年產(chǎn)1000噸飼用酸性蛋白酶的生產(chǎn)工藝設(shè)計(jì)課程設(shè)計(jì)

1、年產(chǎn)1000噸飼用酸性蛋白酶的生產(chǎn)工藝設(shè)計(jì)1. 前言酸性蛋白酶是一類(lèi)最適ph值為2.55.0的天冬氨酸蛋白酶，相對(duì)分子質(zhì)量為30000 40000。酸性蛋白酶主要來(lái)源于動(dòng)物的臟器和微生物分泌物,包括胃蛋白酶、凝乳酶和一些微生物蛋白酶。根據(jù)其產(chǎn)生菌的不同，微生物酸性蛋白酶可分為霉菌酸性蛋白酶、酵母菌酸性蛋白酶和擔(dān)子菌酸性蛋白酶.根據(jù)作用方式可分為兩類(lèi)：一類(lèi)是與胃蛋白酶相似，主要產(chǎn)酶微生物是曲霉、青霉和根霉等；另一類(lèi)是與凝乳酶相似，主要產(chǎn)酶微生物是毛霉和栗疫霉等。 細(xì)菌中尚未發(fā)現(xiàn)產(chǎn)酸性蛋白酶的菌株.由于酸性蛋白酶具有較好的耐酸性，因此被廣泛地應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、輕工、皮革工藝以及飼料加工工業(yè)中。國(guó)外

2、關(guān)于酸性蛋白酶的生產(chǎn)研究從20世紀(jì)初就開(kāi)始了。1908年，德國(guó)科學(xué)家從動(dòng)物的胰臟中提取出胰蛋白酶，并將其用于皮革的鞣質(zhì)。1911年美國(guó)科學(xué)家從木瓜中提取木瓜蛋白酶（在酸性，堿性和中性的條件下都能分解蛋白質(zhì)的酶）并將木瓜蛋白酶用于除去啤酒中的蛋白質(zhì)渾濁物。自1954年吉田首次發(fā)現(xiàn)黑曲霉可產(chǎn)生酸性蛋白酶以來(lái)，國(guó)內(nèi)外對(duì)微生物發(fā)酵生產(chǎn)酸性蛋白酶進(jìn)行了廣泛的研究。1964年外國(guó)科學(xué)家首次發(fā)現(xiàn)大孢子黑曲霉突變體能產(chǎn)生兩種不同的酸性蛋白酶，即酸性蛋白酶和酸性蛋白酶。1965年又從血紅色陀螺孔菌，中分離出了一種酸性蛋白酶，并對(duì)該酶進(jìn)行了純化和結(jié)晶。1968年從微小毛霉中篩選出了一種酸性蛋白酶，并對(duì)其進(jìn)行了純化

3、和酶學(xué)性質(zhì)分析。1995年外國(guó)科學(xué)家對(duì)煙曲霉酸性蛋白酶的基因進(jìn)行了克隆和測(cè)序。2001年又從假絲酵母中篩選出了一種酸性蛋白酶菌株，并對(duì)該酶進(jìn)行了核苷酸序列分析和功能分析。國(guó)外學(xué)者對(duì)曲霉酸性蛋白酶的結(jié)構(gòu)和功能等己經(jīng)研究的較為透徹。與國(guó)外相比，我國(guó)對(duì)酸性蛋白酶的研究相對(duì)較晚些。1970年上海工業(yè)微生物研究所首先從黑曲霉中篩選出一株產(chǎn)酸性蛋白酶菌株，并和上海酒精廠協(xié)作進(jìn)行中試生產(chǎn)，填補(bǔ)了我國(guó)酸性蛋白酶制劑的空白.近年來(lái)國(guó)內(nèi)在酸性蛋白酶上的研究大都致力于選育產(chǎn)酶活力高、抗逆性好的菌種，并獲得了一些很有應(yīng)用前途的產(chǎn)酶菌株。目前用于酸性蛋白酶生產(chǎn)的高產(chǎn)菌株主要有黑曲霉、宇佐美曲霉和青霉及它們的突變株。李永

4、泉等，對(duì)宇佐美曲霉所產(chǎn)的酸性蛋白酶進(jìn)行了發(fā)酵過(guò)程動(dòng)力學(xué)研究.戚淑威等對(duì)青霉產(chǎn)酸性蛋白酶的適宜條件和酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了分析。謝必峰等，采用硫酸銨鹽析法和離子交換層析法分離純化了黑曲霉產(chǎn)酸性蛋白酶，并對(duì)其氨基酸組分進(jìn)行了分析。2008年王云等，通過(guò)質(zhì)譜指紋法對(duì)黑曲霉發(fā)酵液中所產(chǎn)蛋白進(jìn)行了分析比對(duì)和鑒定酸性蛋白酶分子生物學(xué)方面的研究，國(guó)內(nèi)僅僅集中于凝乳酶和胃蛋白酶方面，有關(guān)真菌酸性蛋白酶的分子生物學(xué)研究報(bào)道很少摘要：本課題設(shè)計(jì)是利用黑曲霉（aspergillus niger ）3.350制備酸性蛋白酶，主要從菌種的選育，培養(yǎng)基的配置，滅菌，種子擴(kuò)大培養(yǎng)，和發(fā)酵罐的設(shè)計(jì)，發(fā)酵車(chē)間的物料衡算，發(fā)酵過(guò)程的工藝

5、控制，下游加工十點(diǎn)進(jìn)行。闡述了1000噸飼用酸性蛋白酶的制取工藝。其中對(duì)發(fā)酵罐做了創(chuàng)新性設(shè)計(jì)。2. 菌種的選育2.1 菌種的制備不管在過(guò)去、現(xiàn)在和將來(lái)，微生物是各種生物活性產(chǎn)物的豐富資源。在發(fā)酵前期，微生物的選擇至關(guān)重要，此課題設(shè)計(jì)的是利用黑曲霉發(fā)酵生產(chǎn)酸性蛋白酶的整體過(guò)程。選擇性分離的一般步驟如下：含微生物材料的選擇材料的預(yù)處理所需菌種的分離菌種的培養(yǎng)菌種初篩菌種復(fù)篩性能鑒定菌種保藏。本實(shí)驗(yàn)選用黑曲霉作為菌種，發(fā)酵生產(chǎn)酸性蛋白酶，該霉菌株在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心的保藏編號(hào)為3350。而黑曲霉（aspergillus niger ）生產(chǎn)酸性蛋白酶的工藝流程為：原始菌株分離純

