實(shí)驗(yàn)十一細(xì)菌質(zhì)粒DNA的提取和純化

1、實(shí)驗(yàn)一細(xì)菌質(zhì)粒DNA的提取和純化一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模和ㄟ^細(xì)菌質(zhì)粒DNA的提取，掌握共價閉合環(huán)狀DNA的提取方法。二、實(shí)驗(yàn)原理：1、細(xì)菌中有兩種DNA即染色體DNA和質(zhì)粒DNA2、 質(zhì)粒DNA的提取方法有三種：堿裂解法、煮沸法和去污劑（如Trit on 和SDS裂解法。3、 堿裂解法比較劇烈，可破壞堿基配對，使宿主細(xì)胞 DNA變性，共價閉合 環(huán)狀DNA由于空間纏繞，兩條鏈不會徹底分開。當(dāng)外界條件到達(dá)復(fù)性條件時，質(zhì) 粒DNA勺雙鏈又迅速恢復(fù)原狀，而較大的線性染色體 DNA隹以復(fù)性。當(dāng)菌體在NaOH和 SDS溶液中裂解時，蛋白質(zhì)與 DNA發(fā)生變性，當(dāng)加入中和 液后，質(zhì)粒DNA分子能夠迅速復(fù)性，呈溶解狀態(tài)，

2、離心時留在上清中；蛋白質(zhì)與 染色體DNA不變性而呈絮狀，離心時可沉淀下來。純化質(zhì)粒DNA的方法通常是利用了質(zhì)粒 DNA相對較小及共價閉環(huán)兩個性質(zhì)。 例如，氯化銫-溴化乙錠梯度平衡離心、離子交換層析、凝膠過濾層析、聚乙二 醇分級沉淀等方法，但這些方法相對昂貴或費(fèi)時。對于小量制備的質(zhì)粒DNA經(jīng)過苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等簡單步驟去除殘余蛋白質(zhì)和RNA所得純化的質(zhì)粒DNA已可滿足細(xì)菌轉(zhuǎn)化、DNA片段的分離和酶切、常規(guī)亞克隆及 探針標(biāo)記等要求，故在實(shí)驗(yàn)室中常用。三、實(shí)驗(yàn)材料：含有PMD19質(zhì)粒的大腸桿菌（E. coli.）菌液四、實(shí)驗(yàn)用具和藥品：實(shí)驗(yàn)用具：搖床、離心機(jī)、移液器及槍頭、玻璃

3、試管（15mL及塞子、離心 管（1.5mL）。實(shí)驗(yàn)藥品：溶液1（高壓滅菌）：50 mmol/L葡萄糖25 mmol/L Tris.Cl （pH8.010 mmol/L EDTA （pH8.0溶液U （現(xiàn)用現(xiàn)配）：2 mol/L NaOH10% SDS（十二烷基硫酸鈉）NaOH : SDS: ddHO=1:1:8溶液川：5 mol/L乙酸鉀60mL冰乙酸11.5mL水28.5mL五、實(shí)驗(yàn)步驟：（一）細(xì)菌繁殖第1天晚上：吸取含質(zhì)粒的菌液2卩L,轉(zhuǎn)移入2mLLB （加入相應(yīng)抗生素）， 37C,過夜振蕩（200r/min 培養(yǎng)。（二）菌體收集第2天早晨（時間：約2-3h左右）：1、將過夜培養(yǎng)的菌體轉(zhuǎn)入

4、1.5mL離心管, 5000r/min 離心 30sec； 2、棄上清（三）堿裂解法提取質(zhì)粒DNA1、 將上述沉淀重懸于100卩L冰預(yù)冷的溶液I中，劇烈震蕩（須使沉淀完全 分散）（葡萄糖：懸浮細(xì)胞；EDTA抑制DNAase）2、 加入200卩L溶液U,蓋緊管口，輕柔顛倒離心管 510次，該過程應(yīng)小 于5min； （ NaOH溶解細(xì)胞膜，釋放 DNA SDS3、 加入150卩L冰預(yù)冷的溶液川，蓋緊管口，溫和地顛倒離心管 510次， 該過程大于5min；（乙酸鉀：和SDS反應(yīng)生成PDS（十二烷基硫酸鉀），沉淀蛋 白，同時體積較大的染色體 DNA也一起沉淀；冰乙酸：中和NaOH）4、10000r/m

5、in 離心 5min；5、上清轉(zhuǎn)移到另一新1.5mL離心管中；6加入2倍體積的無水乙醇，充分混勻，室溫放置 2min （若沉淀不充分， 可加入1/10體積3mol/L的醋酸鈉）；7、10000r/min 離心 5min；9、棄上清，干燥沉淀；9、加TE溶解沉淀，保存。六、實(shí)驗(yàn)作業(yè)：思考本實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵步驟是什么？答：本實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵是溶液I重懸須充分，溶液川混合須溫和。堿裂解法的關(guān) 鍵是如何把握SDS-NaO處理的時間。質(zhì)粒制備過程中，如果質(zhì)粒長時間暴露于 NaOH,質(zhì)粒有可能不可逆變性，使得抽提質(zhì)粒中有部分是變性質(zhì)粒。 這些變性質(zhì) 粒，不能酶切。所有一般情況下，SDS-KO處理時間不能超過5分鐘，最

