超聲波輔助提取熊貓豆蛋白及其功能性質(zhì)的研究

1、農(nóng)業(yè)與生物技術學院生物科學專業(yè) 2012 屆本科生畢業(yè)論文 1 目目 錄錄 河西學院本科生畢業(yè)論文（設計）誠信聲明.2 河西學院本科生畢業(yè)論文（設計）開題報告.3 摘 要.6 關鍵詞.6 引言.7 1 材料與儀器 .7 1.1 實驗材料與試劑 .7 1.2 主要儀器設備 .7 2 方法 .7 2.1 蛋白質(zhì)標準曲線制作 .7 2.2 水溶性蛋白的提取工藝 .7 2.3 熊貓豆蛋白的等電點的測定.8 2.4 熊貓豆蛋白提取工藝的確定 .8 2.5 水溶性蛋白得率計算 .8 2.6 蛋白質(zhì)功能性質(zhì)研究方法 .8 3 結(jié)果與分析 .10 3.1 單因素試驗結(jié)果 .10 3.2 熊貓豆蛋白提取工藝的優(yōu)

2、化 .12 3.3 熊貓豆水溶性蛋白質(zhì)的功能特性 .16 4 結(jié)論 .20 參考文獻.20 致 謝.22 農(nóng)業(yè)與生物技術學院生物科學專業(yè) 2012 屆本科生畢業(yè)論文 2 河西學院本科生畢業(yè)論文（設計）誠信聲明 本人鄭重聲明：所呈交的本科畢業(yè)論文（設計） ，是本人在指導老師 的指導下，獨立進行研究工作所取得的成果，成果不存在知識產(chǎn)權爭議， 除文中已經(jīng)注明引用的內(nèi)容外，本論文不含任何其他個人或集體已經(jīng)發(fā) 表或撰寫過的作品成果。對本文的研究做出重要貢獻的個人和集體均已 在文中以明確方式標明。本人完全意識到本聲明的法律結(jié)果由本人承擔。 作者簽名： 二O一二年六月十日 農(nóng)業(yè)與生物技術學院生物科學專業(yè) 2

3、012 屆本科生畢業(yè)論文 3 河河西西學學院院本本科科生生畢畢業(yè)業(yè)論論文文（設設計計）開開題題報報告告 論論文文題題目目超聲波輔助提取熊貓豆蛋白及其功能性質(zhì)的研究 學學生生姓姓名名吳瀟瀟所所屬屬學學院院 農(nóng)業(yè)與生物 技術學院 專專業(yè)業(yè)生物科學年年級級08級 指指導導教教師師張喜峰所所在在單單位位河西學院職職稱稱講師開開題題日日期期2012.01 選選題題的的根根據(jù)據(jù)： 熊貓豆又稱貓眼豆，豆科，一年生植物，是我國河西走廊的珍稀名貴彩色豆種。 熊貓豆外型特殊，它的半面（臍背面）是咖啡色，半面是白色，臍為白色。因豆皮上 有酷似熊貓眼睛、鼻子、腳形狀的斑點，因此被稱為“熊貓豆”。由于熊貓豆形狀奇趣，

4、異常美觀，所以既有工藝品價值，又可供觀賞，又香味迷人、口感獨特，別有風味。 一般鮮炒食，味同四季豆。老熟的豆粒，煮、炒、煎均酥松可口。它的適應性較強， 具有耐干旱、耐低溫、耐貧瘠等特點，全國各地均可種植。 此外，熊貓豆還具有極高的經(jīng)營養(yǎng)價值。熊貓豆中含有大量蛋白質(zhì)，高達 34.5%，是豆類中僅次于大豆、四棱豆和羽扇豆的高蛋白作物。熊貓豆氨基酸種類齊 全，人體中不能合成的 8 種必需氨基酸中，除色氨酸和蛋氨酸含量稍低外，其余 6 種 含量均高，尤以賴氨酸含量豐富。 目前，有關熊貓豆蛋白提取及其性質(zhì)研究較少，但是人們已經(jīng)越來越認識到熊貓 豆蛋白質(zhì)的開發(fā)利用的廣闊前景。因次，以熊貓豆為原料，通過正交

5、實驗對比研究相 關因素對熊貓豆蛋白質(zhì)提取率的影響，并測定其功能性，不僅可以為熊貓豆的深加工 提供理論依據(jù)，而且提高其附加值，為資源的綜合利用提供新的途徑。 農(nóng)業(yè)與生物技術學院生物科學專業(yè) 2012 屆本科生畢業(yè)論文 4 主要內(nèi)容、基本要求及其主要的研究方法：主要內(nèi)容、基本要求及其主要的研究方法： （一）主要內(nèi)容 采用超聲波法提取熊貓豆蛋白，研究不同 pH、料液比、超聲時間、溫度對蛋白 提取率的影響，通過 central combination design 設計確定最佳提取工藝，并進行蛋白 質(zhì)性質(zhì)的初探。 （二）基本要求 1 查閱相關的資料時要全面，并做好詳細的整理 2 在試驗時的各項指標測定

6、時要準確、認真 3 對數(shù)據(jù)的處理要科學、嚴謹，運用統(tǒng)計學軟件進行 （三）主要研究方法 1 制作蛋白標準曲線 2 單因素實驗 1）pH 對熊貓豆蛋白得率的影響 2）料液比對熊貓豆蛋白得率的影響 3）超聲時間對熊貓豆蛋白得率的影響 4）溫度對熊貓豆蛋白得率的影響 3 CCD組合設計 4 蛋白性質(zhì)的初探 1）熊貓豆蛋白的持水性 2）熊貓豆蛋白吸油性 3）熊貓豆蛋白的溶解度 4）熊貓豆蛋白的乳化性及乳化穩(wěn)定性 論文安排和采取的主要措施：論文安排和采取的主要措施： 完成期限為 2012 年 5 月 25 號，采取的主要措施有：采用超聲波法提取熊貓豆蛋 白，研究不同 pH、料液比、溫度、超聲時間對熊貓豆蛋

