薄層色譜實(shí)驗(yàn)

1、薄層色譜（TCL實(shí)驗(yàn)、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、掌握薄層色譜操作技巧2、了解薄層色譜的基本原理和應(yīng)用二、實(shí)驗(yàn)原理1、原理薄層色譜是一種微量分析的分離過程， 它將樣品點(diǎn)在以玻璃 板或鋁、 塑料等片材為載體的多孔吸附劑薄層的固定相上， 利用 流動(dòng)相在特定的展開室中將混合物中的組份推移到不同距離處， 在色譜展開整個(gè)過程中，樣品的成份受到正反不同的力的作用。（1） 流動(dòng)相利用毛細(xì)管力帶著樣品穿過固定相。（2） 樣品與固定相的相互作用是指組份在移行過程中由于偶 極-（誘導(dǎo)） - 偶極相互作用，氫鍵和范德華力的作用而產(chǎn)生不同 程度的延緩、吸附、分散、離子交換和絡(luò)合等分離機(jī)理。由于樣品組份與流動(dòng)相和固定相之間的相互作用力

2、程度不 同，整個(gè)毛細(xì)管流動(dòng)過程中分離運(yùn)動(dòng)都在進(jìn)行?；谶@點(diǎn)， TLC 系統(tǒng)（流動(dòng)相和固定相）必須與樣品很好地匹配。用顯色試劑處理， 許多組份可在日光或紫外燈光下檢視。 色 譜可用肉眼或使用光密度計(jì)和照相機(jī)記錄或影像系統(tǒng)方法來評 價(jià)。2、薄層色譜的用途1）化合物的定性檢驗(yàn)通過與已知標(biāo)準(zhǔn)物對比的方法進(jìn)行未知物的鑒定。在條件一致的情況下，純化合物在薄層色譜中呈現(xiàn)一定的移動(dòng)距離，稱比移值（R值）。利用薄層色譜法可鑒定化合物的純度或確定兩種 性質(zhì)相似化合物是否為同一種物質(zhì)。影響比移值的因素很多，如薄層的厚度，吸附劑顆粒的大小， 酸堿度、活性、外界溫度和展開劑純度、組成、揮發(fā)度等。所以 要獲得比移值重現(xiàn)性

3、就比較困難。為此，在測定某一式樣時(shí)，最 好用對照品和樣品同時(shí)對照進(jìn)行。 -1d2di：2中心2）快速分離少量物質(zhì)（幾到幾十 ug，甚至）3）跟蹤反應(yīng)進(jìn)程，在進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)時(shí)，常利用薄層色譜觀 察原料斑點(diǎn)的逐步消失，來判斷反應(yīng)是否完成。4）化合物純度的檢驗(yàn)（只出現(xiàn)一個(gè)斑點(diǎn)，且無脫尾現(xiàn)象， 為純物質(zhì)）3、主要操作步驟薄層板的制備；薄層板的活化；薄層板色譜展開；薄層色譜 顯色與分析。四、薄層色譜操作技巧1、手工自制板玻璃板的要求： 用于制備薄層板的玻璃板要求 表面光潔、 平 整，最好使用厚薄12mm勺優(yōu)質(zhì)平板玻璃，普通窗玻璃一般不宜 用于制作薄層板， 玻璃板 需洗凈至不掛水， 晾干，貯存于干燥潔 凈處

4、備用 。玻璃板反復(fù)使用時(shí)，應(yīng)注意經(jīng)常用洗液及堿液清洗， 保持玻璃板面勺光潔是保證薄層板質(zhì)量勺最基本要求。制作方法：除另有規(guī)定外，將 1 份吸附劑加適量勺水（如 1 份硅膠G一般加3份水），在研缽中用研杵 沿一個(gè)方向小心研磨 至成均勻勺有適當(dāng)粘稠度勺膠漿 ，立即傾入涂布器中， 均勻地向 前推進(jìn)涂布在玻璃板上， 或按照不同涂布器勺規(guī)定操作涂布， 涂 布好勺薄層板于室溫下在水平臺上晾干，再在規(guī)定勺溫度 （ 一般 為105C110C）下活化約30分鐘，貯于干燥器中備用。薄層板 勺厚度一般為 0.5mm.。商品化供應(yīng)勺預(yù)制板和高效板板的尺寸一般有 20x 20cm, 10 x 20cm 20x 10cm

