工業(yè)淀粉酶的純化與分析試驗報告

1、工業(yè)淀粉酶的純化與分析1234實驗目的掌握鹽析法純化分離蛋白質的工作原理和方法 掌握利用葡萄糖凝膠層析法進行蛋白質脫鹽的技術 掌握測定淀粉酶活力的基本原理和方法 學習 Folin- 酚比色法測定蛋白質含量的原理和方法實驗原理 工業(yè)淀粉酶含有大量雜質將其溶解浸提后離心， 利用高濃度的硫酸銨溶液將上清液的蛋 白質沉降下來，所得沉淀溶解后即為鹽析液。利用葡糖糖凝膠 G-25 對大分子量蛋白質和小分子鹽類的阻滯作用不同， 析使鹽析液中的蛋白質和鹽類分離。酶活力是以酶在最適條件下， 催化一定化學反應的初速度來表示的。 一定量的淀粉酶在 37攝氏度， PH=6.8 的條件下，每分鐘水解淀粉酶生成 一個酶活

2、力單位，其中還原糖的量用 DNS法測定。蛋白質在 Folin- 酚試劑的作用下生成鎢藍和鉬藍，測定其在 ，從而求得樣品中蛋白質的含量。1材料：2儀器：3器材：四五1.從而經凝膠層在本實驗中， 是以1mg還原糖的量為500nm 波長下的吸光實驗材料及儀器設備工業(yè)淀粉酶電子天平；離心機；UV9100型分光光度計恒溫水域；沸水浴刻度試管： 25ml*21 ；移液管： 1ml*6、5ml*1 ；燒杯： 250ml*2、50ml*1; 研缽：一套；移液槍：一套；離心管： 100ml*1;1.5ml*4;7ml*1; 注射器： 1ml*1 ； 層析裝置： 1 套；量筒： 100ml*1 ；洗耳球： 2 個

3、；膠頭滴管： 2 個；移液管架； 玻璃棒實驗試劑 BaCl 2 溶液（ 1%）考馬斯亮藍G-2501%NaCl溶液淀粉溶液（0.5%)磷酸緩沖液（ 0.2molr/L,pH 6.8）牛血清蛋白（BSA標準液（250ug/ml ）Folin-酚試劑甲Folin-NaOH 溶液2.5mol/L )酚試劑乙葡萄糖標準液（ 1mg/ml ）DNS試劑實驗步驟浸提稱取 0.317g 淀粉酶制劑， 經浸提離心后轉移上清液 酶液”備用。記錄剩余體積為 18.2ml 并轉移到 50ml 燒杯里，置于冰浴中。1.2ml 于離心管中， 標記為 “粗2鹽析4ml蒸餾水按70軸勺飽和濃度稱取 6.976g(NH 4)

4、2SO固體，研細后，緩緩加入離心后的酶液中。 待(NH4)2SO固體溶解后，冰浴靜置20min后離心，將離心后固體溶解于中，并分裝于3支1.5ml離心管中，標記“鹽析”備用。3.脫鹽用注射器每管2ml。用洗脫液洗脫柱子，經檢驗沒有殘留的鹽和蛋白質后，對蛋白質進行脫鹽。注射0.5ml鹽析液，上樣完畢后，打開出水口，進行洗脫，并收集洗脫液， 分別用BaCl2和考馬斯亮藍G-250試劑檢驗試管中洗脫液的成分。把含有蛋白質的收 集液合并于離心管中，標記“脫鹽”備用。4.酶活力測定粗酶液0.05ml加蒸餾水稀釋至25ml，搖勻待用鹽析液0.05ml加蒸餾水稀釋至25ml，搖勻待用脫鹽液0.2ml加蒸餾水

5、稀釋至10ml，搖勻待用空白標準葡萄糖濃度梯度粗酶液鹽析液脫鹽液012345AAB0B1C0G葡糖糖液(ml)0.00.220.40.60.80.9淀粉酶液(ml)0.10.10.10.10.10.1H2O(ml)3.23.02.82.62.42.3pH6.8 緩沖液111111NaOH 溶 液(ml)111預熱搖勻，37 C水浴，5min預熱的淀粉酶各1ml迅速搖勻酶促反應37C 水浴，5mi nNaOH 溶 液(ml)111DNS試劑各2ml迅速搖勻顯色反應沸水浴5min，冷卻定容至25ml，搖勻比色以0號管為空白參比，測定入=540nm處的吸光度記錄吸 光度0.0000.0250.098