7、白得率的影響，通過中心組 合設計確定最佳提取工藝，并測定熊貓豆蛋白的持水性、吸油性、溶解度、乳化性及 乳化穩(wěn)定性。 農(nóng)業(yè)與生物技術學院生物科學專業(yè) 2012 屆本科生畢業(yè)論文 5 主要參考資料和文獻：主要參考資料和文獻： 馮若(2003).超聲空化和超聲治療J.自然雜志,25 (6):311-314 高峰,亞莉,劉靜波等(2010).超聲波提取北冬蟲夏草多糖的工藝.食品研究與開發(fā),31(6):107-110 郭孝武(1998).一種提取中草藥化學成分的方法超聲提取法.天然產(chǎn)物研究與開發(fā),11(3):37-40 郭興鳳,陳定剛,閆秋麗(2008).超聲輔助提取黑豆蛋白質(zhì)的研究.河南工業(yè)大學學報(

8、自然科學版),29(4):10-13 黃群,麻成金,孫樹國等(2009).超聲波輔助提取蠶豆蛋白及功能特性研究.食品與發(fā)酵工業(yè),35(8):179-186 李鳳林,李應華(2009).超聲波法提取白靈菇多糖的工藝研.食用菌,(3):74-75 栗星,奚春蕊,王曉琳等(2010).超聲波提取桑葚果渣蛋白質(zhì)工藝研究.農(nóng)業(yè)工程技術(農(nóng)產(chǎn)品加工業(yè)), (12):30-31 羅登林,丘泰球,盧群(2005).超聲波技術在油脂工業(yè)中的研究進展.糧油加工與食品機械, (3):48-50 石春紅,鄭有飛等 (2008).超聲波法提取黃芩中總蛋白質(zhì)的研究 . 安徽農(nóng)業(yè)科學 , 6(17):7287-7289 張

9、佰清,林子木,樸海燕(2011).超聲波輔助提取芝麻中芝麻素的工藝條件研究.沈陽農(nóng)業(yè)大學學報,42(2):223-226 張根生,岳曉霞,李繼光,陳林林(2006).大豆分離蛋白乳化性影響因素的研究.食品科學,27(7):48-51 張濤,江波,王璋(2005).鷹嘴豆分離蛋白質(zhì)的功能性質(zhì).食品科技,(4):19-22 指導教師意見： 簽 名： 年 月 日 教研室 意見 負責人簽名： 年 月 日 學 院 意 見 負責人簽名： 年 月 日 農(nóng)業(yè)與生物技術學院生物科學 2012 屆本科生畢業(yè)論文 超聲波輔助提取熊貓豆蛋白及其功能性質(zhì)的研究超聲波輔助提取熊貓豆蛋白及其功能性質(zhì)的研究 摘摘 要：要：利

10、用響應面分析超聲波輔助提取熊貓豆水溶性蛋白質(zhì)工藝條件，并對其功能 性質(zhì)進行了研究。確定了最佳提取工藝條件為：pH 6，溫度 39 ，超聲時間 22min，料液比 1:12。在此條件下熊貓豆水溶蛋白得率為 19.97% 。結(jié)果表明：遠離 其等電點時，熊貓豆蛋白具有良好的持水性、溶解度、乳化性及乳化穩(wěn)定性；熊貓豆 蛋白的持水性和溶解度與 NaCl 濃度（0-1.0mol/L）呈正相關，而過高的離子強度 （NaCl 濃度高于 0.8-1.0mol/L）會使熊貓豆蛋白的乳化性和乳化穩(wěn)定性下降；蔗糖的 加入會增加熊貓豆蛋白的持水性，但會降低其溶解度，對熊貓豆蛋白的乳化性和乳化 穩(wěn)定性影響不大；熊貓豆蛋白

11、的吸油性與溫度（20-40）呈正相關，持水性、溶解 度、乳化性及乳化穩(wěn)定性于 30時最好。 關鍵詞：關鍵詞：熊貓豆；水溶性蛋白；正交實驗；功能性質(zhì) Study on the Panda Bean Protein Extraction and Functional Properties of Proteins from Panda Bean by Ultrasonic Method Abstract In order to get better water-soluble proteins from panda bean extractions, Orthogonal experimental

12、design was carried out to determine the optimum extraction conditions, and further more, some functional properties of the water-soluble proteins from Panda beans were anlaysed. The optimum extraction conditions were: pH 6, temperature 39, extraction time 22min, solid to liquid ratio of 1:12. Under

13、these conditions, the maximum yield of water-soluble proteins from panda bean is 19.97%. Results indicated that water-soluble proteins from panda bean showed well stablility in water-holding capacity, emulsifying capacity and emulsion stability at pH far away from isoelectric point. The water- holdi

14、ng capacity and solubility of panda bean extracted proteins had respective positive correlation with NaCl concentration within the range of 0-1.0 mol/L. The highest emulsifying capacity was observed at 0.8 mol/L and the highest emulsion stability was at 0.6 mol/L, and a higher level of NaCl concentr

15、ation resulted in a remarkable decline in both of emulsifying capacity and emulsion stability of extracted panda bean proteins; as increased sucrose concentrations added the water-holding capacity, and decreased water solubility of the extraction, but little changes in the emulsifying capacity and e