6、化紫外線誘變選育菌株分離純化亞硝基胍誘變選育菌株分離純化選育菌株生產(chǎn)工藝優(yōu)化傳代試驗(yàn)選育菌株斜面菌種三角瓶菌種淺盤(pán)菌種_ 主原料混料（水、無(wú)機(jī)氮、無(wú)機(jī)鹽）蒸料冷卻接種發(fā)酵穩(wěn)定化處理干燥粉碎包裝檢測(cè)成品粗酶抽提過(guò)濾鹽析沉淀干燥粉碎包裝檢測(cè)成品2.2 菌種的保藏菌種是從事微生物學(xué)以及生命科學(xué)研究的基本材料，特別是利用微生物進(jìn)行有關(guān)生產(chǎn)工業(yè)，更離不開(kāi)菌種。所以，菌種保藏是進(jìn)行微生物學(xué)研究和微生物育種工作的重要組成部分，其任務(wù)是使菌種不死亡，同時(shí)還要盡可能設(shè)法把菌種的優(yōu)良特性保持下來(lái)而不致向壞的方面轉(zhuǎn)化。菌種保藏主要是根據(jù)菌種的生理生化特點(diǎn)，人工創(chuàng)造條件，使孢子或菌體的生長(zhǎng)代謝活動(dòng)盡量降低，以減少其變

7、異。一般可通過(guò)保持培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分在最低水平、缺氧狀態(tài)、干燥和低溫，使菌種處于“休眠”狀態(tài)，抑制其繁殖能力。常用的菌種保藏方法有：斜面冰箱保藏法、沙土管保藏法、菌絲速凍法、石蠟油封存法、真空冷凍干燥保藏法和液氮超低溫保藏法。此課題中黑曲霉采用真空冷凍干燥保藏法，預(yù)凍：本實(shí)驗(yàn)采用-80 預(yù)凍2h后進(jìn)行干燥。干燥過(guò)程：第一階段干燥樣品溫度分別控制在-15 14 h，10 10 h，真空度為150 pa，直到樣品的水分升華除去90%；第二階段干燥。升高板層溫度至20，迅速蒸發(fā)樣品中的殘余水分。該過(guò)程大約需要10h。將凍干菌存放于0冰箱中備用.3培養(yǎng)基的配制培養(yǎng)基的類(lèi)型很多，可以根據(jù)組成、狀態(tài)和用途等進(jìn)

8、行分類(lèi)，按照用途可以分成孢子培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基。微生物大規(guī)模發(fā)酵設(shè)計(jì)主要用到孢子、種子和發(fā)酵培養(yǎng)基這三種類(lèi)型。3.1活化培養(yǎng)基黑曲霉的活化培養(yǎng)基的配制如下：斜面培養(yǎng)基：蔗糖 30g，nano3 3 g，mgso4 0.5 g，kcl 0.5 g，feso4 0.01 g，k2hpo4 1 g，瓊脂20 g，將上述各組分溶于1000 ml水中，121 滅菌20 min，備用。3.2 種子培養(yǎng)基種子培養(yǎng)基是供孢子發(fā)芽、生長(zhǎng)和大量繁殖菌絲體，并使菌絲體長(zhǎng)的粗壯成為活力強(qiáng)的種子。對(duì)于種子培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)要求比較豐富和完全，氮源和維生素的含量也比較高些，濃度以稀薄為好，可以達(dá)到較高的溶解氧，供大

9、量菌體生長(zhǎng)和繁殖。黑曲霉的種子培養(yǎng)基為麥芽汁培養(yǎng)基。3.3 發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)基的要求是營(yíng)養(yǎng)要適當(dāng)豐富和完全適合于菌種的生理特性和要求，使菌種迅速生長(zhǎng)、健壯，能在比較短的周期內(nèi)充分發(fā)揮產(chǎn)生菌合成發(fā)酵產(chǎn)物的能力，但要注意成本和能耗。黑曲霉3350發(fā)酵培養(yǎng)基的配方：豆餅粉 3.75, 玉米粉0.625，魚(yú)粉 0.625，氯化銨 1.0，氯化鈣 0.5，磷酸二氫鈉0.2，豆餅石灰水解液10，ph 5.5。3.4 補(bǔ)料培養(yǎng)基黑曲霉3350發(fā)酵培養(yǎng)基的配方：豆餅粉 37.5, 玉米粉0.625，魚(yú)粉 0.625，氯化銨 1.0，氯化鈣 0.5，磷酸二氫鈉0.2，豆餅石灰水解液10，ph 5.5。主要加大

10、豆餅粉的量，起補(bǔ)充碳源，氮源和生長(zhǎng)因子之用。4 .滅菌生物化學(xué)反應(yīng)過(guò)程中，特別是細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，往往要求在沒(méi)有雜菌污染的情況下進(jìn)行，這是由于生物反應(yīng)系統(tǒng)中通常含有比較豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，因而很容易受到雜菌的污染，進(jìn)而產(chǎn)生各種不良的后果：（1）由于雜菌的污染，使生物化學(xué)反應(yīng)的基質(zhì)或產(chǎn)物消耗，造成產(chǎn)率下降；（2）由于雜菌所產(chǎn)生的某些代謝產(chǎn)物，或污染后發(fā)酵液的某些理化性質(zhì)的改變，使產(chǎn)物的提取變得困難，造成收得率降低或使產(chǎn)品質(zhì)量下降；（3）污染的雜菌可能會(huì)分解產(chǎn)物而使生產(chǎn)失??；（4）污染的雜菌大量繁殖，會(huì)改變反應(yīng)介質(zhì)的ph，從而使生物化學(xué)反應(yīng)發(fā)生異常變化；（5）發(fā)生噬菌體污染，微生物細(xì)胞被破裂而使生產(chǎn)失敗

