（精選文檔）EGFP原核表達(dá)分析

1、EGFP的原核表達(dá)分析首都師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 100048摘要：利用PCR反應(yīng)擴(kuò)增出所需要的EGFP基因，與pTrc His蛋白表達(dá)載體重組，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21,提取質(zhì)粒，誘導(dǎo)EGFP蛋白表達(dá)，進(jìn)行進(jìn)一步的分離純化并用SDS-PAGE和Western-blot做檢測。這個實(shí)驗(yàn)讓我們充分熟悉了整個流程。關(guān)鍵詞：綠色熒光蛋白 蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)、分離純化 表達(dá)蛋白檢測 E.coli 材料和方法：1、主要材料及儀器1.1、菌株和質(zhì)粒：大腸桿菌BL21為本實(shí)驗(yàn)室保存；重組篩選質(zhì)粒pTrcHis購自Invitroge公司。1.2、培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基（液/固）內(nèi)含氨芐青霉素濃度為100 ug/ml。1.3

2、、器材和試劑器材：移液槍、PCR儀、離心機(jī)（HetticZENTRIFUGEN D-78532 Tuttlingen）、SIGMA2-16K(4離心機(jī))、SIGMA 3-18K(離50ml大離心管)、紫外透射觀察儀、水浴鍋、核酸電泳儀（BIO-RAD）、超聲波破碎儀（SONICSVIbra cell）、氣浴恒溫振蕩器（THZ-82江蘇金壇市金城國勝實(shí)驗(yàn)儀器廠）、SDS-PAGE電泳裝置、Western Blotting電轉(zhuǎn)移裝置、水平搖床（WD-9405）、膠片觀察燈（WD-9406）、封口機(jī)、超凈臺、250ml錐形瓶。試劑：PCR反應(yīng)體系緩沖液（1050 mM Tris-HCl，50 mM

3、KCl，1.5 mM MgCl2）、DNA聚合酶（Taq E）、dNTPs混合物（每種2.5mM）、博大泰克PCR產(chǎn)物快速回收試劑盒、限制性核酸內(nèi)切酶（BglII、EcoRI）、0.5M EDTA、瓊脂糖凝膠（1g瓊脂糖、100ml1xTAE、10ulEB）、電泳緩沖液（50 x TAE、Tris乙酸、EDTA）、溴酚蘭、蔗糖、甘油、連接酶（購于Promega公司的T4DNA連接酶及10ligation buffer）、0.1MCaCl2、堿裂解液（溶液I：50mM葡萄糖、25mM Tris-HCl，pH=8.0、10mM EDTA；溶液II：0.2 M NaOH，1SDS；溶液III：5 M

4、 KAc，11.5 ml冰醋酸，加水定容至100ml）、RNaseA、無水乙醇、PBS緩沖液、裂解緩沖液（含20mM咪唑）、沖洗液（含100mM咪唑）、洗脫液（含500mM咪唑）、5樣品緩沖液、30%凝膠貯液、4分離膠緩沖液、4濃縮膠緩沖液（4保存）、TEMED原液、10%過硫酸銨、Tris-甘氨酸電極緩沖液（pH=8.3）、考馬斯亮藍(lán)G250染色液、GFP抗體（200ug/ml，用pH=7.5 TBS配置)、轉(zhuǎn)移緩沖液、TBS、封閉液（5%脫脂奶粉）、顯色液（氯萘酚，30mg/ml于甲醇中）、ddH2O、脫色液（100 ml 冰乙酸:100 ml乙醇:800 ml蒸餾水）2、方法21、EGF

5、P基因的PCR擴(kuò)增及其電泳檢測在一滅菌的0.2mL小離心管中依次加入(總體積為50ml)：10buffer(Mg2+) 5ml4dNTPs （每種2.5mM ） 8mlEGFP-F 1mlEGFP-R 1ml Template(模板) 34ml Taq E 1ml-Total volume 50l循環(huán)參數(shù)94 3min94 30s55 30s 27cycle72 1min72 10min4 保存2.2、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的回收 試劑盒法1)、 柱平衡：向吸附柱CB2中（吸附柱放入收集管中）加入500ml的平衡液BL，12000rpm離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CB2重新放回收集管中。2