6、好在冰 里處理，觀察到液體變得清就可以加入中和液。七、注意事項(xiàng)：1、質(zhì)粒的選取，盡量選擇較小的松弛型質(zhì)粒。2、提取過程應(yīng)盡量保持低溫3、溶液II不可冷凍,現(xiàn)用現(xiàn)配，加入溶液2后不要劇烈振蕩，只需輕輕顛 倒幾次離心管。復(fù)性時間不宜過長，一般是 5分鐘，否則會使染色體復(fù)性。4、 沉淀DNA1常使用冰乙醇，在低溫條件下放置時間稍長可使DNA沉淀完 全。沉淀DNA也可用異丙醇（一般使用等體積），且沉淀完全，速度快，但常把 鹽沉淀下來，所以多數(shù)還是用乙醇。5、應(yīng)用TE緩沖液溶解沉淀是為了在用苯酚、 氯仿抽提時，以減少DNA勺損 失。6 50%勺乙醇可溶解DNA故應(yīng)該極其注意70%勺乙醇是否蓋子完好，否則

7、稀 釋的乙醇有可能將所獲得DNA溶解掉。八、討論與小結(jié)：1. 為什么用無水乙醇沉淀DNA用無水乙醇沉淀DNA這是實(shí)驗(yàn)中最常用的沉淀DNA的方法。乙醇的優(yōu)點(diǎn)是 可以任意比和水相混溶，乙醇與核酸不會起任何化學(xué)反應(yīng)， 對DNA艮安全，因此 是理想的沉淀劑。DNA溶液是DNA以水合狀態(tài)穩(wěn)定存在，當(dāng)加入乙醇時，乙醇會奪去 DNA周圍 的水分子，使DNA失水而易于聚合。一般實(shí)驗(yàn)中，是加 2倍體積的無水乙醇與 DNA相混合，其乙醇的最終含量占67%左右。因而也可改用95%乙醇來替代無 水乙醇（因?yàn)闊o水乙醇的價格遠(yuǎn)遠(yuǎn)比 95%乙醇昂貴）。但是加95%的乙醇使總 體積增大，而DNA在溶液中有一定程度的溶解，因而

8、DNA損失也增大，尤其用多 次乙醇沉淀時，就會影響收得率。折中的做法是初次沉淀DNA時可用95%乙醇代替無水乙酵，最后的沉淀步驟要使用無水乙醇。 也可以用0.6倍體積的異丙醇 選擇性沉淀DNA 一般在室溫下放置15-30分鐘即可。2. 在用乙醇沉淀DNA寸，為什么一定要加 NaAc或NaCl至最終濃度達(dá)0.1 0.25mol/L ?在pH為8左右的溶液中，DNA分子是帶負(fù)電荷的，加一定濃度的NaAc或NaCl， 使Na沖和DNA分子上的負(fù)電荷，減少DNA分子之間的同性電荷相斥力，易于互 相聚合而形成DNA鈉鹽沉淀，當(dāng)加入的鹽溶液濃度太低時，只有部分 DNA形成 DNA鈉鹽而聚合，這樣就造成DN

9、A沉淀不完全，當(dāng)加入的鹽溶液濃度太高時，其 效果也不好。在沉淀的DNA中,由于過多的鹽雜質(zhì)存在，影響DNA勺酶切等反應(yīng)， 必須要進(jìn)行洗滌或重沉淀。本次實(shí)驗(yàn)是能動性、嚴(yán)謹(jǐn)性很強(qiáng)的實(shí)驗(yàn)，因此通過這次實(shí)驗(yàn)，我們能把理論 和實(shí)踐更好的聯(lián)系在一起，將將理論應(yīng)用到實(shí)踐，提高了自己的實(shí)驗(yàn)?zāi)芰Γ瑫r 也加深理論的理解。要成功完成實(shí)驗(yàn)，必須理論知識豐富，全面了解可能導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗的因素， 在試 驗(yàn)中特別注意。時刻規(guī)范操作，否則容易導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗。-點(diǎn)的痕跡，山風(fēng)呼呼，細(xì)雨微微。人行翦翦，心韻盈盈。思邃恒古，本義使 然，讓思想的光芒照亮每個心靈，讓身心的熱量變作普照大地的明媚，讓 蠕風(fēng)的蠢蠢欲動萬木復(fù)蘇的定格。在這片

10、神圣的土地上，色彩是潔凈的象征，靜物是可修復(fù)的抱樸，人 境是可絕緣的塵，合沓車馬也無喧。吾生有無涯而也無涯，知也以有而隨 無也，有有也者，有無也者，有未始有無也者，有未始有夫未始有無也者俄而有無矣，而未知有無之果孰有孰無也。今我則已有謂矣，而未知 吾所謂之其果有謂乎，其果無謂乎 ？摘自于莊子 齊物論多一事不如少一事，少一事不如沒一事，沒一事不如了一事，了一事不如空無一事。人之所以不幵心，那是因?yàn)橄胍奶?，人之所以不順? 是因?yàn)楦冻鎏?，之所以不如意，也是因?yàn)?，總?jì)較那些得與失。一念起千山萬水，一念滅滄海桑田。念人念心念天念地，隨心律動，心隨所動，雖有嘉肴，弗食不知其旨也；雖有至道，弗學(xué)不知其善也。是故 學(xué)然后知不足，教然后知困。知不足，然后能自反也 ；知困，然后自強(qiáng)也。 故曰：教學(xué)相長也。她也惟有付之一嘆，青年的容貌，盛氣，都漸漸地消磨去了。她怕見舊時的摯友。她改變了的容貌，氣質(zhì)，無非添加