11、等。4.1 滅菌方法所謂滅菌，就是指用物理或化學(xué)殺滅或去除物料或設(shè)備中一切有生命物質(zhì)的過(guò)程。常用的滅菌方法有：化學(xué)滅菌、射線滅菌、干熱滅菌、濕熱滅菌和過(guò)濾滅菌等。本設(shè)計(jì)采用濕熱滅菌。4.2 培養(yǎng)基的連續(xù)滅菌圖4-1 連續(xù)滅菌的流程圖培養(yǎng)基連續(xù)滅菌為在短時(shí)間內(nèi)被加熱到滅菌溫度（130140），短時(shí)間內(nèi)保溫（一般為58min）,升降溫時(shí)間相對(duì)較短，可以實(shí)現(xiàn)自動(dòng)控制、提高發(fā)酵罐的設(shè)備利用率，蒸汽用量平穩(wěn)等優(yōu)點(diǎn)，培養(yǎng)基在短時(shí)間內(nèi)被加熱到滅菌溫度，短時(shí)間保溫后快速冷卻，再進(jìn)入早已滅完菌的發(fā)酵罐，這樣不但可以節(jié)省時(shí)間，更重要的是減少了培養(yǎng)基的破壞率。對(duì)補(bǔ)料培養(yǎng)基的滅菌方法跟發(fā)酵培養(yǎng)基的滅菌方法一樣都是濕熱

12、滅菌，其加熱蒸汽壓力要求較高，一般不小于0.45mpa。連續(xù)滅菌流程如上圖。影響滅菌效果的因素有：微生物的種類(lèi)和數(shù)量；培養(yǎng)基的性質(zhì)、濃度、成分；滅菌的溫度和時(shí)間。滅菌原理：對(duì)數(shù)殘留定律（對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行濕熱滅菌時(shí)，培養(yǎng)基中的微生物受熱死亡的速率與殘存的微生物數(shù)量成正比）。4.3 空氣滅菌此課題以空氣為氧源。根據(jù)國(guó)家藥品質(zhì)量管理規(guī)范的要求，生物制品、藥品的生產(chǎn)場(chǎng)地業(yè)需要符合空氣潔凈度的要求。獲得無(wú)菌空氣的方法有：輻射滅菌、化學(xué)滅菌、加熱滅菌、靜電除菌、過(guò)濾介質(zhì)除菌等。過(guò)濾介質(zhì)除菌是目前發(fā)酵工業(yè)中空氣除菌的主要手段，常用的過(guò)濾介質(zhì)有棉花、活性炭或玻璃纖維、有機(jī)合成纖維、有機(jī)和無(wú)機(jī)燒結(jié)材料等。4.3.1

13、 過(guò)濾除菌流程及設(shè)備過(guò)濾除菌流程圖如圖4-1所示：1-粗過(guò)濾器；2-壓縮機(jī)；3-貯罐；4，6-冷卻器；5-旋風(fēng)分離器；7-絲網(wǎng)除沫器；8-加熱器；9-空氣過(guò)濾器圖4-1 空氣除菌設(shè)備流程圖4.3.2 無(wú)菌空氣的檢查無(wú)菌檢查方法有肉湯培養(yǎng)法、斜面培養(yǎng)法和雙碟培養(yǎng)法。這里采用斜面培養(yǎng)法進(jìn)行無(wú)菌空氣的檢查，具體方法為：500ml三角瓶?jī)?nèi)裝斜面培養(yǎng)基50ml，接種后置旋轉(zhuǎn)式搖床上，30下培養(yǎng)24h后觀察有無(wú)菌落形成。4.4 發(fā)酵罐的滅菌發(fā)酵罐的滅菌可采用空罐滅菌，此處采用空罐滅菌?？展逌缇菍⑺械耐饪诙忌晕⒋蜷_(kāi)，然后通入水蒸汽，讓水蒸汽盡量通過(guò)每一個(gè)菌落達(dá)到滅菌效果。具體方法是：在121滅菌80分

14、鐘。5種子擴(kuò)大培養(yǎng) 本發(fā)酵屬于一級(jí)種子罐擴(kuò)大培養(yǎng)，二級(jí)發(fā)酵。設(shè)計(jì)流程圖如圖5-1：發(fā)酵罐種子罐錐形瓶斜面 圖5-1 種子擴(kuò)大培養(yǎng)流程圖5.1 種子制備將菌種接種于活化斜面培養(yǎng)基培養(yǎng), 30活化24h?；罨蟮木N用生理鹽水洗下，轉(zhuǎn)接于搖瓶種子培養(yǎng)基, 接種量5%6%，30培養(yǎng)12h。經(jīng)搖瓶培養(yǎng)后的種子，以接種量5%接種于種子罐，30培養(yǎng)12h，菌種濃度達(dá)到108109個(gè)/ml。5.2 發(fā)酵罐培養(yǎng)將擴(kuò)大培養(yǎng)后的菌種以5%的接種量接入發(fā)酵罐中，發(fā)酵溫度控制在30，罐壓0.5/cm2，發(fā)酵過(guò)程中通過(guò)流加na0h溶液控制發(fā)酵液ph。根據(jù)菌體濃度、ph決定具體發(fā)酵時(shí)間為35.5h。發(fā)酵過(guò)程中采用自動(dòng)攪拌

15、器，將轉(zhuǎn)速控制在100r/min，使流加堿液與發(fā)酵液快速混合均勻。6發(fā)酵罐的設(shè)計(jì)廣東省微生物研究所通過(guò)改變搖瓶裝液量和轉(zhuǎn)速來(lái)考察溶氧對(duì)黑曲霉菌種的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：在250ml的三角瓶中裝液量為100ml，轉(zhuǎn)速150r/min酶活最高，裝液量過(guò)多或過(guò)少，產(chǎn)酶量較低。搖床轉(zhuǎn)速較低時(shí)，通氣量不夠，生長(zhǎng)較慢，產(chǎn)酶量也低。當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速過(guò)快時(shí)，產(chǎn)酶量也不高，可能是菌絲斷裂過(guò)度。培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)主要被菌體用于自身的生長(zhǎng)。此課程設(shè)計(jì)中選擇使用機(jī)械攪拌式通風(fēng)發(fā)酵罐。機(jī)械攪拌通風(fēng)發(fā)酵罐是發(fā)酵工廠最常用類(lèi)型。它是利用機(jī)械攪拌器的作用，使空氣和發(fā)酵液充分混合，促使氧在發(fā)酵液中溶解，以保證供給微生物生長(zhǎng)繁殖、發(fā)酵所需要