6、)、上樣：估計(jì)PCR反應(yīng)液，向其中加入5倍體積的結(jié)合液PB，充分混勻, 然后移入吸附柱CB2中（吸附柱放入收集管中），室溫放置2分鐘，12000rpm離心3060秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CB2放入收集管中。3)、 漂洗：向吸附柱CB2中加入600ml漂洗液PW（使用前先檢查是否已加入無水乙醇），靜止2min后，12,000rpm離心30-60秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CB2放入收集管中。4)、 漂洗：重復(fù)步驟3 。5)、 甩干：將吸附柱CB2放回收集管中，12000rpm，離心2分鐘，盡量除去漂洗液。將吸附柱CB2開蓋置于室溫放置數(shù)分鐘，徹底地晾干，以防止殘留的漂洗液影響下一步的

7、實(shí)驗(yàn)。 6)、 洗脫：將吸附柱CB2放入一個干凈的離心管中，向吸附膜中間位置懸空滴加3050ml洗脫緩沖液EB，室溫放置2分鐘。12000rpm離心2分鐘收集DNA溶液。2.3、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳檢測 PCR產(chǎn)物 6ml 6x樣品緩沖液 1ml混勻后加入樣品孔中，100V電泳20-30 min2.4、酶切產(chǎn)物的回收 試劑盒法方法同PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的回收2.5、體外重組按以下比例加入試劑： 10 ligation buffer 2 l 載體 3l PCR片段 14 l T4 DNA Ligase 1l-Total volume 20l16過夜。注意：最后加入載體，放入16的鍋中水浴時要注意把板子

8、拿起來插，以免進(jìn)水。2.6、制備感受態(tài)細(xì)胞1）、劃線復(fù)壯宿主菌37過夜。2）、挑一個單菌落于30ml LB液體培養(yǎng)基中，37、200rpm至OD600=0.20.4。3）、培養(yǎng)液分裝到預(yù)冷的無菌1.5ml Ep管中，于冰上放置510min, 離心4，5000rpm, 離心5min。4）、棄上清，吸干殘存培養(yǎng)液，加1.0ml預(yù)冷的CaCl2溶液重懸菌體，冰上放置1530min，4，5000rpm，離心5min。5）、重復(fù)步驟4。6）、加100ml冰預(yù)冷的CaCl2溶液重懸菌體，放置4 用于轉(zhuǎn)化。2.7、重組DNA轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞1）、加10ml連接產(chǎn)物到100ml感受態(tài)細(xì)胞中，輕懸以混合內(nèi)含物，置

9、于冰上30min。2）、42 熱休克90秒，不要搖動試管，置冰上12min。3)、加400ml液體培養(yǎng)基，37 150rpm 搖4560min。4)、微波爐融化LB固體培養(yǎng)基，待冷卻至50 左右時，加入相應(yīng)的抗生素，搖勻，倒平板，每板20ml左右。室溫凝固。5)、轉(zhuǎn)化產(chǎn)物用無菌涂板器涂勻。6)、37 倒置培養(yǎng)過夜。2.8、重組質(zhì)粒的提取試劑盒法1）、在含有抗生素的LB培養(yǎng)基中接種一單菌落，37，150rpm搖培過夜。2）、柱平衡步驟：向吸附柱cp3中（吸附柱放在收集管中）加入500ml的平衡液BL。12000rpm離心1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。（請用當(dāng)天處理的柱子