16、mulsion stability were observed; the oil-absorbing capacity of panda bean proteins were positively correlated with temperature (20-40), 30 results the best water-holding capacity, solubility, emulsifying capacity and emulsion stability of panda bean proteins. Keywords: Panda bean; Water-soluble prot

17、ein; Orthogonal; Functional properties 農(nóng)業(yè)與生物技術學院生物科學專業(yè) 2012 屆本科生畢業(yè)論文 7 引言引言 熊貓豆又稱貓眼豆，豆科，一年生植物，是我國河西走廊的珍稀名貴彩色豆種。 熊貓豆中含有大量蛋白質(zhì)，高達 34.5%，是豆類中僅次于大豆、四棱豆和羽扇豆的高 蛋白作物。熊貓豆氨基酸種類齊全，人體中不能合成的 8 種必需氨基酸中，除色氨酸 和蛋氨酸含量稍低外，其余 6 種含量均高，尤以賴氨酸含量豐富（張勇 2007）。 目前，有關熊貓豆蛋白提取及其性質(zhì)研究較少，但是人們已經(jīng)越來越認識到熊貓 豆蛋白質(zhì)的開發(fā)利用的廣闊前景。因次，以熊貓豆為原料，通過響應

18、面分析對比研究 相關因素對熊貓豆蛋白質(zhì)提取率的影響，并對其功能特性進行初步探索，不僅可以為 熊貓豆的深加工提供理論依據(jù)，而且提高其附加值，為資源的綜合利用提供新的途徑。 1 材料與儀器材料與儀器 1.1 實驗材料與試劑實驗材料與試劑 熊貓豆：張掖市新樂超市場購買，大小適中、顆粒飽滿；食用油；牛血清白蛋白； 無水乙醇；鹽酸；氫氧化鈉；考馬斯亮藍 G-250；磷酸二氫鈉；磷酸氫二鈉；氯化鈉； 蔗糖；十二烷基磺酸鈉。 1.2 主要儀器設備主要儀器設備 722N 可見光分光光度計；萬能粉碎機 ；L-203 電子天平，梅特勒 -托利多儀器 （上海）有限公司；SB120DT 超聲波清洗機 ，寧波新芝生物科

19、技股份有限公司； 可見光分光光度計，722 型上海光譜儀器有限公司； LNG-798A 離心機，太倉市 華利達實驗設備有限公司； DKB-501 數(shù)碼超級恒溫水浴鍋； DHG-9101-1 型電熱 恒溫干燥箱，上海光譜儀器有限公司 。 2 方法方法 2.1 蛋白質(zhì)標準曲線制作蛋白質(zhì)標準曲線制作 準確稱取牛血清白蛋白 0.012mg，加入 0.15g NaCl，用少量蒸餾水溶解定容 至 100mL，配制 120g/mL 的牛血清白蛋白質(zhì)標準液，分別精確吸取 120ug/mL 的牛血清白蛋白原液 0.20、0.40、0.60、0.80、1.00mL 用蒸餾水全部稀釋至 1mL，然后分別加入 5ml

20、 考馬斯亮藍溶液，混合均勻，于 25的恒溫水浴鍋中 保溫 10min，冷水浴中冷卻后，立即于 595nm 處測定吸光度。以 1mL 蒸餾水代 替樣品液，加入 5mL 考馬斯亮藍溶液，其余操作同上，做空白對照 （劉葉青 2007）。以試管中標準蛋白的總量 （ug）為橫坐標，相應的吸光度值 （A）為縱 坐標制作標準曲線圖，并做線性回歸， 得回歸方程為： 農(nóng)業(yè)與生物技術學院生物科學專業(yè) 2012 屆本科生畢業(yè)論文 8 Y=0.0045X+0.0249，R2=0.9691。 2.2 水溶性蛋白的提取工藝水溶性蛋白的提取工藝 熊貓豆去雜粉碎稱重緩沖液浸提超聲離心取上清測蛋白含量 計算蛋白得率（常學東 2

21、004） 。 2.3 熊熊貓貓豆豆蛋蛋白白的的等等電電點點的的測測定定 分別配制不同 pH值的一定濃度的熊貓豆蛋白溶液， 3000r/min離心30min，取 上清液測定蛋白含量，蛋白濃度最低時的 pH值即為等電點。 2.4 熊熊貓貓豆豆蛋蛋白白提提取取工工藝藝的的確確定定 2.4.1 pH 對熊貓豆蛋白得率的影響對熊貓豆蛋白得率的影響 以 pH 為考察因素，分別選取 4，5，6，7，8 其他條件為，溫度 30，超聲時間 30min，料液比 1:10，通過計算不同 pH 條件下的蛋白得率，確定最佳的提取 pH 值 （黃群，麻成金等 2009）。 2.4.2 料液比對熊貓豆蛋白得率的影響料液比對

22、熊貓豆蛋白得率的影響 料液比為考察因素，分別選取料液比 1:5，1:10，1:15，1:20，1:25，1:30，其他 條件為 pH6，溫度 30，超聲時間 30min，通過計算不同料液比條件下的蛋白得率， 確定最佳的提取料液比（張佰清，林子木等 2011）。 2.4.3 超聲時間對熊貓豆蛋白得率的影響超聲時間對熊貓豆蛋白得率的影響 以超聲時間為考察因素，分別選取 10 min，15 min，20 min，25 min，30 min， 其他條件為 pH6，溫度 30料液比 1:15，通過計算不同超聲時間下的蛋白得率，確 定最佳的提取超聲時間（蔡金星，劉秀鳳等 2007）。 2.4.4 溫度對熊