16、的氧氣。6.1 發(fā)酵罐的結(jié)構(gòu)機(jī)械攪拌式通風(fēng)發(fā)酵罐的主要組成部件有：罐體、攪拌器、軸封、消泡器、聯(lián)軸器、中間軸承、空氣吹泡管(或空氣噴射器)、擋板、冷卻裝置、人孔以及管路等。6.2 發(fā)酵罐罐體的幾何尺寸計(jì)算1.發(fā)酵罐普遍h0/d=1.97，而酸性蛋白酶對(duì)空氣有一定要求，為了使之更大面積的接受氧氣，黑曲霉所用發(fā)酵罐設(shè)計(jì)為矮胖形，即：h0/d=1.63，從通風(fēng)角度講，空壓機(jī)為無(wú)油潤(rùn)滑一級(jí)壓縮, 出口壓力0.3mpa。壓縮空氣經(jīng)過(guò)約60m米以上路程才送到發(fā)酵車(chē)間, 管道阻力加上空氣過(guò)濾器阻力, 空氣壓降厲害, 若大型發(fā)酵罐再設(shè)計(jì)成瘦高形, 勢(shì)必會(huì)增加液柱高度, 直接影響到進(jìn)罐通風(fēng)管口空氣的壓頭和流速,

17、 若空壓機(jī)房貯氣筒壓頭稍有波動(dòng)產(chǎn)生下降, 發(fā)酵罐進(jìn)風(fēng)口風(fēng)速無(wú)噴力, 對(duì)供氣量及溶氧帶來(lái)不利影響。所以大型發(fā)酵罐設(shè)計(jì)成矮胖形可降低液柱高度, 有利通風(fēng)溶氧。2.發(fā)酵罐上下封頭采用十二塊西瓜片拼裝而成, 頂部中心太陽(yáng)板直徑1800，在現(xiàn)場(chǎng)施工拼裝，解決了封頭整體成形無(wú)法運(yùn)輸?shù)睦щy。3.傳動(dòng)部采用臥式電動(dòng)機(jī)通過(guò)聯(lián)軸節(jié)帶動(dòng)大型減速箱直接帶動(dòng)攪拌軸, 就是減速箱內(nèi)設(shè)一對(duì)弧形傘齒輪使進(jìn)軸作90變向用聯(lián)軸節(jié)通過(guò)十二根尼龍銷(xiāo)棒聯(lián)接臥式電動(dòng)機(jī)。既降低了設(shè)備安裝高度, 又給安裝維修帶來(lái)了很大方便, 如圖： 圖6-1 傳動(dòng)部臥式電動(dòng)機(jī)聯(lián)軸圖四臺(tái)發(fā)酵罐采用二種減速箱, 前二臺(tái)罐為迸口減速箱, 減速箱內(nèi)裝有一對(duì)直齒輪和

18、一對(duì)弧形傘齒輪, 結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單, 維修方便, 一般只有傘齒輪及進(jìn)軸、軸承損壞要維修更新。后二臺(tái)罐采用國(guó)產(chǎn)福州發(fā)電設(shè)備廠生產(chǎn)的行星齒輪箱, 箱內(nèi)加設(shè)一對(duì)弧形傘齒輪使進(jìn)軸作90變向, 由聯(lián)軸節(jié)與臥式電動(dòng)機(jī)相聯(lián)。與進(jìn)口減速箱比, 結(jié)構(gòu)復(fù)雜、行星輪壞很難修理。4.減速箱下傳動(dòng)架上傳動(dòng)軸設(shè)計(jì)安放一部軸承座, 內(nèi)裝中型普通軸承一粒, 輕型平面受力軸承一粒，軸承上端軸頭由夾殼聯(lián)軸節(jié)與減速箱出軸聯(lián)接。設(shè)計(jì)少放一部軸承降低傳動(dòng)架約米的高度, 增強(qiáng)了減速箱及電機(jī)在罐頂上的穩(wěn)定性。罐內(nèi)設(shè)計(jì)放二部軸瓦來(lái)定位罐內(nèi)軸與上主軸的同心度, 上部軸瓦在盤(pán)管上方, 下部軸瓦安裝在軸端。軸瓦、軸套材質(zhì)均為鑄鐵。只要上下軸垂直同心度裝得

19、好, 軸瓦、軸套半年到一年更換一次。5.對(duì)發(fā)酵罐來(lái)講, 冷卻面積及冷卻管的設(shè)計(jì)非常重要, 既要考慮排作形式, 又要起到最好冷卻效果, 還要便于安裝維修。設(shè)計(jì)中采取盤(pán)管式, 列管式同時(shí)采用的做法, 加設(shè)盤(pán)管組相對(duì)來(lái)講好布置, 可利用盤(pán)管間之間隙當(dāng)樓梯用, 給安裝及今后維修帶來(lái)很大方便。加設(shè)列管組可彌補(bǔ)全用盤(pán)管時(shí)需用冷卻面積的管量放不下和盤(pán)管無(wú)檔板作用的缺點(diǎn)?？紤]罐徑大, 放熱量集中冷卻效果一定要好,所以又在冷卻管的合理進(jìn)出水上做文章, 采用快進(jìn)快出的接管法, 就是把盤(pán)管列管分成多組, 使冷卻水分成多路進(jìn)多路出, 以水在冷卻管內(nèi)1.5米/秒停留1分鐘來(lái)分組。與發(fā)酵液熱交換后的熱水匯集總管進(jìn)熱水池、

20、再用泵送冷卻塔, 冷卻后的水進(jìn)冷水池,由泵供送發(fā)酵罐進(jìn)水用。原則冷卻塔循環(huán)水量要大于發(fā)酵用水量約倍, 保證熱水通過(guò)冷卻塔及時(shí)降溫到氣溫夏天滿(mǎn)足發(fā)酵冷卻用水的需要,如圖圖6-2 發(fā)酵罐冷卻管設(shè)計(jì)6.攪拌槳葉形式及檔次直接影響到產(chǎn)酸及攪拌功率, 由于罐體矮胖形, 罐徑大,，設(shè)計(jì)采用大槳葉, 低轉(zhuǎn)速。底道槳1900，八彎葉, 中道槳小, 六彎葉, 轉(zhuǎn)速65r.p.m。所以, 采用高通風(fēng), 大槳葉, 低轉(zhuǎn)速攪抖,可降低攪拌功率, 同樣達(dá)到高產(chǎn)酸的效果。槳葉葉片做成可裝拆式, 部件拿進(jìn)罐內(nèi)后組裝, 用不銹螺栓把葉片鎖緊在園盤(pán)上, 給運(yùn)輸安裝帶來(lái)方便, 司時(shí)罐頂人孔可縮小, 開(kāi)600即可。八萬(wàn)葉輪尺寸如下