10、）3）、取1.5ml過夜培養(yǎng)的菌液，加入離心管中，使用常規(guī)臺式離心12000rpm離心1min盡量吸除上清（菌液多時可以通過多次離心將菌體沉淀到一個離心管中）。4）、向留有菌體沉淀的離心管中加入250ml的溶液p1（檢查是否已加入RNaseA），使用移液器或者渦旋振蕩器徹底懸浮細(xì)菌沉淀。 注意：如果有未徹底混勻的菌塊，會影響裂解，導(dǎo)致提取量和純度偏低。5）、向離心管中加入250ml溶液p2，溫和上下翻轉(zhuǎn)6-8次使菌體充分裂解。 注意：溫和地混合，不要劇烈震蕩，以免打斷基因組DNA，造成提取的質(zhì)粒中混有基因組DNA片段。此時菌液應(yīng)清亮粘稠，所用時間不超過5分鐘。如果未變清亮，可能是菌體太多，裂解

11、不徹底，應(yīng)減少菌體量。6）、向離心管中加入350ml溶液p3，立即溫和上下翻轉(zhuǎn)6-8次，充分混勻，此時將會出現(xiàn)白色絮狀沉淀。12000rpm離心10min，此時在底部形成沉淀。 注意：p3加入后應(yīng)立即混合，避免產(chǎn)生局部沉淀。如果上清中還有微 小白色沉淀，可以離心后取上清。7）、將上一步收集的上清液用移液器轉(zhuǎn)移到cp3中（吸附柱放入收集管中），不能吸出沉淀。12000rpm離心30-60s，倒廢液，將吸附柱cp3放入收集管中。8）、可選步驟：向吸附柱cp3中加入500ul去蛋白溶液pd，12000離心30-60s，倒廢液，將吸附柱cp3重新放回收集管中。如果宿主菌是endA+菌(TG1,BL21

12、,HB101,JM系列，ET12567等)，因?yàn)橛泻怂崦?，推薦采用此步驟。若不是，可省略。9）、向吸附柱cp3中加入600ul的pw（用前加入無水乙醇），12000rpm離心30-60s，倒廢液，將cp3放回。10）、重復(fù)步驟9。11）、將吸附柱cp3放入收集管中，12000rpm離心2min,除去殘余漂洗液。 注意：此步非常重要，建議cp3開蓋放置數(shù)分鐘，以徹底晾干。12）、將吸附柱cp3置于一個干凈離心管中，向其中間滴加40ml的洗脫緩沖液EB，室溫放置2min，12000rpm離心1min,將質(zhì)粒溶液收集到離心管中。2.9、大腸桿菌中重組蛋白的表達(dá)和純化（a）蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)1）、挑取含重

13、組質(zhì)粒的單菌落，接種于含Amp抗生素的培養(yǎng)基中（終濃度100 mg/ml)，37振蕩培養(yǎng)過夜。2）、次日以5量接種，37 培養(yǎng)至OD0.6時,加入IPTG （終濃度為1mM），37誘導(dǎo)表達(dá)23h.3）、收集細(xì)菌（每組20ml)，5000rpm離心10min，20保存。（b）大腸桿菌細(xì)胞的破碎1）、收集細(xì)菌（每組20ml)，5000rpm離心10min。2）、取出保存的細(xì)菌，加入1ml裂解緩沖液，充分混勻后再加入溶菌酶, 使得終濃度為1 mg/ml, 放置冰浴中3060min充分酶解。3）、冰上用超聲波（200300W）破碎細(xì)胞，每次10秒，間歇10秒，共做6次。4）、11000 rpm 4離心

14、1520min，收集上清液。5）、取20ml上清液，-20暫存，準(zhǔn)備進(jìn)一步做SDS-PAGE分析。其余上清液做下一步親和純化。（c）融合蛋白的親和層析1）、結(jié)合：1ml裂解液加入50ml Ni-NTA填料用渦旋振蕩器（200rpm）混合均勻，4，60分鐘。2）、裝柱：將上述混合液裝入準(zhǔn)備好的層析柱，打開層析柱出口，讓液體自然流過。3）、沖洗：待液體流盡以后，自層析柱頂部徐徐加入1ml沖洗液，讓液體自然流盡。重復(fù)此步驟1次。4）、洗脫：自層析柱頂部緩慢加入0.1ml洗脫液，收集流過的液體，即獲得洗脫的蛋白。重復(fù)此步驟1次，每次分別收集蛋白洗脫液。（d）SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳1）、將玻璃板、樣品