23、貓豆蛋白得率的影響溫度對熊貓豆蛋白得率的影響 以溫度為考察因素，分別選取 20，25，30，35，40，其他條件為， pH6，超聲時間 25min，料液比 1:15，通過計算不同溫度條件的下蛋白得率，確定最 佳的提取溫度（劉艷榮，原超等 2010）。 2.5 水水溶溶性性蛋蛋白白得得率率計計算算 蛋白得率的測定：考馬 斯亮藍法 G-250（劉葉青 2007） 分離蛋白質(zhì)量 （g） 蛋白得率(%)= 熊貓豆粉質(zhì)量 （g） 100% 農(nóng)業(yè)與生物技術學院生物科學專業(yè) 2012 屆本科生畢業(yè)論文 9 2.6 蛋白質(zhì)功能性質(zhì)研究方法蛋白質(zhì)功能性質(zhì)研究方法 2.6.1 蛋白質(zhì)在不同蛋白質(zhì)在不同 pH 值、

24、鹽濃度、蔗糖質(zhì)量濃度、溫度條件下的持水性測定值、鹽濃度、蔗糖質(zhì)量濃度、溫度條件下的持水性測定 用0.1mol/L的鹽酸和NaOH溶液調(diào)節(jié)0.01mol/L的NaH2PO4溶液，配制不同pH值的 溶液；用1.0mol/L的NaCl溶液配制不同濃度的鹽溶液；稀釋5g/100mL的蔗糖溶液配制 不同質(zhì)量濃度的蔗糖溶液。向帶刻度的離心管中分別加入以上各溶液1mL及不同溫度 的蒸餾水1mL，加入提取所得熊貓豆蛋白質(zhì)粉末0.1g，攪拌均勻后放置30min使之充 分吸水，之后3000r/min 離心15min，棄上清取沉淀，冷凍干燥后稱量蛋白質(zhì)的質(zhì)量 （徐志宏 2006；王芳2010）。 蛋白質(zhì)持水性(g/

25、g)=(M2-M1)/M0 式中：M0分離蛋白樣品的質(zhì)量，g； M1離心管和干燥樣品的總質(zhì)量，g； M2離心后離心管和沉淀的總質(zhì)量，g。 2.6.2 蛋白質(zhì)在不同溫度條件下的吸油性測定蛋白質(zhì)在不同溫度條件下的吸油性測定 稱取 0.1g 提取的熊貓豆蛋白粉末置于帶刻度的離心管中，加入 1mL 的食用油， 混勻 5min，在不同溫度下靜置 30min，然后在 3000r/min 下離心 15min，去除游離油， 冷凍干燥后稱量蛋白質(zhì)的質(zhì)量（杜蕾蕾，郭濤等 2009）。 蛋白質(zhì)吸油性(g/g)=(M2-M1)/M0 式中：M0分離蛋白樣品的質(zhì)量，g； M1離心管和干燥樣品的總質(zhì)量，g； M2離心后離

26、心管和沉淀的總質(zhì)量，g。 2.6.3 蛋白質(zhì)在不同蛋白質(zhì)在不同 pH 值、值、NaCl 濃度、蔗糖質(zhì)量濃度、溫度條件下的溶解度測定濃度、蔗糖質(zhì)量濃度、溫度條件下的溶解度測定 同 2.6.1 節(jié)方法配制不同 pH 值、NaCl 濃度、蔗糖質(zhì)量濃度、溫度的溶液，向帶 刻度的離心管中分別加入以上各溶液 1mL 及不同溫度的蒸餾水 1mL，加入 0.1g 熊貓 豆蛋白粉末，攪拌均勻后放置 30min 使之充分吸水，之后 3000r/min 離心 15min，用 考馬斯亮藍法測定其吸光度，得熊貓豆蛋白樣品的溶解度（王芳 2010）。 2.6.4 蛋白質(zhì)在不同溶液環(huán)境下的乳化性（蛋白質(zhì)在不同溶液環(huán)境下的乳

27、化性（EC）及乳化穩(wěn)定性（）及乳化穩(wěn)定性（ES）測定）測定 同 2.6.1 節(jié)方法配制不同 pH 值、NaCl 濃度、蔗糖質(zhì)量濃度、溫度的溶液，各取 10mL，加入 0. 1g 熊貓豆蛋白質(zhì)粉末，于 20左右在超聲波清洗機中均質(zhì) 10min，放 置 30min，3000r/min 離心 15min 后，取上清液 2 mL，加入 2mL 食用油，再同種方法 均質(zhì) 2min，準確吸取底部乳狀液 0.1mL，立即加入 25mL 0.1%的 SDS 溶液，搖勻后， 以 0.1% SDS 溶液做對照，于波長 500nm 處測定吸光度。 農(nóng)業(yè)與生物技術學院生物科學專業(yè) 2012 屆本科生畢業(yè)論文 10 E

28、C/%=A500nm100 將均質(zhì)后的乳液置于 50的水浴中靜置 30min，同種方法測定其 EC 值，記為 EC50 （張濤，江波等 2005）。 ES/%= (EC50/ EC)100 3 結(jié)果與分析結(jié)果與分析 3.1 單因素試驗結(jié)果單因素試驗結(jié)果 3.1.1 pH 對蛋白得率的影響對蛋白得率的影響 圖 1 為料液比 1:10，超聲時間 30min，溫度 30時不同 pH 對熊貓豆蛋白得率的 影響。 蛋白質(zhì)在靜電狀態(tài)時顆粒之間的靜電斥力最小，因而溶解度也最小，各種蛋白質(zhì) 的等點電有差別，可利用調(diào)節(jié)溶液的 pH 值遠離某一蛋白質(zhì)的等電點使之溶解。從圖 1 可以看出,隨著 pH 增大蛋白質(zhì)得率