6、0.1910.2760.280.1720.2950.1450.4930.2160.396還原糖(mg)0.0000.2000.4000.6000.8000.9000.50920.96330.74085.蛋白質含量測定粗酶液0.5ml加蒸餾水.稀釋到10ml，搖勻;鹽析液1.0ml加蒸餾水.稀釋到10ml，搖勻;脫鹽液直接取用;樣品處理:取樣2g豆芽研磨水；定容，搖勻浸提取14支試管按下表操作并記錄實驗數據。空白標準蛋白質濃度梯度樣品1粗酶液鹽析液脫鹽液012345A1AB1B2CC2DD2BSA標準 液(ml)0.00.20.40.60.80.9樣品待測液(ml)11111111蒸餾水(ml)

7、1.00.80.60.40.20.0Folin-酚試劑甲(ml)各5ml反應各管混勻，室溫下放置10mi nFolin-酚試劑乙各 0.5ml記錄吸光度(A 500)0.0000.0480.0960.1190.1570.2040.1250.1170.1790.1950.1940.2040.1660.157平均值(A 500)0.1210.1870.1990.162比色以0號管為空白參比，測定入=500nm處的吸光度及時混勻，室溫下放置30min(ml)反應六、數據處理粗酶液濃度0.311000mg 15.5 mg/ ml20ml鹽析液濃度15.5 mg/ ml 16ml4ml4ml62mg/

8、ml1各樣液濃度 脫鹽液濃度C0.6 mlB(2_212)m0.6 ml 62mg/ ml-(2 212)ml6.098 mg/ ml2各酶的活力計算 粗酶液: A=A-A0=0.337-0.177=0.160代入 y=0.5064x-0.0774 中得 m粗=0.469mg0.05 ml 15.5 mg/ ml粗酶液樣品量25ml0.2 ml 6.210 3mg粗酶液淀粉酶活力0.469 mg5 min 6.210 3 mg15.129U / mg樣品總活力=15.129U/mg X 310mg=4688.99U 鹽析液 B=B-Bo=0.410-0.313=0.097代入 y=0.5064

9、x-0.0774 中得 m鹽=0.344mg鹽析液樣品量0.05ml 62mg/ml 0.150.0186 mg25ml鹽析液淀粉酶活力0.344 mg5 min 0.0186 mg3.699U / mg樣品總活力=3.699U/mg X 310mg=1146.69U 脫鹽液 C=G-C0=0.445-0.207=0.238代入 y=0.5064x-0.0774 中得 m脫=0.623mg0.2 ml 6.098 mg/ ml脫鹽液樣品量10ml0.15 ml 0.0183 mg脫鹽液淀粉酶活力0.623 mg5 min 0.0183 mg6.809U / mg樣品總活力=6.809U/mg

10、X 310mg=2110.79U3純化回收率 鹽析后回收率鹽析液的酶活力粗酶液的活力100% 1146.69U4688.99U100%24.45%脫鹽后回收率脫鹽液的活力粗酶液的活力100% 2110.79U4688.99U100%45.02%4蛋白質的含量測定 樣品樣品1 的 A=0.121代入y = 0.0008X - 0.0011得 m 樣=152.625ug=0.153mg即得1ml樣品1液的蛋白質含量=0.153mg樣品1的蛋白質總含量 0.153mg蛋白/ml樣液X 100ml=15.3mg0.0153 g豆芽中蛋白質含量* 100%0.765% 粗酶液粗酶液的B =0.1871m

11、g粗酶液中蛋白質的含量 0.153mg代入 y = 0.0008X - 0.0011 得 m粗=235.125ug=0.235mgA0.5ml 1ml10ml0.153 mg 0.197 mgs白 / mg羊品 0.5ml空m/ml1ml10ml稱樣總蛋白的含量 =0.197mg蛋白/mg樣品x 310mg=61.07mg 鹽析液鹽析液的C =0.199代入 y = 0.0008X - 0.0011 得 m鹽=250.125ug=0.250mg1mg鹽析液中蛋白質的含量 0.250 mg0.250 mg,c , 62mg/ml , 1.0ml1ml10mlB1.0ml 1ml10ml稱樣總蛋白

12、的含量 =0.0403mg蛋白/mg樣品x 310mg=12.493mg0.0403 mg蛋白/mg樣品脫鹽液脫鹽液的D=0.162代入 y = 0.0008X - 0.0011 得 m脫=203.875ug=0.204mg1mg脫鹽液中的蛋白質的含量0.204C 1.oml0.204 mg6.098 mg/ ml 1.0 ml0.0335 mg蛋白/mg樣品稱樣總蛋白的含量=0.0335mg 蛋白 /mg 樣品 x 310mg=10.385mg5比活力計算粗酶液比活力鹽析液比活力4688.99U61.07mg1146.69U12.493mg76.781U/mg91.787U/mg脫鹽液比活力

