好的抗原修復(fù)液在水浴鍋中加熱到95C。2 .將切片浸入到0.01M 的檸檬酸鹽緩沖液( pH6.0)修復(fù)液中，進(jìn)行抗原修復(fù) 15分鐘。3 .修復(fù)后，取出切片，室溫下冷卻復(fù)溫 40分鐘。4. 切片用0.01M PBS洗 5 分鐘 X3次。膜打孔 (25min)1. 滴加10 分鐘0.3% Trit

4、on X-100曲拉通，現(xiàn)用現(xiàn)配)到組織片上，室溫下孵育2. 切片用0.01M PBS洗5分鐘X3次。封閉 (20min)1.滴加10% BSA至組織片，室溫下孵育 20分鐘。2傾去BSA勿洗。免疫反應(yīng)1. 滴加一抗至組織片上。用于 DAB顯色的組織片一抗?jié)舛葹?:500,用于免 疫熒光的組織片一抗?jié)舛葹?1:2000。2. 組織片4C孵育過夜。3. 第二天取出組織片,室溫下復(fù)溫 1h。4. 組織片用0.01M PBS洗 5min X 次。5. 滴加二抗，用于DAB顯色的組織片滴加山羊抗兔辣根過氧化物酶標(biāo)記的 二抗,濃度為0.4:250;用于免疫熒光的組織片滴加山羊抗兔FITC標(biāo)記的二抗，濃度

5、為1:150。6. 滴加二抗后,酶標(biāo)組織片室溫下孵育一個小時,用0.01M PBS洗5分鐘X3次，進(jìn)行后續(xù)實驗步驟。FITC標(biāo)記組織片室溫下孵 育 30 分鐘,緩沖甘油封片,鏡檢。顯色滴加DAB顯色液，光鏡下顯色，待顏色滿意后，自來水沖洗終止顯色，沖 洗時間 5min。xx 素復(fù)染組織片浸入蘇木素染液染色2min，自來水沖洗1mi n,取出后1%鹽酸酒精分化10s,自來水沖洗2min,氨水返藍(lán)15s,雙蒸水沖洗1min。封片將切片依次浸入70%、80%和90%的梯度酒精中各2min,隨后浸入2次 95%的酒精和2次無水乙醇中各3min。接著浸2次二甲苯，每次5min。最后用 樹膠封片。普通：在

6、載玻片組織上滴一滴封片液,然后使蓋玻片傾斜,一側(cè)先接觸液體,緩 慢蓋在組織上,避免其產(chǎn)生氣泡。用熒光封片劑封片,不能滴太多,放蓋玻片的時候避免氣泡,尤其組織周 圍。然后用中性樹膠滴蓋玻片的四角,少滴。 30min 后放錫紙盒中,冰箱四度 保存。免疫組織化學(xué)配方0.1M PBS：NaH2PO42H2O15.5g, Na2HPO412H2O 6g NaCl87.75g,雙蒸水溶解后調(diào)pH至7.2，用雙蒸水定容至 1L。0.01M PBS：用雙蒸水將0.1M PBS稀釋 10 倍。4%多聚甲醛磷酸緩沖液： 40g 多聚甲醛和 500ml0.1M PBS混勻后加熱至60C，攪拌并滴加1N NaOH至溶液清晰為止，冷卻 后用0.1M PBS 定容至 1000ml。3%H2O2 30%H2O2 100 與0.01M PBS 900混勻?，F(xiàn)用現(xiàn)配。Tris-EDTA抗原修復(fù)液：將Tris堿1.21g，EDTA0.37g 溶于雙蒸水，調(diào) pH 至9.0,加入吐溫-20 500從雙蒸水定容至1000ml。10%BSA 10g BSA溶 于 100ml0.01M PBSxx。0.3%TritonX-100xx:TritonX-1003 同0.01MPBS997混勻?，F(xiàn)用現(xiàn)配。鹽酸酒精： 1ml 鹽酸同 99ml 75%的酒精混勻?？乖迯?fù)液（檸檬酸鈉緩沖