29、逐漸增大，但在 pH6 時達到最大隨后逐漸減少， 可能是較大 pH 會使蛋白質(zhì)變性，蛋白質(zhì)得率反而降低。熊貓豆蛋白質(zhì)在 pH6 左右得 率最大，所以在后續(xù)的試驗中都采用調(diào) pH 值為 6 來提取蛋白質(zhì)（常學東 2004）。 3.1.2 料液比對蛋白得率的影響料液比對蛋白得率的影響 圖 2 為 pH 6，超聲時間 30min，溫度 30時不同料液比對熊貓豆蛋白得率的影 響。 圖圖 1 pH 對熊貓豆蛋白得率的影響對熊貓豆蛋白得率的影響 Fig. 1 Effect of pH on extraction yield of panda bean proteins 5.0 7.5 10.0 12.5

30、15.0 45678 pH 蛋白得率/% 6 8 10 12 14 16 18 1： 5 1：10 1：15 1：20 1：25 1：30 料液比 蛋白得率/% 農(nóng)業(yè)與生物技術學院生物科學專業(yè) 2012 屆本科生畢業(yè)論文 11 料液比過大，濃縮制備困難；過小，不能保證蛋白質(zhì)全部溶出（吳曉紅 2010）。 從圖 2 可以看出，當料液比在 1:5 到 1:10 時蛋白質(zhì)得率較低，當料液比為 1:15 時蛋 白質(zhì)得率最高，超過 1:15 時出現(xiàn)緩慢下降。這是因為提取過程中熊貓豆蛋白不斷溶 解到 提取液中，增大料液比，降低提取試劑中熊貓豆蛋白濃度，使更多的蛋白質(zhì)釋放出來， 提高提取率；料液比高于 1:

31、15 時，由于提取液 中熊貓豆蛋白濃度與 熊貓豆組織中 蛋白濃度相當 ，蛋白得率達到最大； 在超聲波功率恒定的情況下，料液比 過高 會使超聲波對 熊貓豆組織的超聲空化作用相對降低，而使 蛋白得率略有下降， 故選擇料液比為 1:15 為最佳提取條件。 3.1.3 超聲時間對蛋白得率的影響超聲時間對蛋白得率的影響 圖 3 為 pH6，料液比 1:15，溫度 30時不同的超聲時間對熊貓豆蛋白得率的影 響。 圖3可以看出，超聲時間對蛋白質(zhì)得率也有一定影響。隨超聲時間的延長熊貓豆 蛋白得率逐漸增大，當超聲時間為25min時蛋白質(zhì)得率達到最高，隨后蛋白得率又降 低。這可能是由于超聲具有較強的機械切割作用，

32、長時間作用會破壞蛋白質(zhì)，后續(xù)處 理過程中損失增大而影響蛋白得率，考慮到長時間的提取會有條件上的不穩(wěn)定，可能 會使部分蛋白變性影響蛋白質(zhì)提取率，而且超聲時間越長耗能越大，所以選擇25min 為最佳提取條件（范三紅 2010）。 3.1.4 溫度對蛋白得率的影響溫度對蛋白得率的影響 圖圖 3 超聲超聲時間對熊貓豆蛋白得率的影響時間對熊貓豆蛋白得率的影響 Fig.3 Effect of time on extraction yield of panda bean proteins 圖圖 2 料液比對熊貓豆蛋白得率的影響料液比對熊貓豆蛋白得率的影響 Fig. 2 Effect of solid to

33、liquid ratio on extraction yield of panda bean proteins 4 6 8 10 12 14 16 18 1015202530 超聲時間/min 蛋白得率/% 農(nóng)業(yè)與生物技術學院生物科學專業(yè) 2012 屆本科生畢業(yè)論文 12 圖 4 為 pH6，料液比為 1:15，超聲時間為 25min 時不同的溫度對熊貓豆蛋白得率 的影響。 從圖 4 可以看出，溫度對蛋白質(zhì)得率有較大影響。蛋白質(zhì)得率隨超聲溫度升高而 增長較快，當溫度到達 35以上蛋白質(zhì)得率增加緩慢；而且溫度過高不僅影響產(chǎn)品 的功能性，而且黏度增大，分離困難，會給后續(xù)操作帶來不便，且成本費用增加

34、，故 溫度選 35最好（李鳳林 2009）。 3.2 熊熊貓貓豆豆蛋蛋白白提提取取工工藝藝的的優(yōu)優(yōu)化化 3.2.1 熊貓豆中蛋白得率的方差分析熊貓豆中蛋白得率的方差分析 在單因素試驗的基礎上，根據(jù)Box-Behnken的中心組合試驗設計原理（許暉2007） ， 以相關性密切的pH值、料液比、超聲時間和溫度為變量，以蛋白質(zhì)提取效率為響應 值設計了4因素3水平共29個實驗點的響應分析實驗，實驗設計方案與結(jié)果如表1和表2 所示： 表表 1 正交實驗因素與水平表正交實驗因素與水平表 Table 1 experimental factors and level orthogonal table 水平 p

35、H 料液比超聲時間/min溫度/ -151:52030 061:102535 171:153040 圖圖 4 溫度對熊貓豆蛋白得率的影響溫度對熊貓豆蛋白得率的影響 Fig.4 Effect of temperature on extraction yield of panda bean proteins 4 6 8 10 12 14 16 18 2025303540 溫度/ 蛋白得率/% 農(nóng)業(yè)與生物技術學院生物科學專業(yè) 2012 屆本科生畢業(yè)論文 13 表表2響應面試驗結(jié)果響應面試驗結(jié)果 Table 2 The results of response surface 實驗號 pH (A) 料液