13、2110-79U203.254U/mg10.385mg6純化倍數鹽析液純化倍數脫鹽液純化倍數鹽析液比活力91.787U / mg粗酶液比活力脫鹽液比活力粗酶液比活力76.781 U / mg 1.195咤S2.64776.781 U / mg討論1、蛋白質的測定方法考馬斯亮藍法：考馬斯亮藍法對玻璃吸附較大，每次用完比色皿都需要酒精清洗，而 且對于操作要求較高，每加一種試劑都要迅速搖勻，因為考馬斯亮藍試劑是用濃磷酸 和乙醇配置的，如不搖勻，會導致蛋白質變性。適用于測定可溶性蛋白。 紫外吸收法：此法簡單易行，直接將蛋白質溶液置于280nm下進行吸收測定即可。要求使用石英比色皿，而且如用分光光度計測

14、定，待測樣品必須很純，否則有雜質的話 會造成影響。適用于可溶性蛋白。500nm雙縮脲法：雙縮脲試劑即為堿性銅離子溶液，可與蛋白質生成紫色絡合物，在 波長處測其吸光度即可。但其靈敏度比較低，且只適用于可溶性蛋白質的測定。 凱氏定氮法：此法是將蛋白質當中的蛋白N全部轉化為氨態(tài) N,再將其蒸發(fā)出，用硼酸吸收后再用鹽酸滴定。通過滴定所用掉的鹽酸的量計算出N的含量，對照經驗系數,即可大致得出蛋白質的含量。適用于全部蛋白質。 Folin-酚比色法：用于測定可溶性蛋白質，靈敏度高，測定范圍為25-250ug，操作簡便，是實驗室最常用的方法之一。但要注意試劑甲中的0H含量不能過高，否則 Cu2+會沉淀。2、酶

15、活力也稱為酶活性，用來衡量酶的多少，是指酶催化一定化學反應的能力。通常用最 適條件下酶所催化的某一化學反應的速率來衡量沒活力的大小。酶催化的反應速率越大,酶的活力越高，反之，酶活力越低。酶活力表示方法:國際單位(IU):在25C，其他條件均為酶的最適條件下，每min轉換1umol底物需酶量為一個活度單位,IU。(1)終點法：測定完成一個反應所需要的時間自定義單位(2)動力學法：測定酶催化反應的初速度3、比活力：國際酶學委員會規(guī)定酶的比活力為每毫克蛋白質所含有的酶活力單位數，以酶 的活力單位/mg蛋白質表示。酶的比活力用來衡量酶的純度，對于同一種酶來說，比活 力越大，酶的純度越高。比活力的大小可

16、以用來比較酶制劑中單位質量蛋白質的催化能 力，是表示酶的純度高低的一個重要指標。4、純化回收率：用來衡量酶的純化的好與差，純化回收率值越高，則純化方法越好。純化 回收率一定小于1，因為每純化一步，都會有部分蛋白損失，回收率就下降點。純化回收率第次總活 100%鹽析后回收率不是很高，推測原因可能是部分酶在實驗過程中損失或者部分酶失活。脫鹽后的回收率按理說應小于鹽析后的回收率，而實驗測得相反，可能是鹽析后的淀粉酶液中存在（NH）2SQ，對淀粉酶的活性起了抑制作用。5、純化倍數：表示純化效果，純化倍數越高，純化效果越好。純化倍數第一次比活力 100%6、純化回收率和純化倍數是用來評價一個純化方法好與差的指標。純化回收率越高則純化 過程中酶的損失越少，體現了純化方法的效果；純化倍數反映的則是酶純化效果的好于 差，一般大于1,純化后比活力提高越多，即純化倍數越高，總活力損失越少，即回收 率越高，純化效果越好。7、蛋白質的純化方法等電點沉淀法不同蛋白質的等電點不同，可用等電點沉淀法使它們相互分離。鹽析法不同蛋白質鹽析所需要的鹽飽和度不同，所以可通過調節(jié)鹽濃度將目的蛋白沉淀析出。被鹽析沉淀下來的蛋白質仍保持其天然性質，并能再度溶解而不變性。 有機溶劑沉淀法中性有機溶劑如乙醇、