5、, 10X 10cm2、TLC/HPTLC板的預(yù)洗及活化一般來說 色譜板應(yīng)用溶劑如氯仿 - 甲醇（8:2） 甚至用更強(qiáng) 的洗脫溶劑的混合物進(jìn)行預(yù)洗。 具體操作可通過空白色譜展開來 實(shí)現(xiàn)。色譜板預(yù)洗完后，應(yīng)在105 C加熱1小時(shí)進(jìn)行干燥，再在 室溫下置放至少 2 小時(shí)（需采取保護(hù)措施以防止實(shí)驗(yàn)室空氣中的污染物重新附著在其上面，如放置在空的干燥器中）3、樣品點(diǎn)樣點(diǎn)狀點(diǎn)樣和條帶狀點(diǎn)樣每次點(diǎn)樣前，TLC/HPTLC板應(yīng)在正常光線下和紫外燈下用肉 眼檢查薄層的損傷情況和雜質(zhì)，只有無損傷、清潔的 TLC/HPTLC 板方可使用。樣品可進(jìn)行點(diǎn)狀或條帶狀點(diǎn)樣。要想獲得最佳的薄層分辨率，必須保證移行方向中的起點(diǎn)

6、要小，常規(guī)的TLC薄層點(diǎn)狀點(diǎn)樣每次點(diǎn)至 5 微升。點(diǎn)樣量較大的樣品可使用自動(dòng)化裝置點(diǎn)樣， 噴 霧成條帶狀是一種可以點(diǎn)樣量大而同時(shí)又能促成最有效分離的 點(diǎn)樣方法。在常規(guī)操作過程中，人工點(diǎn)樣一般使用 微量毛細(xì)管（0.5/1/2/3 和5卩I ）,點(diǎn)樣時(shí)毛細(xì)管必須完全充滿和完全排空， 要以垂直方向小心接觸TLC/HPTLC板面，不要損傷薄層，受損的 薄層會導(dǎo)致溶劑不規(guī)律地流動(dòng)而在色譜上產(chǎn)生失真的TLC譜帶。樣品點(diǎn)樣位置起點(diǎn)下緣的最小距離 b 取決于溶劑量。 兩個(gè)起點(diǎn)之間的距離 c 必須令平行移行的主成份不會相互觸及。點(diǎn)狀點(diǎn)樣時(shí)原點(diǎn)的直 徑應(yīng)小于或等于3m（高效板原點(diǎn)的直徑應(yīng)更?。?，條帶的長度d 由點(diǎn)

7、樣樣品體積或樣品的種類和相對于板的尺寸點(diǎn)樣的數(shù)目來 決定。到板側(cè)邊的距離 a 必須足夠大以避免分離區(qū)失真變形。4、層析展開室4.1.1 直立式雙槽展開室具有節(jié)省溶劑、便于預(yù)平衡、可控 制展開箱內(nèi)的濕度等優(yōu)點(diǎn)。4.1.2 水平展開室可以從薄層板的兩側(cè)向中間水平地展開， 這樣可使一塊薄層板所承受的樣品個(gè)數(shù)比常規(guī)上行展開的薄層 板增加一倍。4.1.3自動(dòng)展開室（AMD）可使用五種溶劑對同一薄層進(jìn)行多 次展開，自動(dòng)控制預(yù)飽和、展開方式、展開距離和干燥條件，分 離效率比傳統(tǒng)方式提高三倍（可在80mm之內(nèi)分離40種成分），符合GLP/GM要求。溶劑使用的溶劑必須是“分析純”或“色譜純” ，溶劑組成采用 體

8、積量比（如正丁醇/冰乙酸/水=4 ： 1 ： 1，V/V/V），或者絕對量 （女口 18ml甲苯+2ml甲醇）。其總量應(yīng)足以使 TLC/HPTLC板的浸 入深度約為5mm展開劑要求新鮮配制，不要多次反復(fù)使用，如 需分層，則按要求放置分層后取需要的一相（上層或下層） ，備 用。五、本實(shí)驗(yàn)操作內(nèi)容山楂有效組分熊果酸含量的鑒定。吸附劑 / 快板：硅膠 G3g， %羧甲基纖維素鈉。供試品：取山楂，加乙酸乙酯 2ml，浸澤24h，取上清液備對照品：加甲醇制備成1ml含有1mg的溶液點(diǎn)樣：供試品溶液點(diǎn)樣 4ul ，對照品溶液點(diǎn)樣 2ul展開劑：甲苯 / 乙酸乙酯 / 甲酸（ 20： 4：）。 顯色劑：硫酸乙醇溶液（ 310%）顯色操作：噴顯色劑后，在 80 C加熱數(shù)分鐘，至斑點(diǎn)顯色清晰為止，置日光或紫外燈（365nm下檢測。六、實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)1、載玻板干凈且不被手污染，吸附劑在玻板上分布均勻平 整；2、 點(diǎn)樣不能戳破薄層面板，各樣點(diǎn)間距11.5cm，點(diǎn)樣直 徑應(yīng)不超過 2mm。3、展開時(shí)，不讓