21、：葉徑d=0.365d=0.3655200=1900mm，盤(pán)徑d=0.62d=0.621900=1175mm，葉片高h(yuǎn)=0.15d=0.151900=280mm，葉片弧長(zhǎng)l=0.4d=0.41900=760mm，風(fēng)管：罐壓：0.02mpa，罐溫：35，培養(yǎng)基量：最大通風(fēng)比1：0.38時(shí)120 m3。液柱高度：h=7.3米，風(fēng)管出口壓p=0.193mpa。貯氣筒壓頭p（供氣最低壓力）：空氣輸送管道阻力0.02mpa，二級(jí)空氣過(guò)濾器阻力0.04mpa。故p=0.02+0.04+0.193=0.253mpa（絕對(duì)壓力）7.進(jìn)風(fēng)管采用盤(pán)管式（管徑根據(jù)通風(fēng)量計(jì)算, 在盤(pán)管上放二付不銹法蘭, 便于安裝及今

22、后清洗，盤(pán)管徑等于低道槳徑。盤(pán)管放在底道槳葉片下面, 盤(pán)管下方開(kāi)三排小孔,，二排成45角，小孔徑46，交叉排列、這樣有利于罐底部液體的攪拌和通風(fēng), 且不易被固體物堵塞, 孔數(shù)根據(jù)盤(pán)管內(nèi)截面積計(jì)算, 小孔總面積鎮(zhèn)盤(pán)管內(nèi)截面積, 使風(fēng)通過(guò)各個(gè)小孔時(shí)有產(chǎn)生噴力。8.罐體支座設(shè)計(jì)成由六根園柱腳支承整臺(tái)罐體放在盆形的水泥墩上, 放料管從罐底中接出斜穿過(guò)水泥墩壁排水孔引接到打料泵送等電點(diǎn)提取。避免了裙座造成罐底難清洗, 死角多, 長(zhǎng)雜菌、難消毒的缺點(diǎn)。整臺(tái)罐底下通風(fēng)好, 陽(yáng)光照, 清洗消毒非常方便。9.利用下軸瓦座筒形架下部四孔封上2目不銹鋼網(wǎng)來(lái)捕集罐內(nèi)螺褚全、螺母等另部件的脫落回收, 給查罐時(shí)及時(shí)提供維

23、修信息,保證了放料閥、打料泵不易損壞, 使用安全可靠性。6.3 發(fā)酵罐壁厚6.3.1 罐體壁厚1=pd/(2-p)+c （6-2）式（6-2）中：p耐受壓強(qiáng)（取0.25mpa） 焊縫系數(shù)，雙面焊取0.8，無(wú)縫焊取1.0 設(shè)計(jì)溫度下的許用應(yīng)力（不銹鋼焊接壓力容器許用應(yīng)力為150,137 mpa）c腐蝕裕度，當(dāng) - c10mm時(shí)，c=3mm解得罐體壁厚1=pd/(2-p)+c=0.251500/（21370.8-0.25）+3=4. 7 mm取整為1=5 mm6.3.2 封頭壁厚2=pdy/(2) +c （6-3）式（6-3）中：p耐受壓強(qiáng)（取0.25mpa） y開(kāi)孔系數(shù)，取2.3焊縫系數(shù)，雙面焊

24、取0.8，無(wú)縫焊取1.0 設(shè)計(jì)溫度下的許用應(yīng)力（不銹鋼焊接壓力容器許用應(yīng)力為150,137 mpa）c腐蝕裕度，當(dāng) - c10mm時(shí)，c=3mm解得封頭壁厚2=pdy/(2)+c=0.2515002.3/（21370.8）+3=6.9 mm取整為2=7 mm6.4 發(fā)酵罐個(gè)數(shù)的確定已知年產(chǎn)量為1000噸，一年有300個(gè)工作日，黑曲霉發(fā)酵周期t=48h=2d，其中清理發(fā)酵罐1天，產(chǎn)量為50 g/l，罐壓0.5/2。查相關(guān)資料有：酸性蛋白酶發(fā)酵周期48h，清理及維修發(fā)酵罐時(shí)間為1天，則發(fā)酵總時(shí)間為3天，產(chǎn)量為50g/l,滅菌時(shí)間為5h，發(fā)酵液預(yù)處理收率約為90 %，提取時(shí)的收率約為95%，濃縮干燥

25、收率為90%，裝料系數(shù)為60%一年需放罐的次數(shù)：3003=100次每批次產(chǎn)酸性蛋白酶1000/100=10噸總提取率為：90 %95%90 %=76.95%假設(shè)用一臺(tái)發(fā)酵罐，則發(fā)酵罐的體積v=101000/76.95%/60%/50=433.2 m3選發(fā)酵罐的公稱(chēng)體積為200 m3，則需要發(fā)酵罐3個(gè)，則購(gòu)置4臺(tái)發(fā)酵罐，一臺(tái)備用。6.5 發(fā)酵罐附屬結(jié)構(gòu)的計(jì)算6.5.1 攪拌器攪拌槳葉形式及檔次直接影響到產(chǎn)酸及攪拌功率, 由于罐體矮胖形, 罐徑大,，設(shè)計(jì)采用大槳葉, 低轉(zhuǎn)速。底道槳1900，八彎葉, 中道槳小, 六彎葉, 轉(zhuǎn)速65r.p.m。所以, 采用高通風(fēng), 大槳葉, 低轉(zhuǎn)速攪抖,可降低攪拌功