36、比 (B) 超聲時間/min (C) 溫度/ (D) 得率/% (Y) 1-1100 8.62 20-10-1 9.62 3100-1 6.27 40000 8.07 50000 9.60 60000 12.60 70-1-10 13.67 80011 12.96 911006.82 10000010.71 111-10011.36 12-100-112.34 1300-1-110.49 1410109.37 1510019.14 160-11010.77 1700007.38 18001-19.36 19-10-105.65 20011014.25 21-100114.14 220-1011

37、7.64 2301-1013.87 2400-1120.07 25-1-1009.58 26010-118.49 27010118.40 2810-1018.47 29-101018.00 將表 2 試驗數(shù)據(jù)采用 Design Expert8.0.5.0 軟件進行多元回歸分析，得到熊貓豆中 蛋白得率（Y）與 pH（A） 、料液比（B） 、超聲時間（C）和溫度（D）之間的函數(shù)關 系為(去掉不顯著項)： Y=16.588+1.520833A+0.525833B+0.458333C+1.063333D+0.2AB+1.655AC- 0.7275AD+0.6875BC+0.675BD-0.9275CD

38、-5.51983A2-2.06733B2-3.67108C2+0.146417D2 式中：A、B、C、D 分別為 pH、料液比、超聲時間、溫度的編碼值。 農(nóng)業(yè)與生物技術學院生物科學專業(yè) 2012 屆本科生畢業(yè)論文 14 為了說明回歸方程的有效性及各因素對熊貓豆中蛋白得率的影響程度，對回歸方 程進行了方差分析，結(jié)果見表 3。 3.2.2 響應面分析響應面分析 表表 3 回歸方程方差分析表回歸方程方差分析表 Table 3 Variance analysis of regression equation 方差來源平方和自由度均方F 值P 值 ProbF 模型334.261423.87572 2.4

39、879280.0497 A-A27.75521127.75521 2.8921840.1111 B-B3.31800813.318008 0.3457470.5659 C-C2.52083312.520833 0.2626790.6163 D-D13.56813113.56813 1.4138440.2542 AB0.1610.160.0166730.8991 AC10.9561110.95611.1416620.3034 AD2.11702512.117025 0.2206010.6458 BC1.89062511.890625 0.1970090.6639 BD1.822511.82250

40、.1899110.6696 CD3.44102513.441025 0.3585660.5589 A2197.63391197.633920.59410.0005 B227.72238127.72238 2.8887640.1113 C287.41742187.41742 9.1091840.0092 D20.13905610.1390560.014490.9059 殘差134.3528149.596625 失擬性72.80408107.280408 0.4731480.8462 純誤差61.54868415.38717 總和468.612828 從表3可以看出，pH和超聲時間的二次項對蛋白得

41、率影響顯著（P0.05） ，其它 因素對蛋白得率的影響不顯著（P0.05） 。此模型的相關系數(shù)R2為0.713，二次回歸方 程整體模型比較顯著（P=0.04970.05） ，并且失擬項不顯著，該回歸模型與實測值 能較好反映熊貓豆中蛋白得率與pH、料液比、超聲時間和溫度之間的關系。在所選 取的各因素水平范圍內(nèi)，按照對結(jié)果的影響排序， ACBD，即pH溫度 料液比超聲時間。 將建立的回歸模型中的任一因素固定在零水平，得到另外兩個因素的交互影響結(jié) 農(nóng)業(yè)與生物技術學院生物科學專業(yè) 2012 屆本科生畢業(yè)論文 15 果，二次回歸方程的響應面如圖5所示。 3.2.3 最佳工藝確定及驗證試驗最佳工藝確定及驗

42、證試驗 圖圖5 5 各兩因素交互作用對熊貓豆蛋白得率的響應面圖各兩因素交互作用對熊貓豆蛋白得率的響應面圖 Fig.5Fig.5 ResponseResponse surfacesurface ofof thethe effectseffects ofof anyany twotwo factorsfactors onon extractionextraction yieldyield ofof pandapanda beanbean proteinsproteins 農(nóng)業(yè)與生物技術學院生物科學專業(yè) 2012 屆本科生畢業(yè)論文 16 通過 Design-Expert8.0.5.0 軟件分析優(yōu)化，

43、可得到超聲波輔助提取熊貓豆蛋白的最 佳提取工藝參數(shù)為：pH6.3，溫度為 39.2，超聲時間 21.7min，料液比為 1:12.1，在 此最佳工藝條件下熊貓豆蛋白理論得率為 20.23%?？紤]到實際試驗的可操作性，將 最佳工藝調(diào)整為 pH6，溫度取 39，超聲時間取 22min，液料比取 1:12，用此最優(yōu)提 取條件進行驗證，重復 3 次取平均值，實際測得熊貓豆蛋白得率為 19.97%，與理論 值較為接近，表明數(shù)學模型對優(yōu)化熊貓豆蛋白提取工藝是可行的。 3.3 熊貓豆水溶性蛋白質(zhì)的功能特性熊貓豆水溶性蛋白質(zhì)的功能特性 3.3.1 熊貓豆蛋白的持水性熊貓豆蛋白的持水性 持水性是蛋白質(zhì)功能性質(zhì)中

44、的一種，是指蛋白制品在一定條件下承受熱加工后保 持水分的能力。 如圖 6 所示，在 NaCl 濃度為 0.2-1mol/L 的范圍內(nèi)，熊貓豆蛋白的持水性隨 NaCl 濃度的增大而增加，這可能是發(fā)生了“鹽溶”現(xiàn)象，使蛋白質(zhì)所帶電荷增多，蛋白質(zhì) 水化能力增強，持水性增加。 在0-5g/100mL的蔗糖質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，熊貓豆蛋白的持水性同樣表現(xiàn)為隨蔗糖質(zhì) 量濃度的增加而增大，這可能是由于蔗糖分子中大量的羥基能吸引、保持水分，從而 增加了熊貓豆蛋白的持水性。 在pH值3-8范圍內(nèi)，熊貓豆蛋白的持水性依次升高，在pH值3（等電點）時的持 圖圖6 離子強度、蔗糖質(zhì)量濃度、離子強度、蔗糖質(zhì)量濃度、pH、溫度