15、梳、Spacer用洗滌劑洗凈，用ddH2O沖洗數(shù)次，再用乙醇擦拭，晾干；2）、制膠架3）、檢查凝膠板是否滲漏4）、制膠(1)、按如下體積配制10分離膠8 ml，混勻；ddH2O 3.4 ml4X分離膠緩沖液 2.0 ml30% Acr-Bis 2.6 ml 10%AP 50 ml TEMED 5 ml(2)、向玻璃板間灌制分離膠，立即覆一層重蒸水，大約20 min后膠即可聚合；(3)、按如下體積配制6濃縮膠4.0 ml，混勻；ddH2O 4X濃縮膠緩沖液 30% Acr-Bis 10% AP TEMED2.3 ml 1ml 700 ml 50 ml 5 ml(4)、將上層重蒸水傾去，濾紙吸干，

16、灌制濃縮膠，插入樣品梳；注意：操作時要帶手套，灌膠時不能有氣泡，以免電泳時影響電流通過。（e）Western Blot1）、濾紙和硝酸纖維素薄膜的準(zhǔn)備切4張濾紙和1張硝酸纖維素濾膜(避免用手直接接觸濾膜，需帶手套操作)，其大小都應(yīng)與凝膠大小吻合，放入淺盤中，并加入轉(zhuǎn)移緩沖液使其浸泡15-20min。2)、凝膠-硝酸纖維素薄膜 “三明治”的制作（1）、打開轉(zhuǎn)移盒并放置在淺盤中，用轉(zhuǎn)移緩沖液將海綿墊完全浸透，海綿的上面放置2張用轉(zhuǎn)移緩沖液浸泡過的濾紙；(2)、小心將凝膠用去離子水略為漂洗一下，然后放在濾紙上，要保證精確對齊，避免氣泡；(3)、以轉(zhuǎn)移緩沖液潤濕膠面，小心將硝酸纖維素薄膜準(zhǔn)確平放于凝膠

17、上。從凝膠一邊開始輕輕放下，可避免氣泡；（4）、在硝酸纖維素薄膜上放2張潤濕的濾紙，用一玻璃移液管作滾筒輕輕滾過凝膠-硝酸纖維素薄膜 “三明治”以擠出所有氣泡。（5）將另一塊海綿墊用轉(zhuǎn)移緩沖液完全浸透后，放在凝膠-膜 “三明治”上， 關(guān)上轉(zhuǎn)移盒并插入轉(zhuǎn)移池。以上各步接觸凝膠和薄膜時，均需帶手套。轉(zhuǎn)移緩沖液最好預(yù)冷，并且在轉(zhuǎn)移槽的冰盒中放入冰避免轉(zhuǎn)移過程中產(chǎn)生大量的熱。3)、電轉(zhuǎn)移：倒?jié)M轉(zhuǎn)移緩沖液，穩(wěn)壓100V轉(zhuǎn)移1h。 （f）免疫檢測1）、封閉：關(guān)閉電源，拆下轉(zhuǎn)移裝置，用鑷子把硝酸纖維素薄膜放入可加熱封口的塑料袋中，根據(jù)濾膜面積以0.1 m1cm2的量加入封閉液（約8ml），盡可能排除里面的氣

18、泡，然后密封袋口，平放在平緩搖動的搖床上于室溫溫育3060min。應(yīng)保證薄膜與封閉液充分接觸。2)、洗膜：倒掉封閉液，用TBS洗膜三次。3)、加入抗體：將封閉過的硝酸纖維素薄膜放入另一個塑料袋中，按薄膜面積0.1 mlcm2 (約8ml) 加入稀釋的EGFP抗體，小心除去氣泡，密封袋口，平放在搖床上室溫溫育1 h或過夜。4)、洗膜：將薄膜轉(zhuǎn)移至盛有TBS的培養(yǎng)皿中，于室溫平緩搖動，漂洗56min，重復(fù)2次。 5)、顯色：將薄膜轉(zhuǎn)移至盛有顯色液的培養(yǎng)皿中，細(xì)心觀察反應(yīng)過程。一旦蛋白帶的顏色達(dá)到要求(5-30min)，即取出濾膜，用去離子水漂洗3次，每次10min。將薄膜用吸水紙吸干水分，記錄條帶