26、率, 同樣達(dá)到高產(chǎn)酸的效果。槳葉葉片做成可裝拆式, 部件拿進(jìn)罐內(nèi)后組裝, 用不銹螺栓把葉片鎖緊在園盤(pán)上, 給運(yùn)輸安裝帶來(lái)方便, 司時(shí)罐頂人孔可縮小, 開(kāi)600即可。八萬(wàn)葉輪尺寸如下：葉徑d=0.365d=0.3655200=1900mm，盤(pán)徑d=0.62d=0.621900=1175mm，葉片高h(yuǎn)=0.15d=0.151900=280mm，葉片弧長(zhǎng)l=0.4d=0.41900=760mm，風(fēng)管：罐壓：0.02mpa，罐溫：35，培養(yǎng)基量：最大通風(fēng)比1：0.38時(shí)120 m3。液柱高度：h=7.3米，風(fēng)管出口壓p=0.193mpa。貯氣筒壓頭p（供氣最低壓力）：空氣輸送管道阻力0.02mpa，二

27、級(jí)空氣過(guò)濾器阻力0.04mpa。故p=0.02+0.04+0.193=0.253mpa（絕對(duì)壓力）6.5.2手孔、視鏡、溫度計(jì)和工藝接管手孔：由平蓋手孔(jb/t589-1979)或板式平焊法蘭手孔(hg21529-1995)，選用光滑密封面的平蓋手孔apnl，dn250 jb/t589-1979。視鏡：由標(biāo)準(zhǔn)壓力容器視鏡(hg/t21619-21620-1986)或組合式視鏡(hg21505-1992)，選用碳鋼帶頸視鏡ipnl，dn80(hg/t21619-21620-1986)。溫度計(jì)：加強(qiáng)套管溫度計(jì)的選用可以參考生產(chǎn)廠家的產(chǎn)品目錄，這里取公稱(chēng)長(zhǎng)度1 430 mm，配凸面板式平焊管法蘭p

28、no.6 mpa，dn65，hg20593-1997(板式平焊鋼制管法蘭)。工藝接管：(鋼制管法蘭型式、參數(shù)(歐洲體系)。進(jìn)料管口采用573.5無(wú)縫鋼管，配法蘭pno.6，dn50，hg20592-1997出料管口采用764無(wú)縫鋼管，配法蘭pno.6，dn65，hg20592-1997加熱蒸汽進(jìn)口管采用383.5無(wú)縫鋼管，配法蘭pno6，dn32，hg20592-1997冷凝液出口管和壓力表接管都選用323.5無(wú)縫鋼管，配法蘭pno.6, dn25, hg20592-1997安全閥接管采用453.5無(wú)縫鋼管，配法蘭pno.6，dn40，hg20592-1997 6.6發(fā)酵設(shè)備一覽表通過(guò)設(shè)備的工

29、藝設(shè)計(jì)計(jì)算，可列出淀粉酶生產(chǎn)的所有設(shè)備，如表4-1表6-6 1000t/a酸性蛋白酶生產(chǎn)車(chē)間設(shè)備一覽表序號(hào)設(shè)備名稱(chēng)臺(tái)數(shù)規(guī)格與型號(hào)材料1發(fā)酵罐6公稱(chēng)容積200m3,5200mma3鋼2種子罐3公稱(chēng)容積5m3,1400mma3鋼3種子罐分過(guò)濾器340mma3鋼4發(fā)酵罐分過(guò)濾器6300mma3鋼5連消塔13502600mma3鋼6維持罐1v=4m3a3鋼7噴淋冷卻器1f=171.9m2a3鋼8螺旋板換熱器1f=20m2a3鋼9預(yù)處理罐3v=100m3a3鋼10硅藻土過(guò)濾機(jī)3wk500-aa3鋼11真空濃縮鍋1szn1200a3鋼12鹽析罐1v=50m3a3鋼13板框壓濾機(jī)5xyj800a3鋼14物料

30、泵4gnf644機(jī)體鑄鐵15清水泵4jl20-36-g機(jī)體鑄鐵16空氣壓縮機(jī)34l-40/2-3.2a3鋼17空氣貯罐11300mma3鋼18油水分離器1600mma3鋼19絲網(wǎng)分離器1120mma3鋼20熱交換器4jm220qfa3鋼7發(fā)酵車(chē)間的物料衡算7.1 工藝技術(shù)指標(biāo)及基礎(chǔ)數(shù)據(jù)7.1.1 主要技術(shù)指標(biāo)見(jiàn)表7-1表7-1黑曲霉主要技術(shù)指標(biāo)指標(biāo)名稱(chēng)單位指標(biāo)數(shù)指標(biāo)名稱(chēng)單位指標(biāo)數(shù)生產(chǎn)規(guī)模(g)t/a1000產(chǎn)品純度%95年生產(chǎn)天數(shù)(d)d/a300接種量%5產(chǎn)品質(zhì)量(u)iu/mg50發(fā)酵罐裝料系數(shù)(1)%60倒罐率(0)%2.0放罐發(fā)酵單位(um)iu/ml8000發(fā)酵周期(t)d3提取總收

31、率(2)%777.1.2 培養(yǎng)基（g/l）黑曲霉3350發(fā)酵培養(yǎng)基的配方：豆餅粉 3.75, 玉米粉0.625,魚(yú)粉 0.625 ,氯化銨 1.0,氯化鈣 0.5 ,磷酸二氫鈉0.2,豆餅石灰水解液10, ph 5.5. 菌種培養(yǎng)基的配置：查氏培養(yǎng)基nano3 2g，khpo4 1g，kcl 0.5g，mgso4 5g，feso4 0.01g，蔗糖 30g，瓊脂 15g，水 1000ml，ph 自然。7.2 發(fā)酵車(chē)間的物料衡算7.2.1 放罐成熟發(fā)酵液量成熟發(fā)酵液放罐單位為um=8000iu/ml，生產(chǎn)g=1000t酸性蛋白酶發(fā)酵液量為：v0=(gu)/(um298%95%) （7-1）式（7

32、-1）中：g生產(chǎn)規(guī)模u產(chǎn)品質(zhì)量um放罐發(fā)酵單位95%產(chǎn)品的純度98%除去倒罐率2%后的發(fā)酵成功率7.2.2 放罐成熟發(fā)酵液量v0分為三部分組成底料 v1=15696084%=131846.4m3種液量 v2=1569605%=7848m3補(bǔ)料液 v3=15696011%=17265.6m37.2.3 培養(yǎng)基各組分耗用量豆餅粉耗用量： m1=3.75156960=5886玉米粉耗用量： m2=0.625156960=981,魚(yú)粉耗用量： m3=0.625156960=981氯化銨耗用量： m4=1.0156960=1569.6氯化鈣耗用量： m5=0.5156960=7784.8磷酸二氫鈉耗用量