45、對熊貓豆蛋白持水性的影響、溫度對熊貓豆蛋白持水性的影響 Fig.6 Effects of ionic strength, sucrose concentration,pH and temperature on water-holding capacity of panda bean proteins 1.50 1.75 2.00 2.25 2.50 2.75 0.20.40.60.81 NaCl濃度(mol/L) 持水性（g/g） 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 12345 蔗糖濃度（g/100mL） 持水性(g/g) 1.75 2.00 2.25 2.50 2.75 3.00

46、 345678 pH 持水性（g/g） 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 2025303540 溫度（） 持水性（g/g） 農(nóng)業(yè)與生物技術學院生物科學專業(yè) 2012 屆本科生畢業(yè)論文 17 水性最低，pH值8時的持水性最高。可能是因為在等電點附近時，蛋白質(zhì)分子間不存 在靜電斥力，分子間吸引力占上風，其結(jié)果是大部分極性基團參與蛋白-蛋白相互作 用，而無法結(jié)合水。另外，吸引力增強使顆粒分子中分子間結(jié)合更緊密，空孔隙率降 低，不利于水分子向蛋白顆粒內(nèi)部擴散，故持水性最低。隨著pH值變大。蛋白質(zhì)帶 電量增加，相互排斥，蛋白質(zhì)解聚，形成持水的空間網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)，持水性增大（石曉 2006） 。 蛋白質(zhì)的

47、持水性一般隨溫度的升高而降低，在 30時持水性最強。原因可能是 蛋白質(zhì)適度的熱變性有利于其分子的適度伸展，增加了蛋白質(zhì)分子與水的作用程度， 而過高的溫度會使蛋白質(zhì)熱變性程度過大，增加了蛋白質(zhì)分子間的作用，持水性下降 （蔡金星 2007） 。 3.3.2 熊貓豆蛋白的吸油性熊貓豆蛋白的吸油性 蛋白質(zhì)的吸油性在乳制品、面包以及餅干夾心等食品配方及加工中起著非常重要 的作用，吸油性的大小會影響食物中脂類的吸收、加工穩(wěn)定性等性質(zhì)。溫度是影響吸 油性最重要的指標。 如 7 所示，熊貓豆蛋白的吸油性隨著溫度的升高而升高，當溫度達到 40時吸 油性較好。當溫度低于 40時，熊貓豆蛋白吸油性相對較弱，可能在溫

48、度較低時， 油的流動性較弱，與蛋白樣品的吸附能力較弱；當溫度高于 30時，隨著溫度的升 高水溶性蛋白的吸油性迅速增加，這可能是因為隨著溫度的升高，油的粘度降低，流 動性增強，從而蛋白質(zhì)的吸油性增大幅度比較大。（劉鄰渭 2000） 。 3.3.3 熊貓豆蛋白的溶解度熊貓豆蛋白的溶解度 圖圖7 溫度對熊貓豆蛋白吸油性的影響溫度對熊貓豆蛋白吸油性的影響 Fig.7 Effects of temperature on oil-absorbing capability of panda bean proteins 0.5 0.7 0.9 1.1 1.3 1.5 1.7 2025303540 溫度（） 吸

49、油性（g/g） 農(nóng)業(yè)與生物技術學院生物科學專業(yè) 2012 屆本科生畢業(yè)論文 18 蛋白的溶解度直接影響到它在食品工業(yè)中的應用，因為蛋白質(zhì)的水溶性對其在食 品工業(yè)中的穩(wěn)定性、風味等有直接的影響，不溶性蛋白質(zhì)在食品中的應用是非常有限 的。 如圖8所示，在NaCl濃度為0-1.0mol/L的范圍內(nèi)，呈現(xiàn)出“鹽溶”現(xiàn)象，使得鹽 類解離出來的離子同蛋白質(zhì)的解離集團相互作用，降低蛋白質(zhì)分子間的靜電作用力， 水合性增大，因此增加了蛋白質(zhì)的溶解度。 蔗糖對熊貓豆蛋白溶解度的影響表現(xiàn)出與對其持水性的影響不同的變化趨勢，在 0-5g/100mL的蔗糖質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，熊貓豆蛋白的溶解度隨蔗糖含量的增加而出現(xiàn)下 降趨

50、勢，蔗糖質(zhì)量濃度由0增加至5g/100mL，熊貓豆蛋白的溶解度由2.40mg/mL下降 至1.44mg/mL，這可能是由于蔗糖的溶解是一種水合作用，降低了溶液的水分活度， 從而降低了熊貓豆蛋白的溶解度。 熊貓豆蛋白的溶解度隨pH值的增大而增大，在pH值3時溶解度最小，當pH值為8 時，溶解度最大。因為pH值離蛋白質(zhì)的等電點越遠，水化作用越弱，蛋白質(zhì)分子的 分散性越好，溶解度越大（吳曉紅 2010） 。 溫度對熊貓豆蛋白溶解度的影響，隨溫度升高溶解度增大，至30時達最大值， 之后隨著溫度的繼續(xù)升高，溶解度下降，這可能是由于適當?shù)纳郎乜墒沟鞍踪|(zhì)分子的 立體結(jié)構(gòu)伸展和解離，有利于蛋白質(zhì)分子和水分子的