19、位置，拍攝照片，留作永久實(shí)驗(yàn)記錄。拍攝應(yīng)在一周內(nèi)進(jìn)行，因?yàn)殡S著時間推移，條帶會變淺，薄膜會變黃。結(jié)果：GFP 基因的PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果如圖所示：最左邊和最右邊的條帶均為marker，中間分別為不同組GFP 基因的PCR產(chǎn)物的電泳條帶，有三組條帶出現(xiàn)異常，其余條帶均為720bpGFP基因條帶。擴(kuò)增出少量目的基因，說明試劑、儀器沒有問題，可能操作有問題。而GFP基因條帶周圍的微弱條帶是由于pcr中基因的非特異性擴(kuò)增。重組菌的陽性篩選如圖所示：圖中陽性對照中培養(yǎng)基長滿菌，實(shí)驗(yàn)組中長了一部分菌，陰性對照組中沒有菌。加有氨芐青霉素的培養(yǎng)基能對具抗氨芐青霉素抗性進(jìn)行篩選。陽性對照組中接種腭轉(zhuǎn)化的大腸桿菌

20、細(xì)胞都具有抗性，故能長滿菌；實(shí)驗(yàn)組中接種的一部分大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)含有外源質(zhì)粒因此具有抗性，一部分大腸桿菌內(nèi)不含外源質(zhì)粒不具抗性，故實(shí)驗(yàn)組只長了少量的菌落，陰性對照組中接種的細(xì)胞不具抗性，故在培養(yǎng)基中不能生長。陽性轉(zhuǎn)化菌落的鑒定如圖所示：2.3.2重組蛋白的親和純化及SDS-PAGE檢測構(gòu)建表達(dá)載體時，在GFP的N端引入6個組氨酸標(biāo)簽。親和層析柱的NTA填料有4個金屬螯合位點(diǎn)，能牢固螯合Ni2+，而Ni2+有兩個開放的互補(bǔ)位點(diǎn)可與組氨酸結(jié)合。當(dāng)組氨酸與Ni2+結(jié)合后，使得帶有His6標(biāo)記的蛋白質(zhì)就受到阻滯，掛在層析柱上。利用咪唑與目的蛋白競爭金屬離子結(jié)合位點(diǎn)的特性，通過提高洗脫液中咪唑的濃度，與H

21、is6標(biāo)記蛋白競爭Ni2+結(jié)合位點(diǎn)，從而將組氨酸標(biāo)記蛋白洗脫下來。利用此原理純化目的蛋白EGFP。SDS-PAGE電泳檢測結(jié)果如下圖：以上是我們第二組同學(xué)SDS跑膠出來的結(jié)果圖，效果并不是很好，主要原因是剛開始的時候電壓稍微大了一點(diǎn)，泳動速度太快了，沒有達(dá)到很好的分離效果，我們下面再粘一張一組同學(xué)的結(jié)果，比我們的要好很多：然后是western的結(jié)果圖，我們組的在洗脫脂牛奶的時候沒有洗干凈，再加上之前跑膠結(jié)果不是很理想，所以條帶特別淺，出現(xiàn)的時間也特別慢，我們借用一組同學(xué)的結(jié)果：下面是單獨(dú)一條帶（顏色比較淺）：重組蛋白的Western Blotting檢測實(shí)驗(yàn)利用重組表達(dá)的GFP蛋白與源于小鼠的GFP抗體結(jié)合（融合蛋白上具有抗X press抗體結(jié)合序列，可供免疫學(xué)方法檢測），抗體上經(jīng)辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記，其能與底物氯萘酚反應(yīng)生成藍(lán)粉色物質(zhì)。但如圖所示最后Western Bl