33、： m6=0.2156960=313.92豆餅石灰水解液耗用量：m7=10156960=15696ph 5.57.3物料衡算表表7-3 1000t/a黑曲霉發(fā)酵生產(chǎn)物料衡算表物料名稱(chēng)1000 t/a黑曲霉生產(chǎn)的物料量每周期物料量豆餅粉/玉米粉/魚(yú)粉/氯化銨/氯化鈣磷酸二氫鈉/豆餅石灰水解液/hci58869819811569.67784.8313.9215696據(jù)情況而定588.698.198.1156.96778.4831.392156.96據(jù)情況而定7.4 簡(jiǎn)單的物料衡算放罐發(fā)酵單位um=8000iu/ml，折合成產(chǎn)量為50g/l，折合系數(shù)為k=1.6105 iu/g。本設(shè)計(jì)采用3個(gè)發(fā)酵罐

34、，每個(gè)為200m3，酸性蛋白酶的產(chǎn)量50g/l，提煉總收率為95%，裝料系數(shù)為60%，濃縮干燥收率為90%，產(chǎn)品純度為95%，則：每個(gè)發(fā)酵罐在一個(gè)發(fā)酵周期中酸性蛋白酶的產(chǎn)量為：2005095%60%,90%95%=4873.5那么3個(gè)發(fā)酵罐一年的總產(chǎn)量為：（4873.5300/3）3=1462050=1462.05t在后期損耗合理的情況下，故符合年產(chǎn)1000t的生產(chǎn)要求。8發(fā)酵過(guò)程的工藝控制8.1 發(fā)酵過(guò)程的補(bǔ)料策略中間補(bǔ)料是在發(fā)酵過(guò)程中補(bǔ)充某些營(yíng)養(yǎng)物料、水或產(chǎn)酶促進(jìn)劑，以滿(mǎn)足微生物的代謝活動(dòng)和產(chǎn)酶需要。由于黑曲霉發(fā)酵周期短，故采用補(bǔ)料分批發(fā)酵。在補(bǔ)料分批發(fā)酵中，初始發(fā)酵培養(yǎng)基中玉米粉濃度為3

35、.75g/100ml,從發(fā)酵第3h開(kāi)始恒速（200l/h）補(bǔ)入原培養(yǎng)液，其中玉米粉濃度變?yōu)樵弦菏?7.5g/100ml，每隔1h取樣一次，不合適處加以微調(diào)。8.2 發(fā)酵過(guò)程ph值的控制各種微生物需要在一定的ph環(huán)境中方能正常生長(zhǎng)繁殖。黑曲霉酸性蛋白酶的最適ph是2.52.7，但黑曲霉3350發(fā)酵產(chǎn)生酸性蛋白酶培養(yǎng)基的最初濃度應(yīng)調(diào)節(jié)為4.55.5左右。一般控制在5.5。8.3 發(fā)酵過(guò)程溫度的控制溫度對(duì)微生物的生長(zhǎng)、產(chǎn)物的合成和代謝調(diào)節(jié)有重要作用。溫度變化一方面影響各種酶反應(yīng)的速率和蛋白的性質(zhì)，另一方面影響發(fā)酵液的物理性質(zhì)。不同的菌種有著不同的最適溫度。黑曲霉發(fā)酵溫度控制在30左右最適宜。8.

36、4 發(fā)酵過(guò)程溶氧的控制液體深層培養(yǎng)中大部分微生物在合成蛋白酶時(shí)需要強(qiáng)烈攪拌通風(fēng)。氧是黑曲霉生物合成酸性蛋白酶必須的，通風(fēng)量較大對(duì)產(chǎn)酸性蛋白酶有利，通風(fēng)氣量不足對(duì)黑曲霉菌絲體的生長(zhǎng)無(wú)明顯影響，但對(duì)酶產(chǎn)量有嚴(yán)重的影響，通風(fēng)量對(duì)產(chǎn)酶的影響在培養(yǎng)前期更為明顯，短暫停止通風(fēng)攪拌會(huì)導(dǎo)致酶產(chǎn)量急劇下降。因此發(fā)酵工程中應(yīng)控制好通風(fēng)量，024h為1:0.25,2448h為1:0.5,48h至結(jié)束為1:1.0，發(fā)酵周期為72h左右。8.5發(fā)酵過(guò)程氧載體的控制在發(fā)酵過(guò)程中，在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入正十二烷、全氟化碳，液態(tài)烷烴(為1216碳直鏈烷烴混合物)等氧載體，使培養(yǎng)基中氧傳遞速度加快，產(chǎn)生氣泡少，剪切力小，能明顯提高

37、菌株產(chǎn)酸性蛋白酶的量。8.6發(fā)酵過(guò)程染菌的控制在工業(yè)發(fā)酵中，染菌輕則影響產(chǎn)品的質(zhì)和量、重則倒罐或停產(chǎn)、影響工廠效益。因此要嚴(yán)格要求無(wú)菌操作，種子滅菌要徹底，凈化空氣設(shè)備，操作要慎重，設(shè)備滅菌要徹底。若在前期染菌，應(yīng)重新滅菌；中期染菌，應(yīng)偏離雜菌生長(zhǎng)條件；后期染菌，可提前或及時(shí)放罐?？赡艹霈F(xiàn)的異常發(fā)酵現(xiàn)象：（1）培養(yǎng)基變?。嚎赡苁鞘删w污染或營(yíng)養(yǎng)成分缺乏，也可能是設(shè)備滲漏或滅菌完成后冷凝水過(guò)多；（2）培養(yǎng)基過(guò)濃：會(huì)抑制微生物的生長(zhǎng)，考慮可能是污水污染、滅菌時(shí)水分散失過(guò)多，或微生物生長(zhǎng)速率過(guò)慢；（3）耗糖慢：可能是環(huán)境問(wèn)題，或種子生長(zhǎng)能力降低，檢測(cè)種子是否衰退，發(fā)酵條件是否合適，以及營(yíng)養(yǎng)成分是否全