51、相互作用，能增加蛋白質(zhì)的溶解 度，而溫度高于30時，會引起熊貓豆蛋白的熱變性，蛋白質(zhì)分子發(fā)生聚集與沉淀， 圖圖8 離子強度、蔗糖質(zhì)量濃度、離子強度、蔗糖質(zhì)量濃度、pH、溫度對熊貓豆蛋白溶解度的影響、溫度對熊貓豆蛋白溶解度的影響 Fig.8 Effects of ionic strength, sucrose concentration,pH and temperature on solubility of panda bean proteins 2.5 3.5 4.5 5.5 6.5 0.20.40.60.81 NaCl濃度（mol/L） 溶解度（mg/mL） 0.5 1.0 1.5 2.0

52、2.5 3.0 12345 蔗糖濃度（g/100mL） 溶解度（mg/mL） 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 345678 pH 溶解度（mg/mL） 0.50 0.75 1.00 1.25 1.50 2025303540 溫度（） 溶解度（mg/mL） 農(nóng)業(yè)與生物技術學院生物科學專業(yè) 2012 屆本科生畢業(yè)論文 19 從而降低蛋白的表面積和極性氨基酸對水結(jié)合的有效性，溶解度下降。 3.3.4 熊貓豆蛋白的乳化性及乳化穩(wěn)定性熊貓豆蛋白的乳化性及乳化穩(wěn)定性 由圖 9 可以看出，熊貓豆蛋白的乳化性和乳化穩(wěn)定性隨離子強度的變化趨勢與溶 解度曲線一致，這是由于蛋白質(zhì)的乳化性及其穩(wěn)定性與蛋白質(zhì)的

53、溶解度呈正相關，當 遠離熊貓豆蛋白等電點以及由于“鹽溶”作用的影響，蛋白質(zhì)溶解度較強，蛋白質(zhì)之 間的排斥力增強，油滴更容易吸附在蛋白質(zhì)界面上。 蔗糖能夠增加熊貓豆蛋白的乳化性和乳化穩(wěn)定性，隨著蔗糖質(zhì)量濃度的增大，熊 貓豆蛋白的乳化性和乳化穩(wěn)定性均提高了，這可能是因為蛋白質(zhì)是通過在油滴界面形 成一層薄膜產(chǎn)生立體阻礙效應而穩(wěn)定乳狀液，蔗糖的添加改變了水相介質(zhì)的流變特性， 提高了體系的黏稠度，并且和蛋白質(zhì)發(fā)生了交互作用而使乳狀液穩(wěn)定。 在等電點附近，熊貓豆蛋白的乳化性及乳化穩(wěn)定性較差，這是因為等電點附近， 蛋白質(zhì)發(fā)生絮凝，溶解度最小，而偏離等電點環(huán)境中，蛋白質(zhì)之間的排斥力增強，油 滴更容易吸附在蛋白

54、質(zhì)界面上。這說明蛋白質(zhì)乳化性及乳化穩(wěn)定性與蛋白溶解度有密 切關系，都是由于蛋白分子表面結(jié)構(gòu)和所帶電荷決定的（曾衛(wèi)國 2005） 。 熊貓豆蛋白的乳化性隨溫度的變化趨勢與其溶解度曲線吻合，這證明可溶性是蛋 白質(zhì)具有乳化性質(zhì)的先決條件，蛋白質(zhì)只有具有一定的溶解度，才能有效地向油-水 界面擴散。隨溫度升高，熊貓豆蛋白的乳化性和乳化穩(wěn)定性呈現(xiàn)先上升后降低的趨勢， 圖圖9 離子強度、蔗糖質(zhì)量濃度、離子強度、蔗糖質(zhì)量濃度、pH、溫度對熊貓豆蛋白乳化性及乳化穩(wěn)定性的影響、溫度對熊貓豆蛋白乳化性及乳化穩(wěn)定性的影響 Fig.9 Effects of ionic strength, sucrose concent

55、ration, pH and temperature on emulsifying of panda bean proteins 乳化穩(wěn)定性/%乳化穩(wěn)定性/% 乳化穩(wěn)定性/%乳化穩(wěn)定性/% 2 3 4 5 6 7 8 9 10 0.20.40.60.81 NaCl濃度（mol/L） 乳化性/% 20 30 40 50 60 70 80 90 100 EC ES 2 3 4 5 6 7 8 9 10 12345 蔗糖濃度（g/100mL） 乳化性/% 20 30 40 50 60 70 80 90 100 EC ES 2 3 4 5 6 7 8 9 10 345678 pH 乳化性/% 20 3

56、0 40 50 60 70 80 90 100 EC ES 2 4 6 8 10 2025303540 溫度（） 乳化性/% 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 EC ES 農(nóng)業(yè)與生物技術學院生物科學專業(yè) 2012 屆本科生畢業(yè)論文 20 在 30表現(xiàn)出最大的乳化性和乳化穩(wěn)定性，分別達 8.39%和 94.82%，這是由于適度 的加熱處理使蛋白質(zhì)分子伸展、溶解度增加，蛋白質(zhì)之間的排斥力減小，油滴容易吸 附在蛋白質(zhì)界面上，促進了蛋白的乳化能力；而過高的溫度會降低吸附在界面上的蛋 白質(zhì)膜的黏度和硬度，因而乳化性和乳化穩(wěn)定性會降低（張根生 2006） 。 4 結(jié)論結(jié)論 本實驗采用超聲波輔助提取的方法對熊貓豆中水溶性蛋白進行提取，pH，料液 比，超聲時間，溫度對熊貓豆水溶性蛋白得率有較大的影響。確定了最佳提取工藝條 件為：pH 6，料液比 1:12，超聲時間 22min，溫度 39。在此條件下熊貓豆水溶蛋白 得率最大為 1