38、面，尤其注意缺磷；（4）ph值不正常：用緩沖對(duì)來(lái)調(diào)節(jié)，檢查是否染菌，碳氮比是否合適；（5）生長(zhǎng)緩慢：最可能的原因就是營(yíng)養(yǎng)成分不足或細(xì)胞本身出現(xiàn)問(wèn)題。9下游加工下游加工過(guò)程是生物工程的一個(gè)組成部分，是生物化工產(chǎn)品通過(guò)微生物發(fā)酵過(guò)程、酶反應(yīng)過(guò)程或動(dòng)植物細(xì)胞大量培養(yǎng)獲得，以上述發(fā)酵液、反應(yīng)液或培養(yǎng)液分離、精制有關(guān)產(chǎn)品的過(guò)程。9.1 下游加工工藝流程將發(fā)酵液過(guò)濾得到濾液，然后加入單寧酸沉淀，離心得到酸性蛋白酶與單寧酸的復(fù)合物，其后加入相對(duì)分子質(zhì)量為6000的聚乙二醇溶液，攪拌，離心，去濾液，加入糖用活性炭脫色，得到淺黃色酶液，先用乙醇沉淀，后加入硫酸銨鹽析，得到濕晶體，干燥后得到淺色酶，磨粉，制得淺色

39、酶粉，成品加工成工業(yè)用酶制劑。10.總結(jié)和討論通過(guò)本次課程設(shè)計(jì),大量翻閱有關(guān)資料，進(jìn)一步掌握了發(fā)酵工程課程的基本知識(shí)，掌握了發(fā)酵工藝設(shè)計(jì)要點(diǎn)及其相關(guān)工程設(shè)計(jì)要點(diǎn)，鍛煉了自己初步的發(fā)酵工程工藝及設(shè)備的獨(dú)立設(shè)計(jì)能力；培養(yǎng)了綜合運(yùn)用所學(xué)的理論知識(shí)獨(dú)立分析和解決發(fā)酵工程實(shí)際問(wèn)題的實(shí)踐能力。本次課程設(shè)計(jì)中仍然存在許多不足和缺陷,比如說(shuō)提煉總收率不是很高。跟其他發(fā)酵產(chǎn)品相比，酸性蛋白酶的產(chǎn)量不是很高，為了增加酸性蛋白酶的產(chǎn)量，我們還要做出很多努力，利用各種遺傳學(xué)技術(shù)手段改變生產(chǎn)菌株的特性，或者通過(guò)過(guò)程控制法控制乳鏈菌肽的發(fā)酵過(guò)程來(lái)進(jìn)一步提高乳鏈菌肽的產(chǎn)量，以滿(mǎn)足廣大民眾對(duì)乳鏈菌肽的需求。在本次設(shè)計(jì)過(guò)程中賈

40、萬(wàn)利老師和多位老師給予了大力指導(dǎo)和幫助和支持，這才使得我能夠順利地完成課程設(shè)計(jì)。在此，我對(duì)課程設(shè)計(jì)所有老師表示誠(chéng)摯的感謝！ 參考文獻(xiàn)1趙瑞香，孫俊良.發(fā)酵乳制品j.中國(guó)乳品工業(yè),1999,27(06):26-28.2陳正行，狄濟(jì)樂(lè)編著.食品添加劑新產(chǎn)品與新技術(shù).南京：江蘇科學(xué)技術(shù)出版社，,2002,8.3吳思芳，等.生物工程工廠設(shè)計(jì)概論.北京：中國(guó)輕工業(yè)出版社，2009,7.4華南工學(xué)院等.發(fā)酵工程與設(shè)備.輕工業(yè)出版社，1985,10.5潘紅良，郝俊文.過(guò)程設(shè)備機(jī)械設(shè)計(jì)m.杭州:華東理工大學(xué)出版社，2006,4.6 俞俊棠，唐孝宣，鄔行彥.新編生物工藝學(xué)（上、下冊(cè)）.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，20

41、057陳國(guó)豪.生物工程設(shè)備.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，20058岑沛霖，蔡謹(jǐn).工業(yè)微生物學(xué).北京：化學(xué)工業(yè)出版社，20009華南工學(xué)院等.發(fā)酵工程與設(shè)備.北京：輕工業(yè)出版社，198510劉國(guó)詮，生物工程下游技術(shù).北京：化學(xué)工業(yè)出版社，200311賈樹(shù)彪，李盛賢.新編酒精工藝學(xué).北京：化學(xué)工業(yè)出版社，200412陳寧，王健，懷麗華等.酶工程m.中國(guó)輕工業(yè)出版社，200513賀小賢.生物工藝原理m.化學(xué)工業(yè)出版社，200314梅樂(lè)和，姚善涇，林東強(qiáng).生化生產(chǎn)工藝學(xué)m.科學(xué)出版社，199915尹先清.化工設(shè)計(jì)m .石油工業(yè)出版社，200616鄒東恢，生物加工設(shè)備選型與應(yīng)用m .化學(xué)工業(yè)出版社，20091

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43、qa9wkxfyeq!djs#xuyup2knxprwxma&ue9aqgn8xp$r#͑gxgjqv$ue9wewz#qcue%&qypeh5pdx2zvkum>xrm6x4ngpp$vstt#&ksv*3tngk8!z89amywpazadnu#kn&muwfa5uxy7jnd6ywrrwwcvr9cpbk!zn%mz849gxgjqv$ue9wewz#qcue%&qypeh5pdx2zvkum>xrm6x4ngpp$vstt#&ksv*3tngk8!z89amywpazadnu#kn&muwfa5uxgjqv$ue9wewz#qcue%&qypeh5pdx2zvkum&g

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54、azadnu#kn&muwfa5uxy7jnd6ywrrwwcvr9cpbk!zn%mz849gxgjqv$ue9wewz#qcue%&qypeh5pdx2zvkum>xrm6x4ngpp$vstt#&ksv*3tngk8!z89amywv*3tngk8!z89amywpazadnu#kn&muwfa5uxy7jnd6ywrrwwcvr9cpbk!zn%mz849gxgjqv$u*3tngk8!z89amywpazadnu#kn&muwfa5uxy7jnd6ywrrwwcvr9cpbk!zn%mz84!z89amv$ue9wewz#qcue%&qypeh5pdx2zvkum>xrm6x4ngpp$vstt#&ksv*3tngk8!z89amywpazadnu#kn&muwfa5uxgjqv$ue9wewz#qcue%&qypeh